青稞酒作为承接古老传统生产工艺的清香型白酒之一，是以青稞为主要原料酿造而成[1-2]。目前研究发现，青稞酒中含有丰富的醇、醛、酸、酯等成分[3-4]。刘志鹏等[5]通过全二维飞行质谱鉴定出青稞酒中含有的448种挥发性化合物，其中包括呋喃类、内酯类和萜烯类。萜烯类化合物是最大的天然产物之一，现已知3 000多种[6]，萜烯类化合物是以异戊二烯为结构单位倍数的烃类及其含氧衍生物，其中包括单萜烯类、倍半萜烯类以及二萜烯类化合物等[7]。近几年相关研究显示，青稞酒中含有α-蒎烯、香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、罗勒烯、柠檬烯、β-紫罗酮等多种萜烯类成分[5,8-9]。据报道，α-蒎烯具有神经保护性、抗氧化性、抗癌及抗炎的功能[10-12]；香茅醇具有抗凋亡、抗炎的功能[13-15]；β-石竹烯具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、镇痛及促进创伤修复的功效[16-19]；月桂烯具有抗氧化、抗炎、抗衰老的功效[20-22]；而罗勒烯的功效尚未清楚；柠檬烯具有抗炎、抗氧化、抗病毒及抗糖尿病等功效[23-24]；β-紫罗酮是一种抗癌活性剂，并具有抗氧化及抗炎的功效[25-28]。但目前青稞酒中独特风味成分的功能性尚未清楚。
细胞自噬是一种细胞内的“自我吞噬”的机制，主要借助膜结构对错误折叠的蛋白和受损的细胞器进行降解再利用[29]。酒精的过量摄入会导致过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的堆积，ROS会氧化和破坏线粒体所产的脂质、核酸和氨基酸前体等，导致线粒体功能障碍，从而诱导细胞自噬[30]。氧化应激和细胞自噬相互调控，作用关系复杂。据报道，α-蒎烯可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione,GSH)的功能，并降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮和白介素-6(interleukin-6，IL-6)的含量，实现抗氧化和抗炎的作用[10]。同时香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、罗勒烯、柠檬烯、β-紫罗酮等均具有一定的抗氧化性，但包括α-蒎烯在内的物质对细胞自噬的影响尚未明确，并且有关的报道较少。因此，本研究选取上述7种萜烯类成分开展对细胞自噬影响作用研究及功能评价。
通过用不同浓度萜烯类化合物处理人源正常肝细胞，采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)、实时荧光定量(real time quantitative PCR，RT-qPCR)和免疫荧光等方法，分析了α-蒎烯、香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、罗勒烯、柠檬烯、β-紫罗酮对细胞自噬的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
α-蒎烯、罗勒烯、β-紫罗酮,美国Thermo公司；香茅醇，美国Acros organics公司；柠檬烯，江西环球天然香料有限公司；β-石竹烯、月桂烯，上海麦克林公司；RPMI-1640培养基，美国Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、链霉素、青霉素，美国Hyclone公司；兔抗微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3，LC3)、P62/SQSTM1，日本Medical &Biological Laboratories公司；GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、594抗兔lgG二抗,美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SpectraMax® iD3多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；Micro 21R小型台式离心机，美国Thermo公司；2-16N高速微量离心机，湖南恒诺仪器设备有限公司；ChenmiScope 6200 Touch化学发光成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司；THUNDER Imager 3显微成像系统，德国Leica公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养
