水产品味道鲜美、营养丰富，富含高质量的动物蛋白、活性肽、维生素和微量元素等，具有较好的食品价值和营养价值，深受人民群众的喜爱[1]。随着城乡居民消费升级，人们对营养、健康食品的需求不断增强，水产品的消费比重不断增长，根据国家统计局数据显示，2020年全国水产品总产量高达6 549万t[2]。但由于水产品大多肌肉组织细嫩且蛋白质含量高，在加工或贮运过程中，极易发生腐败变质，直接影响水产品的销售价值、加工价值与食用安全性[3]，造成水产品品质下降。因此，新鲜度是衡量水产品品质的一项重要指标，对新鲜度进行快速而有效的检测在水产食品安全、贮藏、流通及加工过程有着重要意义[4]。
常见的水产品新鲜度检测方法可分为微生物检验、理化检验与感官检验等。尽管这些方法结果相对准确，但通常耗时较长、效率较低、成本较高和步骤繁琐，不能适应当下企业或商场的大规模使用[5]。近年来新型检测方法逐渐成为研究与应用的热点，如气味指纹技术、感官仿生、光谱技术和生物传感器等新型快速检测手段，这些方法具有速度快、无损检测和应用广泛的优点，但存在着价格昂贵、不便携带的缺陷性，阻碍了这些方法的广泛应用[6-8]。
因此，研发快速简便、准确价廉、适用范围广的水产品新鲜度快速检测方法对水产品产业发展具有着重要的现实意义[9]。近年来，鲜度指示剂逐渐成为重点关注对象，鲜度指示剂可通过直观的颜色变化反映食品的新鲜程度，基于鲜度指示剂可实现对水产品新鲜度的快速检测，具有较好的应用潜力[10]。因此，本文将主要综述基于鲜度指示剂的水产品新鲜度快速检测方式的研究进展，并讨论其应用前景和所面临的挑战，为进一步的应用和研究提供理论参考。
1 基于鲜度指示剂的水产品新鲜度快速检测方法概述
1.1 基于鲜度指示剂的水产品新鲜度快速检测方法的定义与机理
食品在加工、贮运过程中，在自身和环境因素的作用下会发生复杂的化学与生物化学变化，并且在微生物的作用下，食品的新鲜度不断下降，并产生与之相关的产物，例如果蔬类产生的乙烯、肉类产生的硫化氢等。鲜度指示剂本质上是一种可以与鲜度和品质变化产生的化学物质发生反应，并产生相应颜色变化的物质，通过颜色变化程度可判断食品的新鲜程度。基于鲜度指示剂这种关联性，可实现对食品新鲜度的检测，这种检测方法具有快速实时、非破坏性、成本低、器具小和易操作等特点，近年来受到大量关注，并且成功应用于鲜肉和水果等食品的新鲜度检测中[10-12]。
在基于鲜度指示剂的水产品新鲜度快速检测方法中，由于水产品在微生物和酶的作用下不断腐败变质，蛋白质等成分逐渐被分解产生如氨气、二甲胺、三甲胺和生物胺等产物并伴随着pH值的变化，常采用花青素、溴甲酚紫等可与这些产物或发生显色反应的指示剂，将其与固定载体结合制作试纸、标签和包装等形式，通过指示剂的颜色变化便可判定水产品的新鲜度[13-15](图1)。
图1 基于新鲜度指示剂进行水产品新鲜度快速检测的机理示意图
Fig.1 Mechanism of rapid freshness detection of aquatic products based on freshness indicators
1.2 基于鲜度指示剂的水产品新鲜度快速检测方法的的分类与特点
水产品腐败时，产生大量挥发性碱性含氮物(盐基氮)，使水产品新鲜度变化过程总是伴随着酸碱度的变化，因此大部分水产品鲜度指示剂检测法使用酸碱度(pH值)感知型指示剂，例如花青素和姜黄素等天然提取物型指示剂和溴甲酚紫、溴百里香酚蓝等化学染料型指示剂。除此之外，还有对水产品腐败过程中其他成分敏感的腐败化学成分敏感型指示剂，例如基于微生物作用(蛋白质分解)的代谢产物(挥发性胺)敏感的光敏感分子[10,16]。
水产品鲜度指示剂检测法应用研究中，指示剂通常与固定载体结合制作成检测试纸、指示标签和智能包装等形式，除进行快速新鲜度检测外，通过标签和包装的实时颜色变化，可以实时监测食品在贮藏、运输、销售过程中新鲜度变化[17]。其中，固定载体作为指示剂的载体及反应支承物，常选用如纤维素、琼脂和聚氯乙烯等材料，以保持反应灵敏性、提高指示剂稳定性和拓展指示剂的功能[18]。近年来基于鲜度指示剂进行水产品快速新鲜度检测的研究备受关注(表1)，本文汇总此方面的研究与应用动态，以作比较系统的阐述和总结。
表1 基于鲜度指示剂的快速检测在水产品中的应用
Table 1 Application of freshness indicator based rapid detection in aquatic products
