麻保沙星(marbofloxacin，Mab)作为一种用于治疗动物皮肤感染、尿路感染和呼吸道感染的专用新型氟喹诺酮类抗菌药，具有抗菌谱广、抗菌活性强、毒性低且对其他抗菌药无交叉耐药性的优点[1-2]。然而，Mab在养殖业中的长期滥用，导致其在动物性食品中的残留超标，通过食物链进入机体，可能会伤害中枢神经系统，引起心血管疾病等[3]。为了更好地监管动物性食品中Mab残留，欧盟规定了Mab在牛奶和食用动物组织中的最大残留限量为30和150 μg/kg[4]，我国食品质量管理标准GB/T 22985—2008 《牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》中规定牛奶和奶粉中Mab限量为1 μg/kg。
目前检测Mab残留的方法有液相色谱法[5-6]、高效液相色谱-质谱法[7]、毛细管电泳法[8]、微生物法[9]、酶联免疫分析法[10-12]和胶体金试纸条法[13]。其中这些仪器分析方法大都存在样品前处理复杂、检测成本高、依赖专业的操作人员的缺点，酶联免疫分析方法和微生物法存在检测时间相对长的不足，胶体金免疫层析法的灵敏度低。而电化学免疫传感器具有灵敏、简便和快速的优势，能更好地满足Mab的快速检测需求。
氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是一种二维碳纳米材料，其表面含有大量的羟基、羰基、羧基等含氧基团，这些官能团为固定抗体提供了大量的活性位点[14]。同时，GO还具有良好的生物相容性和巨大的比表面积，这些优良特性使其能够广泛用于电化学传感器[15-16]。壳聚糖(chitosan，CS)作为一种天然多糖，具有良好的成膜能力和生物相容性[17]，其表面的氨基可与GO表面的羧基反应形成GO-CS复合膜，大大增加了抗体的结合面。该复合膜经电化学还原后，可大大提高电极的导电性能，从而提高Mab电化学免疫传感器的灵敏度。因此，本研究建立基于GO-CS复合膜修饰电极的Mab电化学免疫传感器。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
GO，上海源叶生物有限公司；CS、Mab标准品、氧氟沙星标准品、诺氟沙星标准品、环丙沙星标准品，阿拉丁；Mab抗体，实验室自制；铁氰化钾，天津市德华化学试剂有限公司；亚铁氰化钾、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氧化铝粉末，天津市德恩化学试剂有限公司。试验中所用试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。
1.2 仪器与设备
CHI610E电化学工作站、三电极体系CHI104型玻碳电极(工作电极)、R0302型AgCl电极(参比电极)、CHI115型铂丝电极(辅助电极)，上海辰华仪器有限公司；KQ-50超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；TM 3030 plus台式扫描电镜，日本日立公司。
1.3 实验方法
1.3.1 GO-CS复合膜的制备
称取5.0 mg CS溶于5.0 mL 0.05 mol/L的HCl溶液中，搅拌溶解后，用0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的CS溶液，4 ℃保存，备用。
称取2.0 mg GO加入到l.0 mL l.0 mg/mL CS溶液中，超声分散1 h，得到均匀分散的GO-CS混合体系，GO质量浓度为2.0 mg/mL，4 ℃保存，备用。
采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)表征GO和GO-CS复合膜的表面形貌。
1.3.2 免疫传感器的制备和Mab检测
(1)免疫传感器的制备
将直径为3 mm的裸玻碳电极(glassy carbon electrode，GCE)表面依次用1.0、0.3和0.05 μm的氧化铝粉末抛光，再分别用硝酸水溶液(1∶1，体积比)、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干。随后进行循环伏安法(cyclic voltammetry，CV)扫描，出现稳定的氧化还原峰，且电位差在90 mV左右时，准确量取10 μL GO-CS复合膜溶液，垂直滴涂于GCE表面，室温下自然晾干。然后将电极置于pH 7.0 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液中，在(+0.2)～(-1.7) V的电位范围内利用CV法将GO-CS复合膜还原，得到还原氧化石墨烯-壳聚糖(reduced graphene oxide-chitosan，rGO-CS)复合膜。量取10 μL稀释好的Mab抗体，垂直滴涂于rGO-CS/GCE表面，置于生化培养箱中，37 ℃下温育1 h。再移取10 μL 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，垂直滴涂于电极表面，37 ℃下温育l h，得到BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE，用CV法对修饰电极进行表征。