L02细胞采用高糖 RPMI-1640培养基培养,并添加质量分数10%的胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素，培养条件为 37 ℃、5% CO2。当细胞生长至85%左右融合度时，使用质量分数0.25%胰蛋白酶消化细胞,进行传代处理，试验所用细胞均为3～15代。
1.3.2 细胞存活率试验
以2.0×104/孔接种LO2细胞于96孔微孔板中，放置细胞培养箱中培养24 h后，用不同的萜烯类化合物处理24 h。使用细胞增殖检测试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖能力：在培养板的每孔细胞中滴加CCK-8溶液10 μL，放置细胞培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定细胞在450 nm处吸光度值，各组细胞的存活率计算如公式(1)所示：
细胞存活率
(1)
式中：A1为不同萜烯类化合物测定的吸光度；A2为正常培养基测定的吸光度。
1.3.3 RT-qPCR法
使用Invitrogen试剂盒提取LO2细胞总RNA，并根据LC3、P62基因mRNA序列设计 PCR引物。LC3引物(上游5′-TGCTGTCCCGAATGTCTCCTG-3′、下游5′-GCTAACCAAGCCTTCTTCCTCC-3′)；P62引物(上游5′-TGCCCAGACTACGACTTGTG-3′、下游 5′-AGTGTCCGTGTTTCACCTTCC-3′)；内参采用GAPDH，引物为 (上游5′-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3′、下游5′-TCACACACCAGCAGGTTATCATC-3′。引物合成由上海生工生物技术公司完成。RT-qPCR 反应体系严格按照Vazyme试剂盒说明书进行。总反应体系为20 μL，反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。反应结束仪器自动生成循环阈 (cycle threshold,Ct) 值,用各组mRNA与内参基因的Ct值的差值 (ΔCt)，最后用 (2-ΔΔCt)表示各组mRNA的相对表达量。
1.3.4 Western blotting试验
以1.6×105/孔接种LO2细胞于6孔板中，药物处理24 h后，PBS洗3次，用含有蛋白酶抑制剂混合物的蛋白质提取液A裂解LO2细胞，并在4 ℃下以12 000 ×g离心15 min，吸出细胞上清液。用BCA蛋白质测定试剂盒测定上清液中的总蛋白质浓度。取100 μL细胞上清液加入25 μL的5×样品缓冲液混匀。样品在98 ℃下加热10 min，然后以13 800×g离心1 min。将10 μL上清液加到10%SDS-PAGE凝胶上。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上，并在封闭缓冲液(5%脱脂奶，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)中室温封闭1 h，在4 ℃下分别与抗兔LC3和P62一抗孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育40 min后，进行显色和拍照。用ImageJ软件进行定量分析和比较。
1.3.5 免疫荧光法
LO2细胞计数，以1.6×105/孔接种于6孔板中，分组处理24 h后，PBS洗2次，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗3次，用含有0.3% Triton X-100和1% BSA的PBS室温封闭1 h，分别加兔抗LC3和P62抗体(1∶1 000)，避光孵育1 h，PBS洗3次，加入594抗兔lgG二抗(1∶1 000)室温孵育40 min，PBS洗3次，用含有4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察LC3和P62的表达强度及定位。
