炭疽菌是一类重要的致病真菌，主要包括胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)、博宁炭疽菌(Colletotrichum boninense)[1-3]等，分布范围极广，热带、亚热带甚至温带的植物都可能成为其寄主。多种炭疽菌属(Colletotrichum Corda)的真菌可诱发炭疽病[4]，危害杧果、茶树、百香果、番木瓜等[5-8]，造成严重的经济损失。杧果是著名的热带水果之一，作为我国重要的热带、亚热带经济作物，其主要的采后病害包括炭疽病、蒂腐病和果腐病等[9]。近年来，炭疽病成为危害杧果的采前生长期和采后贮藏阶段最严重的病害之一[10]，严重时甚至造成绝产[11]。该病最初在杧果皮上潜伏，直到果实发育的最后阶段发病导致果实腐烂[12]。生产上对杧果果实采后炭疽病的防治多是使用化学杀菌剂，高效但极易出现残留，会损伤果实质量和危害人体健康，因此，开发高效和无残留、无毒害的抑制剂尤为重要。
植物精油是芳香植物的高度浓缩提取物，不溶于水，易溶于有机溶剂，具有挥发性，油状液体物质[13]，大多具有还原性、抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂，同时具有安全环保、低毒低残留、不易产生抗药性等特点，常用于鲜切水果、果蔬保鲜以及作物腐败菌和致病菌的控制[14]。植物精油在果蔬保鲜抗病等方面取得显著的效果，可有效抑制荔枝的褐变、腐败[15]，多种精油对链格孢霉(Alternaria alternata)、指状青霉(Penicillium digitatum)、灰霉(Botrytis cinerea)有较强的抑制作用[16]，芥末精油能抑制杧果炭疽菌和蒂腐病菌在杧果果实上的生长[17]。丁香精油对番茄灰霉病有较好的抑制效果，能有效抑制樱桃番茄的自然腐烂[18]。
本试验通过10种植物精油对杧果炭疽菌的离体抑菌效果，筛选出对杧果炭疽菌的最佳抑制精油及其浓度，探讨丁香精油对杧果炭疽菌的防治和品质的影响，以期为丁香精油对杧果炭疽菌抑制机理的深入研究及杧果炭疽病防治机理研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试杧果炭疽病菌(C.gloeosporioides)为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所采后病害与保鲜课题组提供。
丁香精油、肉桂精油、茶树精油、香茅精油、樟脑精油、玫瑰草精油、草果精油、山茶花精油、橄榄精油和柠檬精油，上海源叶生物科技有限公司。
供试品种为杧果品种“贵妃杧”，购于广西百色国家农业科技园区杧果园。
1.2 仪器与设备
电子计重称，上海英展机电企业有限公司；GY-4型果实硬度计，浙江托普仪器有限公司；SW-CJ-2D型超净工作台，上海博迅实业有限公司；PAL-1型手持糖度计，日本Atago株式会社；恒温培养箱，艾力特国际贸易有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 10种植物精油对杧果炭疽菌离体抑制效果测定
采用生长速率法测定。结合预试验结果，采用含药平板法进行植物精油对杧果炭疽菌的抑菌试验，配制如表1中设定好的系列精油浓度的PDA培养基(45 mL)，倒入3个培养皿中，取PDA培养基上生长7 d的供试菌株，用直径5 mm的无菌打孔器在其菌落边缘均匀打孔，并将菌饼每皿1块接入上述设定好浓度的带药培养基和不含精油对照培养基中心，每个处理3次重复，置于28 ℃的生化培养箱中培养，待对照组病原菌生长至第7天，采用十字交叉法，测量菌落直径，计算抑菌率，并查出对应的抑菌几率值。以浓度对数(X)为横坐标，抑制几率值(Y)为纵坐标，计算回归方程Y=a+bX和相关系数(r)，并由回归方程计算抑制菌落扩展的有效浓度EC50值和EC90。菌落生长抑制率按公式(1)计算：
表1 植物精油设定浓度
Table 1 Plant essential oil concentration