(2)Mab检测
量取10 μL Mab标准品溶液(或样品溶液)垂直滴涂在BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE表面，37 ℃温育1 h。然后在0.1 mol/L KCl+10 mmol/L K3Fe(CN)6+0.1 mol/L磷酸盐缓冲液测试底液中用CV法和差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)扫描电极，并记录峰值电流。
1.3.3 电化学检测
采用CV和DPV方法进行电化学检测。在电化学工作站中，采用三电极体系，以BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE为工作电极，铂丝电极为辅助电极，AgCl电极为参比电极。在电化学测试时，测试底液为0.1 mol/L KCl+10 mmol/L K3Fe(CN)6+0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.0)，GO-CS复合膜还原时CV测试电位范围为(+0.2)～(-1.7) V，其余测试电位范围为(-0.2)～(+0.6) V，扫描速率为50 mV/s，DPV检测的电位范围为0～(+0.6) V，脉冲振幅为50 mV。
1.3.4 样品预处理
猪肉样品预处理：将猪肉样品切碎，准确称取2.0 g样品转移至50 mL离心管中，然后向该离心管中加入pH 7.0 0.5 mol/L乙二胺四乙酸和15.0 mL二氯甲烷，避光振荡10 min，离心(4 000 r/min，10 min)，取上清液，重复提取2次，合并有机相，减压蒸发至近干，将残余物复溶在含10%甲醇的磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH=7.2)中，4 ℃保存，备用。
牛奶样品前处理：准确量取2.0 mL的牛奶转移至50 mL离心管中，加入4.0 mL乙腈，充分涡旋混匀，振荡10 min，离心(13 000 r/min，5 min)，取上清液，加入5.0 mL的正己烷脱脂，涡旋1.0 min，静置，保留下层液体于圆底烧瓶中，重复2次，合并有机相，减压蒸发浓缩至近干，用1.0 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.2)复溶，4 ℃保存，备用。
2 结果与分析
2.1 GO-CS复合物的表征
分别取1.0 mL的GO溶液和GO-CS溶液至玻璃皿表面，挥发至干，得到GO粉末和GO-CS复合膜，取少量粉末置于载物台上，放到SEM中，调节放大倍数和焦距，结果见图1。
a-GO；b-GO-CS
图1 GO和GO-CS的扫描电镜图(×1 000)
Fig.1 The SEM of GO and GO-CS (×1 000)
GO为均匀的片状结构，由于溶液干燥成粉末时发生了皱褶，故在SEM下观察的结果如图1-a所示。CS具有良好的分散性和成膜性，将GO和CS结合，形成一层均匀的导电薄膜(图1-b)，提高了GO的分散性，增大了抗体的固定表面积。
2.2 电化学rGO-CS复合膜
在pH 7.0 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液中，以50 mV/s的扫描速率，在(+0.2)～(-1.7) V的电位范围内用电化学还原法对GCE上的GO-CS复合膜进行还原，结果见图2。
图2 GO-CS/GCE修饰电极在0.1 mol/L 磷酸盐溶液中的CV图
Fig.2 Cyclic voltammograms of GO-CS/GCE modified electrodes in 0.1 mol/L PBS
由图2可知，第1圈CV扫描时在-1.6 V处出现了一个较宽的还原峰，这是由GO上含氧官能团的还原所导致。随着电化学还原过程的发生，GO上的含氧官能团数量会越来越少，故在随后的扫描图中，还原电流变化越来越小，还原结果与文献中的报道一致[18-19]。经过12圈扫描后，滴涂在玻碳电极上的GO被不可逆地还原成rGO，得到rGO-CS复合膜。据文献报道[20]，GO上含氧官能团的存在，会导致GO的导电性变差，所以，当GO被还原后，含氧官能团数量会大大减少，rGO的导电性增强，因此rGO-CS复合膜的导电性随之提高，进而提高免疫传感器的灵敏度。
