烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是人体内一种内源性物质，它参与细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，细胞能量转化的重要辅酶]的合成[1]，研究[2]发现人体的衰老过程伴随着体内NAD+含量的减少，作为人体NAD+合成的有效补救途径，服用NMN可以延缓细胞衰老的过程、从而实现抗衰老的效果。NMN作为新一代的抗衰老因子[3]，市场上相继出现了相关的保健品、化妆品和加工食品等，其工业合成和产品开发过程中对于原料中NMN含量和杂质控制要求严格，在未来的实际生产中，一种高效的NMN含量检测方法对其质量控制具有重要意义。目前NMN的检测方法主要有定量核磁共振法[3]和液质联用法[4]，但食品样品的基质与组成相当的复杂，在液质实际分析中存在很严重的基质效应[5-6]，改善前处理方法纯化样品是最有效、最彻底消除基质效应的方法[7]。
固相萃取(solid-phase extraction,SPE)是目前最常用的样品前处理方法之一[8]，但常规的固相萃取吸附剂主要依靠非特异性作用力吸附目标物，对复杂样品很难进行净化和富集。近年来，分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)因其预定性、实用性以及识别性等优点[9-13]而被广泛地应用到固相萃取领域[14-18]。以MIPs作为固相萃取的填料，制备分子印迹固相萃取(molecularly imprinted solid-phase extraction，MISPE)柱，该柱对模板分子有特异性识别能力，非常适合分离富集复杂样品中痕量分析物，提高仪器的灵敏度和准确度[19-22]。
目前，尚未发现有关NMN MIPs的相关研究。本实验以NMN为模板分子，α-甲基丙烯酸(methylacrylic acid，MAA)为功能单体，采用沉淀聚合法制备NMN MIPs微球，测定其吸附性和选择性，并利用MIPs对西兰花中的NMN进行固相萃取研究，实现了NMN的分离富集，为复杂样品中NMN的分析测定提供了新的样品前处理技术。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
NMN标准品，上海源叶生物科技有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate，EDGMA)，深圳市丽晶生化科技有限公司；MAA，天津市福晨化学试剂厂；偶氮二异丁腈(2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN)，成都市科龙化工试剂厂；N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，天津市科密欧化学试剂有限公司；实验试剂均为分析纯。
SPD-16高效液相色谱仪，日本岛津公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海博讯实业有限公司；高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司。
1.2 NMN MIPs的制备
取0.4 mmol NMN，溶于一定的溶剂中，然后加入0.8 mmol MAA，5 ℃下预聚合10 h，然后加入4 mmol N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和50 mg AIBN，除氧、密封，60 ℃下反应7 h。聚合完成后，离心，弃上清液，得白色印迹聚合物。水洗去除未反应的NMN、MAA和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺等，然后用甲醇乙酸(体积比9∶1)作为脱模液，去除印迹聚合物中的NMN，再用甲醇洗去残留的乙酸，真空干燥，得NMN MIPs。
非印迹聚合物(non-imprinted polymers，NIPs)的合成方法与MIPs合成方法一致，只是在合成时不加入NMN。
1.3 MIPs的吸附性能
1.3.1 标准曲线的绘制
以乙腈水为溶剂，配制质量浓度为3.125～100 μg/mL的NMN标准溶液，用HPLC仪测定不同浓度下NMN溶液的峰面积，平行测定3次，取平均值。从峰面积(F)-浓度(c)曲线图得到F-c关系式：F=7 810 934 129.353 2c-26 205.442 8，R2=0.997 4。