精油种类精油含量/(μL·mL-1)丁香精油 0.501.002.004.006.00肉桂精油 0.501.001.501.752.25茶树精油 5.0010.0020.0040.00100.00香茅精油 1.005.0010.0015.0020.00樟脑精油 5.0010.0015.0025.0030.00玫瑰草油 1.005.0010.0020.0040.00橄榄精油 5.0010.0020.0040.0080.00草果精油 5.0010.0020.0040.0060.00山茶花精油1.005.0010.0020.0040.00柠檬精油 5.0010.0020.0040.0080.00
抑菌率/%
(1)
1.3.2 丁香精油对贵妃杧刺伤接种后发病的影响
选取大小基本一致，无机械损伤，果皮表面光滑的贵妃杧，结合体外抑制结果，配制0.2、0.5、1.0、2.0 和4.0 μL/mL的丁香精油溶液，每个浓度9个果实，用5 mm打孔器在果面上均匀打6个孔，然后放入配制好的精油溶液中浸泡5 min，取出晾干，然后分别接入5 mm杧果炭疽菌菌饼，置于保鲜盒中，室温贮藏，每3 d统计1次病斑直径和发病指数，病斑直径用直尺十字交叉法测定2次，取平均值。
参照覃丽萍等[19]的病情分级标准：0级，无病症；1级，d(病斑直径)<5 mm；2级，5 mm<d≤10 mm；3级，10 mm<d≤20 mm；4级，20 mm<d≤40 mm；5级，d>40 mm。病情指数计算如公式(2)所示:
病情指数
(2)
1.3.3 丁香精油对贵妃杧自然发病的影响
每个处理20个果，3次重复，然后放入配制好的2.0 μL/mL丁香精油溶液中浸泡5 min，以清水浸泡为对照，取出自然晾干，每3 d观察1次，统计自然发病个数及发病等级，计算发病指数和防效，如公式(3)和公式(4)所示。参照弓德强等[20]的方法，将病情按轻重分为5级：0级，无病斑；1级，出现零星腐烂斑点；2级，病斑面积占果实总面积的 25%以下；3级，病斑面积占果实总面积的25%～50%；4级，病斑面积占果实总面积的50%以上。
发病指数
(3)
防效
(4)
1.3.4 丁香精油对贵妃杧采后品质的影响
选取大小基本一致，无机械损伤，果皮表面光滑的贵妃杧，然后放入2.0 μL/mL丁香精油溶液中浸泡5 min，以清水浸泡为对照，取出自然晾干，然后放入保鲜盒内，每个处理10个果，3次重复，每隔3 d取样。
质量损失率直接采用称量法；硬度采用硬度计进行测定；可溶性固形物采用手持糖度计测定；可滴定酸用糖酸测定器测定；维生素C含量采用液相色谱测定。
1.4 数据统计分析
采用Excel 2016对数据进行统计分析，采用SPSS 18.0软件进行方差分析，Duncan法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 丁香精油对杧果炭疽病原菌生长的影响
10种植物精油对杧果炭疽菌均具有抑制效果，如表2 所示。从EC50值来看，丁香精油、肉桂精油、茶树精油、香茅精油和樟脑精油可归为一类，EC50值均小于1.0 μL/mL 抑菌效果较强；其次为玫瑰草油和橄榄精油，草果精油、山茶花精油和柠檬精油EC50值大于1.0 μL/mL，其中抑菌效果最弱为草果精油、山茶花精油和柠檬精油，EC50值均大于2.0 μL/mL；从EC90值来看，丁香精油归为一类，EC90值为0.565 μL/mL，肉桂精油、茶树精油和樟脑精油归为一类，EC90值均小于10.0 μL/mL，最后是香茅精油、玫瑰草油、橄榄精油、草果精油、山茶花精油和柠檬精油，EC90值均大于10.0 μL/mL。总体来看，丁香精油的抑菌效果最强，EC50值和EC90值分别为0.194 μL/mL和0.565 μL/mL。
表2 植物精油对杧果炭疽菌菌落生长抑制效果
Table 2 Inhibition effect of plant essential oil on colony growth of mango anthracnose
注：表中*表示P<0.05差异显著，**表示P<0.01差异极显著