2.3 不同修饰过程电极的表征
采用CV法对不同修饰过程电极表面的电化学行为进行表征，结果见图3。
a-GCE；b-GO-CS/GCE；c-rGO-CS/GCE；d-anti-Mab/rGO-CS/GCE；e-BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE
图3 不同修饰电极的CV图
Fig.3 Cyclic voltammograms of different modified electrodes in detection solution
由图3可知，GCE裸电极(图3中的a)经过抛光打磨处理后，出现了一对可逆的氧化还原峰，这是由六氰合铁(III)配离子的可逆的氧化还原行为形成的。当GCE表面修饰GO-CS后，峰值电流会减小(图3中的b)，这是因为GO导电性不高，所以用GO-CS修饰GCE后会引起峰值电流减小；而将GO还原后，GCE的导电性会明显增强，故峰值电流显著增大(图3中的c)，说明rGO的导电性较强。在电极上修饰anti-Mab后，峰值电流降低(图3中的d)，这是因为蛋白质具有绝缘性，滴加在电极上，会阻碍电极表面的电子传递，所以当anti-Mab成功修饰在电极上，会引起峰值电流减小。用5%BSA溶液封闭1 h后，峰值电流会进一步减小(图3中的e)，因为BSA会阻碍电极表面的电子传递，使得峰值电流进一步减小。
2.4 扫描速率的影响
在保持其他条件不变的情况下，考察扫描速率(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130 mV/s)对免疫传感器的影响，结果见图4。
图4 不同扫描速率下BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE在测试底液中的CV图
Fig.4 Cyclic voltammograms of BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE in detection solution at different scan rates
注：插图为氧化还原峰值电流与扫描速率平方根的线性拟合图
如图4所示，在扫描速率为10～130 mV/s时，随着扫描速率的增加，氧化峰的电流值在增大，还原峰的电流值在逐渐减小，峰值电流与扫描速率平方根呈现出良好的线性关系，回归方程为：Ipa=1.756 64-1.591 74x，相关系数r=0.997 5和Ipc=-1.853 96+1.609 3x，相关系数r=0.997 3，说明电极反应受扩散过程控制。
2.5 检测条件的优化
本研究分别对抗体质量浓度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL)、测试底液中K3Fe(CN)6浓度(0、5、10、15、20 mmol/L)、测试底液pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)进行优化，结果见图5。
a-抗体浓度；b-K3Fe(CN)6浓度；c-测试底液pH
图5 抗体浓度、测试底液中浓度和pH的优化
Fig.5 Optimization of antibody concentration,K3Fe(CN)6 concentration and pH of detection solution
注：a：测试底液中K3Fe(CN)6浓度10 mmol/L，测试底液的pH 7.0；b：抗体质量浓度50 μg/mL，测试底液pH 7.0；c：抗体质量浓度50 μg/mL，测试底液中K3Fe(CN)6浓度10 mmol/L
由图5-a可知，在质量浓度为0～50 μg/mL时，随着抗体浓度的增加，固定到免疫传感器上的anti-Mab量会增多，使电极表面的阻抗增加，从而使峰值电流减小；当抗体质量浓度高于50 μg/mL时，随着抗体浓度的增大，峰值电流的减小变缓，说明此时抗体在电极表面的固定量接近饱和，因此，选择50 μg/mL为Mab抗体的最佳修饰质量浓度。由图5-b可知，随着测试底液中K3Fe(CN)6浓度的增大，免疫传感器的电流响应值迅速增大，当K3Fe(CN)6浓度达到10 mmol/L时，电化学免疫传感器电流响应值达到最大值2.81×10-4 A，此后，随着K3Fe(CN)6浓度进一步增大，电流响应值增加明显变慢，因此，选择K3Fe(CN)6浓度为10 mmol/L。测试底液的pH值对免疫传感器的性能也有重要影响，如图5-c所示，峰值电流随测试底液pH的升高先增大后减小，当pH为7.0时，峰值电流达到最大值3.31×10-4 A。这是因为酸性(或碱性)环境对抗体蛋白的活性和抗体在电极表面固定量有影响。因此，选用测试底液的pH为7.0。