1.3.6 数据统计与分析
用SPSS 23.0分析处理数据，所有实验数据均为3次平行试验的平均值，用平均值±标准误(SE± Mean)表示；图表由Origin 2018绘制。
2 结果与分析
2.1 萜烯类化合物对LO2细胞存活率的影响
利用CCK-8方法观察萜烯类化合物对LO2细胞存活率的影响,如图1所示。与对照组相比，α-蒎烯处理组的细胞在0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL 4个不同质量浓度下，细胞存活率均明显增加(P<0.001)；香茅醇处理组的细胞，在质量浓度为0.05 mg/mL时，细胞存活率增加(P<0.001)，当质量浓度>0.4 mg/mL时，细胞存活率明显降低；β-石竹烯处理组的细胞，在质量浓度<0.2 mg/mL时，细胞存活率明显增加(P<0.001)，但高于此质量浓度范围，细胞存活率则低于对照组；月桂烯处理组的细胞，在质量浓度<0.2 mg/mL时能够正常存活，在质量浓度为0.05 mg/mL时细胞存活率显著升高(P<0.001)；柠檬烯处理组的细胞在5种不同质量浓度中的存活率无明显差异；罗勒烯处理组的细胞，在质量浓度>0.1 mg/mL时，细胞存活率就开始呈下降趋势；β-紫罗酮处理组的细胞，在质量浓度为0.4 mg/mL时就开始大量死亡。结合上述实验结果，在保证细胞存活率无显著性差异的情况下，针对α-蒎烯选取质量浓度为0.1、0.2、0.4 mg/mL；香茅醇选取0.05、0.1、0.2 mg/mL；β-石竹烯选取0、0.1、0.2 mg/mL；月桂烯选取0、0.05、0.1、0.2 mg/mL；柠檬烯选取0、0.05、0.1、0.2 mg/mL；罗勒烯选取0、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL；β-紫罗酮选取0、0.05、0.1、0.2 mg/mL进行后续实验。
a-α-蒎烯；b-β-石竹烯；c-香茅醇；d-月桂烯；e-罗勒烯；f-柠檬烯；g-β-紫罗酮
图1 七种萜烯类化合物对LO2细胞存活率的影响
Fig.1 Effects of terpenes on the survival rate of LO2 cells
注：图中*代表有显著差异，*表示(P<0.05)，**表示(P<0.01),***表示(P<0.001)(下同)
2.2 萜烯类化合物对细胞自噬的影响
能量调节因子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP- activated protein kinase，AMPK)与自噬相关蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)在细胞自噬中起着重要的调节作用。在营养条件下，自噬相关蛋白mTORC1被激活，自噬处于低活性状态。当细胞处于饥饿条件下，AMPK蛋白被激活，从而抑制mTORC1蛋白，导致自噬被激活[31]。本研究用7种萜烯类化合物分别处理细胞24 h后，在营养与饥饿的条件下，观察其对于细胞自噬的影响作用。如图2所示，经α-蒎烯处理后的细胞，在营养条件下，LC3蛋白表达水平以浓度依赖的形式增加，并与饥饿条件下表达水平一致；香茅醇处理后的细胞，在营养和饥饿条件下的蛋白表达水平无明显差异；罗勒烯处理后，在0.4 mg/mL时，LC3蛋白表达水平增加；经β-石竹烯、月桂烯、柠檬烯和β-紫罗酮处理后的细胞，两种条件下的LC3蛋白表达水平也均无明显差异。实验结果显示，α-蒎烯处理后，自噬相关蛋白LC3的表达水平呈浓度依赖性增加，可能对细胞自噬具有促进作用；而罗勒烯在0.2 mg/mL时呈现抑制自噬的作用，当质量浓度在0.4 mg/mL时，LC3表达量增加，此结果提示罗勒烯对自噬可能存在抑制作用，所以不在后续实验中展开研究；而其他5种萜烯类化合物在细胞自噬方面无显著性作用。终上所述，根据实验结果提示α-蒎烯对自噬的影响较显著，所以选取α-蒎烯进行后续的试验。
a～c-α-蒎烯;d～f-香茅醇;g～i-β-石竹烯;j～l-月桂烯;m～o-柠檬烯;p～r-罗勒烯;s～u-β-紫罗酮
图2 七种萜烯类化合物对LC3蛋白表达的影响
Fig.2 The effect of terpenes on the expression of LC3 protein