精油种类回归方程R值EC50/(μL·mL-1)EC90/(μL·mL-1)丁香精油 y=2.761 2x+4.204 80.982 9**0.190.57肉桂精油 y=1.763 4x+4.096 10.971 1**0.331.74茶树精油 y=1.488 1x+3.5480.994 6**0.707.61香茅精油 y=1.201 5x+3.819 10.962 2**0.9611.22樟脑精油 y=2.721 6x+2.280 20.954 9*0.992.95玫瑰草油 y=0.806 6x+4.056 50.997 3**1.4857.73橄榄精油 y=1.193x+3.5470.997 5**1.5422.75草果精油 y=1.110 6x+3.447 10.995 9**2.5035.66山茶花精油y=1.111 4x+3.384 70.995 8**2.8440.42柠檬精油 y=1.129 2x+3.296 90.997 5**3.2243.97
2.2 丁香精油对贵妃杧刺伤接种后发病的影响
丁香精油在杧果进行刺伤接种试验结果表明，在贮藏期间，接种了杧果炭疽菌的贵妃果实，病斑直径不断扩大，不同浓度的丁香精油对杧果炭疽菌均有不同程度的抑制作用(表3、表4)。3 d时，1.0、2.0、4.0 μL/mL处理病斑直径和病情指数与对照有显著性差异(P<0.05)；6 d和9 d时，各处理均能显著抑制病斑直径扩展(P<0.05)；但9 d时，仅有1.0 μL/mL和2.0 μL/mL处理病情指数与对照有显著性差异(P<0.05)；12 d时，各处理均能显著性抑制杧果炭疽菌病斑扩展(P<0.05)，0.5、1.0、2.0 μL/mL处理组病情指数与对照组有显著性差异(P<0.05)。总体来看，2.0 μL/mL丁香精油处理效果最好，病斑直径仅为10.45 cm，病情指数为46.25，与其他处理有显著性差异(P<0.05)。由此可知，2.0 μL/mL丁香精油的处理效果最好，可有效抑制炭疽病害直径扩展。
表3 丁香精油对贵妃杧炭疽病病斑直径的影响
Table 3 Effect of clove essential oil on lesion diameter of anthracnose of ‘Guifei’ mango
注：表中同列标注字母不同表示差异显著(P<0.05)(下同)
处理病斑直径/mm3 d6 d9 d12 d0.0 μL/mL2.26±0.26ab6.91±0.33 a15.89±0.82a18.78±0.97 a0.2 μL/mL1.83±0.19b5.52±0.44b11.15±1.31 b13.51±0.86bc0.5 μL/mL2.87±0.23a5.20±0.48b11.78±0.74b15.09±0.92b1.0 μL/mL0.78±0.23cd3.78±0.30c10.32±0.64bc12.00±0.60cd2.0 μL/mL0.22±0.15d5.31±0.24b8.11±0.78 c10.45±0.69d4.0 μL/mL1.17±0.24c3.06±0.16c11.94±0.51 b14.76±0.58b
表4 丁香精油对贵妃杧炭疽病病情指数的影响
Table 4 Effects of clove essential oil on disease index of anthracnose of ‘Guifei’ mango
处理病情指数3 d6 d9 d12 d0.0 μL/mL19.63±0.37 a38.15±1.13a58.15±1.26a67.04±2.32a0.2 μL/mL20.00±0.00a28.89±2.78b48.89±5.33ab57.08±1.47b0.5 μL/mL20.00±0.00a28.89±2.36b52.22±2.55ab58.89±1.57b1.0 μL/mL12.59±2.59b22.22±1.57 c47.04±2.39b54.81±1.93b2.0 μL/mL4.44±2.94c19.17±0.83 c37.78±2.99c46.25±2.55c4.0 μL/mL15.56±2.94ab28.52±2.16b50.37±3.49ab59.26±0.49b