2.6 Mab标准曲线的建立
电化学传感器的有效响应范围是传感器在实际应用中最重要的参数。按照1.3.2的方法测定Mab一系列不同质量浓度(2、5、10、15、20、25、30、35、40 ng/mL)的峰值电流，以Mab质量浓度为横坐标，以峰值电流为纵坐标，用Origin软件进行线性拟合，结果见图6。
图6 DPV的峰值电流对不同质量浓度Mab的线性拟合图
Fig.6 Linear fitting graph of peak currents of DPV towards different Mab concentrations
注：插图为免疫传感器对不同质量浓度Mab的DPV图
由图6可知，在2.0～40.0 ng/mL，DPV峰值电流随着Mab质量浓度增大而减小，呈现良好的线性关系，回归方程为y=2.863-0.032x，相关系数r=-0.98，检测限为0.08 ng/mL，远低于国家规定Mab最大残留限量。结果表明，该电化学免疫传感器在Mab质量浓度在2.0～40.0 ng/mL范围内的测定结果较准确。
2.7 特异性和稳定性
在Mab标品溶液中分别添加100倍质量浓度的氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星，相同条件孵育后，只含Mab标品和加入干扰物后，DPV检测峰值电流分别为2.53×10-4、2.58×10-4、2.61×10-4、2.64×10-4 A，表明在加入干扰物后，电流分别增加1.98%、3.16%、4.35%，这说明所构建的Mab电化学免疫传感器具有良好特异性。
将电化学免疫传感器置于4 ℃阴凉干燥处，保存25 d，每隔5 d测定1次相同电极的DPV峰值电流。结果表明，随着保藏时间的延长，传感器的峰值电流在缓慢下降，25 d后传感器的峰值电流相较第1天降低约16.9%，由此得出传感器具有较好的稳定性。
2.8 添加回收试验
2.8.1 校正曲线
分别用猪肉样和牛奶样阴性样品处理液将Mab标品稀释成一系列质量浓度(5、10、15、20、25、30、35、40 ng/mL)，用DPV检测，分别以Mab质量浓度为横坐标，以峰值电流为纵坐标，用Origin软件进行线性拟合得到样品中Mab检测的校正曲线。结果表明，Mab在5.0～40.0 ng/mL的质量浓度与峰值电流呈现良好的线性关系，猪肉样回归方程为y=2.475-0.026x，相关系数r=-0.989，检测限为0.11 ng/mL，牛奶样回归方程为y=2.839-0.035x，相关系数r=-0.992，检测限为0.097 ng/mL。
2.8.2 添加回收试验
按照1.3.4方法处理猪肉样和牛奶样，在猪肉样中Mab加标量为5、20、40 ng/g，在牛奶样中Mab加标量为5、20、40 ng/mL，每种样品重复处理3次，用DPV检测，用校正曲线的回归方程计算Mab浓度，结果见表1。
表1 添加回收试验结果(n=3)
Table 1 The results of spiked test (n=3)
样品加标量测定量回收率/%相对标准偏差/%5ng/g(4.22±0.47)ng/g84.406.17猪肉20ng/g(17.55±1.83)ng/g87.750.6040ng/g(37.42±1.62)ng/g93.562.475ng/mL(4.32±1.47)ng/mL86.405.86牛奶20ng/mL(17.99±2.07)ng/mL89.950.7940ng/mL(38.56±2.13)ng/mL96.362.27
由表1可知，猪肉样添加回收率为84.40%～93.56%，相对标准偏差为0.60%～6.17%，牛奶样添加回收率为86.40%～96.36%，相对标准偏差为0.79%～5.86%。说明本方法构建的电化学免疫传感器可用于猪肉和牛奶中Mab残留检测。
3 结论
本研究基于GO-CS复合膜构建了检测Mab的电化学免疫传感器。为了证实电化学免疫传感器的实用性，选择猪肉和牛奶的阴性样品进行添加回收试验，结果表明，制备的Mab/BSA/anti-Mab/rGO-CS/GCE电化学免疫传感器，在Mab质量浓度为2.0～40.0 ng/mL与电极峰值电流呈良好的线性关系，检测限为0.08 ng/mL，特异性和稳定性良好。添加回收试验表明，回收率为84.40%～96.36%，相对标准偏差为0.60%～6.17%。本研究所构建的基于GO-CS复合膜的电化学免疫传感器可用于动物性食品中Mab的检测。
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