HPLC测定条件[4]：岛津Essentia LC-16色谱柱；紫外检测波长为261 nm；流动相A为2 mmol/L醋酸铵甲醇溶液、B为0.1%乙酸水溶液；泵的总流速=1 mL/min、泵A∶泵B=1∶4；柱温箱温度为室温。
1.3.2 静态等温吸附
准确称取2 mg MIPs和NIPs，加入2 mL不同浓度的NMN标准溶液，恒温振荡4 h，离心，上清液过0.45 μm滤膜，用HPLC测定其浓度，并绘制吸附等温线。吸附量(Q)的计算如公式(1)所示：
(1)
式中：Q为MIPs(或NIPs)对NMN的吸附量,mg/g；c0为溶液中NMN的初始质量浓度,mg/mL；ce为吸附平衡时NMN的质量浓度,mg/mL；V为NMN溶液的体积,mL；m为MIPs(或NIPs)的质量,g。
1.3.3 吸附动力学
分别称取2 mg MIPs和NIPs，加入2 mL 100 μg/mL的NMN标准溶液，恒温振荡不同时间，离心，上清液过0.45 μm滤膜，用HPLC测定其浓度。采用准一级动力学方程和准二级动力学方程研究MIPs对NMN的吸附速率和吸附机理，准一级动力学方程和准二级动力学方程如公式(2)、公式(3)所示：
ln(Qe-Qt)=lnQe-k1t
(2)
(3)
式中：Qe为MIPs(或NIPs)平衡时的吸附量,mg/g；Qt为测量时间为t时MIPs(或NIPs)的吸附量,mg/g；t为吸附时间,min；k1为一级动力学常数；k2为二级动力学常数。
1.3.4 选择性吸附
准确称取2 mg MIPs，加入2 mL一定浓度的NMN、烟酰胺、腺苷酸标准溶液，恒温振荡4 h，离心，上清液用0.45 μm滤头过滤，用HPLC测定其浓度。3种被测物结构如图1所示。
A-NMN;B-烟酰胺；C-腺苷酸
图1 NMN、烟酰胺和腺苷酸结构
Fig.1 The structure of NMN,nicotinamide and adenylate
印迹因子(imprinting factor，IF)、分离因子(α)和相对分离因子(β)的计算公式如公式(4)～公式(6)所示。IF值越大，说明制备的MIPs的印迹效果越好；α值越大说明印迹材料对NMN的选择和识别能力越强；β值越大说明与NIPs相比，MIPs对印迹分子NMN的特异性吸附能力越强。
(4)
(5)
(6)
式中：Qi为MIPs(或NIPs)对NMN的吸附量，mg/g；Qj为MIPs(或NIPs)对NMN结构类似物(腺苷酸、烟酰胺)的吸附量，mg/g；αM表明相比于NMN结构类似物，MIPs对NMN的吸附效果；αN表明相比于NMN结构类似物，NIPs对NMN的吸附效果。
1.4 MISPE
用MIPs作填充材料制备MISPE柱。准确称取一定质量的MIPs，装入1 mL的固相萃取柱(Agilent)中，用筛板压严实。用乙腈水对MISPE柱进行活化，然后加入一定体积的西兰花提取液吸附一定时间后，进行淋洗和洗脱，分别收集上样液和洗脱液，进行HPLC分析。
2 结果与分析
2.1 MIPs制备条件的优化
2.1.1 溶剂的用量
模板分子NMN与功能单体MAA的预聚合是利用氢键作用力，制备的MIPs属于非共价型，反应溶剂对氢键作用力以及MIPs的形态影响较大，且具有致孔作用。所用溶剂不仅要对NMN有较高的溶解度，还要能够促进NMN与MAA之间氢键的形成。NMN属于水溶性物质，在水中有较好的溶解度，且MAA和交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺在水中也有较好的溶解度，故选择水作为溶剂。但考虑到水会对氢键产生破坏，影响选择性空穴的形成，故采用混合溶剂，考虑到N,N′-亚甲基双丙烯酰胺在乙腈中也有较好的溶解度，且乙腈的极性与介电常数均低于水、对氢键的形成影响较小，乙腈与水可无限互溶，故溶剂选择乙腈水。此外，在MIPs的制备过程中，溶剂的用量也十分关键，当溶剂的量太少时，反应物黏度大、反应更趋向于本体聚合；当溶剂的量太大时，则无法形成微球沉淀。因此，溶剂的配比和用量至关重要，需对其进行优化。固定水的体积为3 mL，使得水与乙腈的体积比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4。结果如图2所示，当溶剂量为12 mL(即水3 mL，乙腈9 mL，水与乙腈的体积比为1∶3)时，MIPs吸附效果最好，可达到23.95 mg/g。
图2 溶剂用量的优化
Fig.2 Optimization of solvent usage
2.1.2 模板分子、功能单体和交联剂的用量