综合丁香精油对杧果炭疽病病斑直径和病情指数的影响，筛选出2.0 μL/mL为丁香精油最适处理浓度，并将其应用于贵妃杧采后品质试验。
2.3 丁香精油对贵妃杧自然发病的影响
贵妃杧在常温下贮藏，清水浸泡对照发病情况最严重，丁香精油处理和清水处理在病情指数上出现差异显著(表5)，在防效上，2.0 μL/mL丁香精油处理能够有效地防止贵妃杧采后自然病害的发生，能延长果实货架期。贮藏第9天时，贵妃杧开始自然发病，2.0 μL/mL 处理和对照病情指数达到显著差异水平，防效为54.59%；12 d时，2.0 μL/mL的防效下降至52.63%，下降幅度较缓，且病情指数差异显著；说明2.0 μL/mL处理对贵妃杧采后贮藏前期预防自然发病防治效果较好，贮藏后期出现自然发病现象后，防治效果减弱。
表5 丁香精油对贵妃杧采后炭疽病的影响
Table 5 Control effect of clove essential oil on postharvest anthracnose of ‘Guifei’ mango
处理9 d12 d病情指数防治效果/%病情指数防治效果/%CK4.58±1.10a/7.92±1.10a/2.0 μL/mL2.08±0.83b54.593.75±1.25b52.65
2.4 丁香精油对贵妃杧采后品质的影响
2.4.1 丁香精油对贵妃杧失重率的影响
随着贮藏时间的延长，处理和对照的失重率均逐渐变大，具体如图1所示。贵妃杧在整个贮藏期间，失重率逐渐增大，其中对照贵妃杧失重率最高，贮藏12 d 时贵妃杧的失重率为3.38%，而2.0 μL/mL处理的失重率仅为0.68%。从贮藏第6天开始，对照出现质量损失，而丁香精油2.0 μL/mL处理还未出现，且后面的贮藏期间失重率都显著低于对照(P<0.05)，说明丁香精油2.0 μL/mL处理可明显降低贵妃果实贮藏后期果实失重率的上升速度，从而达到抑制失重的效果。
图1 贵妃杧失重率的变化
Fig.1 Changes of weight loss rate of ‘Guifei’ mango
2.4.2 丁香精油对贵妃杧果实硬度的影响
丁香精油处理贵妃果实的硬度随贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势，对照呈下降趋势，如图2所示。2.0 μL/mL处理贮藏第3天时，其硬度出现上升，其硬度为21.35 kg/cm2，与对照出现显著差异(P<0.05)；在贮藏第6天时，2.0 μL/mL处理与对照达到差异显著水平(P<0.05)；在贮藏第9天时，对照与2.0 μL/mL处理硬度下降幅度变大，硬度分别为8.93 kg/cm2和，差异不显著(P>0.05)；贮藏12 d时，2.0 μL/mL处理出现硬度大幅度下降，其硬度为1.76 kg/cm2，与对照没有出现显著差异(P>0.05)；从整个贮藏阶段来看，2.0 μL/mL处理的硬度变化比对照的小，在贮藏过程中与对照保持有较大的硬度差异。
图2 贵妃杧果实硬度的变化
Fig.2 Changes of fruit hardness of ‘Guifei’ mango
2.4.3 丁香精油对贵妃杧TSS含量的影响
丁香精油处理对贵妃杧果实的可溶性固形物的影响如图3所示，2.0 μL/mL处理和对照的可溶性固形物含量在贮藏期间总体呈上升趋势。在贮藏第3天前，处理和对照可溶性固形物含量轻微下降，在贮藏时间为3～6 d时，处理和对照可溶性固形物含量呈上升趋势，且差异不显著(P>0.05),在第12天时，处理和对照可溶性固形物含量持续上升，且2.0 μL/mL 处理与对照出现显著差异(P<0.05)，可溶性固形物含量分别为13.52%、12.46%，结果表明贵妃杧贮藏过程中丁香精油处理的浓度对可溶性固形物含量的影响并不大，保持了贵妃杧正常的甜度变化。
图3 贵妃杧可溶性固形物含量的变化
Fig.3 Changes of soluble solids content of ‘Guifei’ mango
2.4.4 丁香精油对贵妃杧可滴定酸含量的影响