2.3 α-蒎烯对细胞自噬mRNA水平的影响
为了进一步证明α-蒎烯对细胞自噬的影响，检测了α-蒎烯对自噬相关蛋白LC3和P62 mRNA相对表达水平的影响。如图3所示，经α-蒎烯处理后，营养条件和饥饿条件下的LC3蛋白表达水平都以浓度依赖的形式增加，而P62的表达水平有所降低。在典型情况下，P62是一种泛素化蛋白，会随着自噬流量的上调而减少[32]。LC3蛋白的mRNA表达水平与Western blotting的结果相一致。结合实验结果提示，α-蒎烯可能对细胞自噬具有促进作用。
a-LC3 mRNA表达水平;b-P62 mRNA表达水平
图3 α-蒎烯对LC3和P62 mRNA表达水平的影响
Fig.3 The effect of α-pinene on the mRNA expression level of LC3 and P62
2.4 α-蒎烯加入自噬阻断剂对细胞自噬的影响
巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1，BafA1)是一种自噬末期阻断剂，通过阻断自噬体与溶酶体的融合，并抑制溶酶体中pH值和蛋白质降解阻断自噬[33]。由于在图2-a、图2-b中，在营养条件下α-蒎烯处理后LC3的蛋白表达强度较弱，这可能是由于自噬流量过大导致的。为了更确切地观察α-蒎烯对细胞自噬的影响，在接下来的实验中，加入自噬末期阻断剂BafA1。BafA1可以阻断自噬末期，抑制LC3在自噬溶酶体中的重利用或降解。结果如图4所示，经对照组和α-蒎烯处理后的细胞中LC3蛋白表达水平均有所增加。使用BafA1处理2 h后，α-蒎烯处理组的LC3表达水平显著上调，这是由于BafA1通过抑制自噬末期，阻断LC3的降解[34]。因此，可以进一步判定α-蒎烯可能对细胞自噬具有促进作用。
a-α-蒎烯Western blotting结果;b-α-蒎烯灰度值分析
图4 加入bafA1观察α-蒎烯对细胞自噬的影响
Fig.4 Observe the effect of α-pinene on autophagy through adding bafA1
YIN等[35]通过免疫荧光方法分析了血管生成素2(angiopoietin 2，Ang2)对LC3和P62对细胞自噬的影响。研究表明，Ang2能提高LC3蛋白的荧光点数并减弱P62的荧光点数，诱导自噬。为了进一步验证α-蒎烯对细胞自噬的影响，通过免疫荧光法分析了α-蒎烯对 LC3和P62蛋白表达水平的影响。2.1中的实验结果显示，α-蒎烯在质量浓度为0.4 mg/mL时，对细胞自噬的影响最大，差异显著，因此选取0.4 mg/mL的质量浓度进行免疫荧光分析。结果如图5所示，使用α-蒎烯处理24 h后，细胞内形成大量自噬体，LC3蛋白被招募至自噬体表面。红色LC3蛋白多于绿色荧光蛋白，显示自噬被充分诱导，且完成了自噬体成熟并与溶酶体融合成为自噬溶酶体的整个过程[36]，且P62蛋白表达水平随着自噬流量的增加而降低，这与以前的研究结果相一致。该结果进一步显示，α-蒎烯在营养及饥饿条件下，均可明显诱导细胞自噬发生、发展并成熟。
a-LC3荧光强度;b-P62荧光强度
图5 免疫荧光分析α-蒎烯对LC3蛋白表达水平的影响
Fig.5 Immunofluorescence analysis of the effect of α-pinene on the expression of LC3 protein
3 结论
本研究通过用不同浓度的萜烯类化合物处理细胞，利用 Western blot分析观察了7种萜烯类化合物对细胞自噬的影响，结果表明，经香茅醇、β-石竹烯、月桂烯、罗勒烯、柠檬烯、β-紫罗酮处理后，细胞的LC3蛋白表达水平均无明显变化，而α-蒎烯处理后的LC3蛋白表达水平以浓度依赖性的水平上调。为了进一步探究α-蒎烯对细胞自噬的影响作用，通过 RT-qPCR检测了α-蒎烯处理组在营养及饥饿条件下LC3和P62 mRNA表达水平变化，结果显示，α-蒎烯处理后，LC3 mRNA表达水平上调，P62 mRNA表达水平降低。此外，免疫荧光分析结果也显示了α-蒎烯对细胞自噬的促进作用。
综合所有实验结果表明，相较于青稞酒中的其他6种萜烯类化合物，α-蒎烯在一定浓度内可能对LO2细胞具有一定的促进细胞自噬的作用。这为接下来的自噬相关研究提供了参考，也为减弱肝损伤治疗方案提供了有效参考。
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