沉淀聚合法制备NMN MIPs主要分为2个阶段：首先，在一定溶剂中，NMN与MAA通过氢键作用形成预聚体；然后AIBN分解产生自由基引发聚合，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺使预聚体形成高度交联、刚性的聚合物。因此，NMN、MAA和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的用量在MIPs的制备过程中至关重要。故对每个变量设置3个水平，研究其对MIPs吸附性能的影响。正交分析见表1，方差分析见表2。MIPs制备过程中影响聚合物吸附性能的各因素主次为B(功能单体MAA)>A(模板分子NMN)>C(交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺)，说明在MIPs的制备过程中MAA的用量对MIPs的吸附性能影响最大，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的用量对其影响最小。根据各主次因素的最高水平，得出的最优MIPs的制备方案为A2B2C2，即模板分子NMN的用量为0.04 mmol、功能单体MAA的用量为0.08 mmol、交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的用量为0.4 mmol(其摩尔比为1∶2∶10)为最优制备MIPs的条件组合。
表1 正交实验优化结果
Table 1 Orthogonal experiment optimization results
实验号A模板分子/mmolB功能单体/mmolC交联剂/mmolIF11(0.02)1(0.04)1(0.2)1.06212(0.08)2(0.4)1.29313(0.16)3(0.8)1.0242(0.04)121.3352231.4162311.2173(0.08)131.3383211.3793321.21k11.1231.241.213/k21.3171.3571.277/k31.3031.1471.253/极差R0.1940.210.064/因素主次B>A>C最优方案A2B2C2
表2 正交实验方差分析
Table 2 Orthogonal experiment analysis of variance
方差来源偏差平方和自由度F比A模板分子0.070211.667B功能单体0.066211.000C交联剂0.00621.000误差0.012/
2.2 聚合物吸附性能
2.2.1 静态吸附等温线
为考察聚合物对NMN的平衡吸附能力，绘制吸附量(Q)随NMN浓度(c)的变化曲线，结果如图3所示，在10～70 μg/mL，MIPs和NIPs的吸附量均随着NMN浓度的增大而增大；而在70 μg/mL以后，曲线逐渐趋于平稳。MIPs的整体吸附量均要大于NIPs，表明MIPs的吸附性能显著强于NIPs。
图3 MIPs和NIPs对NMN的静态吸附等温线
Fig.3 Static adsorption isotherms of MIPs and NIPs to NMN
2.2.2 吸附动力学
对NMN MIPs和NIPs进行动力学测试，绘制吸附量(Q)随吸附时间(t)的变化曲线，结果如图4所示。在0～60 min，MIPs与NIPs曲线均呈上升趋势，在60 min左右达到平衡；并且 MIPs的吸附量明显高于NIPs。这是因为MIPs的“空穴”被NMN成功印迹，随着吸附时间的增加，MIPs中的空穴逐渐被NMN填充，空间位阻增大、吸附速率降低，最终达到动态平衡。而NIPs没有特定的印迹空穴，所以只能依靠聚合物表面的非特异性吸附作用进行少量的吸附。
图4 MIPs、NIPs的动态吸附曲线
Fig.4 Dynamic adsorption curves of MIPs and NIPs
为了进一步探究MIPs和NIPs吸附过程的动力学机理，采取准一级动力学模型和准二级动力学模型进行拟合。准一级动力学方程和准二级动力学方程的拟合结果见表3，MIPs、NIPs的准二级动力学方程的拟合结果相关系数R2(0.983 5、0.984 8)均比准一级动力学方程的R2(0.929 8、0.939 7)更接近1，说明MIPs、NIPs对NMN的吸附过程更符合准二级动力学方程。
表3 动力学方程拟合参数
Table 3 Kinetic equation fitting parameters
聚合物准一级准二级k1/min-1Qe/(mg·g-1)R2k2/[g·(mg·min)-1]Qe/(mg·g-1)R2MIPs0.0357562.080.92989.149×10-468.120.9835NIPs0.0355147.640.93971.153×10-352.490.9848