贵妃杧采后贮藏期间，丁香精油处理和对照的可滴定酸含量呈下降趋势如图4所示。在贮藏前6 d，对照的可滴定酸含量高于2.0 μL/mL处理，含量分别为2.28%和2.20%，含量间无显著差异(P>0.05)；贮藏6～12 d，2.0 μL/mL处理的可滴定酸含量高于对照，但差异不显著(P>0.05)。
图4 贵妃杧可滴定酸含量的变化
Fig.4 Changes of titratable acid content of ‘Guifei’ mango
2.4.5 丁香精油对贵妃杧维生素C含量的影响
如图5所示，丁香精油处理和对照贵妃杧果实的维生素C含量均随着贮藏时间的延长而降低，贮藏3 d时，2.0 μL/mL处理和对照维生素C含量下降最快，2.0 μL/mL处理维生素C含量为6.82 mg/100g，对照含量为4.80 mg/100g，差异显著(P<0.05)。贮藏6 d时，对照维生素C含量下降幅度较缓，为4.68 mg/100g，而2.0 μL/mL处理持续下降，维生素C含量为5.23 mg/100g，差异不显著(P>0.05)。贮藏9 d时，2.0 μL/mL处理和对照差异显著(P<0.05)。贮藏12 d时，2.0 μL/mL处理和对照维生素C含量分别为3.52和3.56 mg/100g，差异不显著(P>0.05)。总体来看，2.0 μL/mL处理的维生素C含量高于对照，说明浓度为2.0 μL/mL的丁香精油处理后，有效延缓了贵妃杧果实维生素C含量的下降，有效维持了贵妃杧果实的新鲜度。
图5 贵妃杧维生素C含量的变化
Fig.5 Changes of vitamin C content of ‘Guifei’ mango
3 讨论与结论
丁香精油对很多果蔬致病菌具有广谱抑制作用。王丹等[21]发现丁香精油在0.40～0.80 μL/mL可有效抑制灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(A.alternata)和胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的菌丝体生长。本试验测定10种植物精油对杧果炭疽菌(C.gloeosporioides)的菌丝体生长抑制作用，筛选出丁香精油抑制效果最好，与王丹等[21]结果一致，说明丁香精油具有抑制贵妃杧采后炭疽病的潜力。
丁香精油作为一种天然保鲜剂，对果蔬采后保鲜具有一定的增效作用。李宁等[22]研究发现丁香精油对圣女果具有较强的防腐效果，5.0 μL/mL丁香精油能显著抑制圣女果软腐病，提高好果率。李鹏霞等[23]发现丁香精油能够抑制苹果采后病害发生，减缓硬度下降的速度，并且能有效保持苹果的可滴定酸含量，有利于保持苹果的品质和风味；李宁等[24]发现0.50%丁香精油处理有助于抑制冬枣采后腐烂，提高抗病性，还具有较好的保鲜效果，保持冬枣品质；黄巍等[25]研究发现，贮藏期间0.60%丁香精油可有效抑制水蜜桃失重，并且有利于维持水蜜桃的可溶性固形物和维生素C含量。本试验结果表明2.0 μL/mL丁香精油处理能有效抑制贵妃杧刺伤接种后病情指数和自然发病病情指数；说明2.0 μL/mL丁香精油对杧果采后炭疽病具有良好的抑制效果；同时可明显抑制贵妃杧果实失重，减缓果实硬度下降，并且有效维持果实可滴定酸和维生素C含量，贮藏后期有较高的可溶性固形物含量。
综上所述，丁香精油对杧果炭疽菌(C.gloeosporioides)具有良好的抑制效果，能够作为杀菌剂应用于杧果采后病害防控，并且在一定浓度处理下，能有效维持杧果采后品质和风味。
植物精油对果蔬采后保鲜的研究报道越来越多，传统精油处理技术主要为精油浸泡法、喷洒法和熏蒸法，但在实际生产过程中的应用存在一些问题：(1)精油处理果实后，挥发性物质在果实表面残留，影响果实本身的风味；(2)在精油处理过程中，精油浓度过高或处理不当，会对果实造成药害。因此更高效的精油处理技术有待深入研究，如丁香油-壳聚糖复合抑菌剂、精油微胶囊化和抑菌纸法等，从而有利于在果蔬贮藏、运输和销售过程中控制质量安全，防止品质劣变。随着精油处理技术不断发展，植物精油开发利用的前景会越来越广阔。
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