2.2.3 选择性吸附
选取与NMN结构类似的腺苷酸和烟酰胺作为底物进行选择性吸附研究，结果见表4。IF为1.36，说明制备的MIPs具有较好的印迹效果；在有印迹分子结构类似物(腺苷酸、烟酰胺)的存在下，分离因子α均>1，说明印迹材料对NMN的选择和识别能力很好；此外，NMN与腺苷酸、烟酰胺的相对分离因子β(2.81、2.83)均>1，可见与NIPs相比，MIPs对NMN有着较强的特异性吸附能力。
表4 MIPs的选择性吸附
Table 4 Selective adsorption of molecularly imprinted polymers
底物IF分离因子αM分离因子αN相对分离因子βNMN 1.36///腺苷酸0.484.131.472.81烟酰胺0.4815.685.542.83
2.3 固相萃取柱的制备及其应用
研究了MISPE西兰花提取液中NMN的实际应用效能。取适量西兰花提取液加入到MISPE柱中，用乙腈作为淋洗液、甲醇乙酸(体积比9∶1)作为脱模液，收集洗脱液，采用HPLC分析其组成。西兰花提取液和过MISPE柱洗脱液的色谱图如图5所示，可以看出，NMN的色谱峰显著增高，杂质色谱峰显著降低或消失，说明该柱对NMN具有很好的选择性，可以从复杂基质中分离富集NMN。
A-西兰花提取液；B-西兰花提取液经MISPE处理后的洗脱液
图5 MISPE西兰花样品吸附净化效果谱图
Fig.5 Spectrum of adsorption and purification effect of molecularly imprinted solid phase extraction broccoli sample
2.4 加标回收率和精密度
在1.4固相萃取条件下，采用加标回收法，在西兰花提取液中加入1 mL不同浓度的NMN标准液，旋匀，使其加标质量浓度分别为5、50、200 μg/mL，每个浓度水平测定5次，实验结果如表5所示，西兰花中NMN的回收率为89.52%～95.77%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)(n=5)为1.08%～5.27%，实验结果表明该方法具有良好的准确度和精密度。
表5 西兰花中NMN的加标回收率和精密度
Table 5 Recoveries and RSD of NMN in broccoli
加标水平/(μg·mL-1)回收率/%RSD/%(n=5)589.521.085095.775.2720090.423.22
2.5 分子印迹的重复使用性能
分子印迹的重复使用性能是评价其实用性的一个重要指标。在5 mL 80 μg/mL的NMN溶液中，加入一定量的MIPs，吸附平衡后离心，HPLC测定上清液中NMN浓度，计算该MIPs的吸附量。然后用一定量的脱模液洗脱吸附在MIPs中的NMN，干燥后，将该MIPs再加入到5 mL 80 μg/mL的NMN溶液中，吸附平衡后测定其吸附量。按照相同的步骤重复测定7次，MIPs的吸附量如图6所示。可以看出MIPs重复使用多次后，吸附性能变化不大，该实验制备的MIPs可以反复多次使用。
图6 多次使用后MIPs的吸附量
Fig.6 Adsorption capacity of MIPs toward NMN after seven recycles
3 结论
本研究首次以NMN为模板分子、乙腈水为致孔剂、MAA为功能单体、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、AIBN为引发剂，采用沉淀聚合法制备了NMN MIPs，并且采用正交试验优化了聚合工艺。当NMN、MAA、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1∶2∶10、致孔剂乙腈水用量12 mL、聚合温度60 ℃时，制备的MIPs吸附效果最好。静态吸附结果表明，所制得的MIPs对NMN有较强的吸附能力。动态吸附结果表明，该MIPs在60 min左右达到吸附平衡；MIPs和NIPs对NMN的吸附过程均符合准二级动力学方程。选择性吸附实验结果表明MIPs对NMN有很好的特异性吸附能力。该MIPs用于固相萃取西兰花提取液中的NMN时，展现了较高的应用性能，为植物中NMN的分离和纯化提供了新的方法。
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