指示剂类型敏感材料载体检测对象指示物制备方法颜色变化特点与优势参考文献天然提取物紫薯花青素大豆分离蛋白草鱼(H+)流延法棕黄色→黄绿色颜色变化明显,具有一定保鲜效果[19]京穗葡萄花青素竹芋淀粉/碘卡拉胶基薄膜虾(H+)浸渍烘干紫色→浅绿色→黄色具有较高的热稳定性[20]红甘蓝花青素羧甲基壳聚糖/氧化海藻酸钠鲈鱼、草鱼(H+)丝网印刷法紫色→蓝色→绿色结合BP(back propagation)神经网络,可用手机识别并获取新鲜度信息[21]玫瑰茄色素壳聚糖和玉米淀粉白花鱼(H+)流延法紫红→绿、ΔE>16.56颜色变化明显和指示效果好[22]姜黄素琼脂和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)罗氏沼虾(H+)水凝胶膜无墨印刷方法黄色→红色/橙色颜色变化明显和稳定性优良[23]姜黄素和花青素淀粉、PVA和甘油鲢鱼(H+)--稳定性良好[24]改性玫瑰茄花青素PVA和聚丙烯鲳鱼(H+)旋涂法由深红色→淡紫色, 淡紫色→浅绿色颜色变化明显和与样本品质有较强关联[25] 美丽蓝蓟提取物细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)虾(H+)移位法紫罗兰色→灰色→黄色颜色变化明显[26]紫甘薯花青素羧甲基纤维素和淀粉草鱼(H+)混合匀浆干燥红色→蓝色无毒、可生物降解和颜色变化明显[27]菊芋花青素壳聚糖和PVA虾(H+)混合浇铸红色→蓝色颜色变化明显[28]紫草根提取物琼脂团头鲂(H+)浇铸/溶剂挥发法粉红色→紫色颜色变化明显[29]紫草素纤维素薄膜鲭鱼(H+)浸渍镀膜法红色→深蓝色颜色变化明显、稳定灵敏和方便直观[30]
续表1
注：-表示无数据
指示剂类型敏感材料载体检测对象指示物制备方法颜色变化特点与优势参考文献黑胡萝卜花青素BC虹鳟鱼和鲤鱼(H+)浸渍烘干深胭脂色→粉红色→果冻豆蓝色、卡其色颜色变化明显、制备简单、成本低和方便环保[31]茜素淀粉和纤维素虹鳟鱼(H+)浸涂法橙色→红棕色颜色变化明显和安全环保[32]黑米糠花青素氧化甲壳素纳米晶和明胶鱼和虾(H+)混合干燥紫色→灰蓝色/棕色颜色变化明显和具有保鲜能力[33]蝴蝶豌豆花青素明胶/琼脂聚合物/氧化锌纳米颗粒虾(H+)浇铸法粉红色→紫色→绿色良好的颜色稳定性和颜色可逆性,具有较强的抗氧化活性[34]蓝莓花色苷马铃薯淀粉/硫磺软骨素虾(H+)混合干燥粉红色→浅灰→灰绿色颜色变化明显[35]紫甘薯花青素滤纸虾(H+)浸泡粉色→绿色颜色变化以“基于距离”的变化方式逐渐发生[36]纯化矢车菊素-3-糖苷细菌纤维素罗非鱼(H+)浸泡干燥玫瑰红→紫色→淡紫色颜色变化明显[37]紫甘薯提取物和红甘蓝提取物淀粉和PVA虾(H+)浇铸法亮红色→蓝色颜色变化明显、色泽鲜艳、力学性能好和透光率低[38]化学染料溴酚红和溴甲酚紫滤纸鲤鱼(H+)浸染吸附法橙色→紫色成本低廉 [39]溴麝香草酚蓝玉米醇溶蛋白金枪鱼(H+)静电纺丝技术橙黄色→墨绿色→深蓝色颜色变化明显和稳定性良好[40]复配溴甲酚紫甲基红甲基纤维素共混改性PVA南美白对虾(H+)流延浇铸法红褐色→紫褐色→黑色颜色变化明显,具有最强的机械性能、疏水性能及阻隔性能[41]金属有机框架Cr-MIL-101-溴麝香草酚蓝醋酸纤维素(cellulose acetate,CA)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)4000 草鱼(H+)薄膜分散法黄色→绿色颜色变化明显和较为安全[42]溴甲酚紫和溴百里香酚蓝滤纸青鱼(H+)浸泡粘附黄色→蓝紫色可较好识别新鲜度[43]其他麦氏酸活化呋喃聚氯乙烯白鲫鱼和鲈鱼挥发性胺旋涂法黄色→紫红色颜色变化明显、易制备和成本低[44]苯重氮磺酸盐stimuli-reponsive polymer polyaniline-鲜鱼组胺操作简便 [45]聚合物聚苯胺(stimuli-re-sponsive polymer polyani-line,PANI)和四苯乙烯(tetraphenylethylene,TPE)-鲜鱼碱性胺浸渍镀膜法翡翠绿→孔雀蓝敏感度和准确性较高[46]
2 基于鲜度指示剂的水产品新鲜度快速检测的应用研究
2.1 基于化学染料型指示剂的水产品新鲜度检测
2.1.1 不同化学染料型指示剂的应用进展
酸碱度(pH值)感知型指示剂中的化学染料型指示剂，具有价格低廉、性质稳定和可工业化生产的特点，在肉制品的新鲜度检测中有应用广泛[47]。在水产品新鲜度检测中，化学染料型指示剂多为溴甲酚绿、溴甲酚紫和溴麝香草酚蓝(bromothymol blue, BTB)等化学染料。例如何华鹏等[43]利用溴甲酚紫和BTB作为鲜度指示剂，分别制作2种智能标签，用于青鱼(Mylopharyngodon piceus)的新鲜度检测，随着青鱼的腐败变质，2种指示标签的颜色变化与挥发性盐基氮结果均具有显著相关性，其中溴甲酚紫标签在青鱼超过二级新鲜度(挥发性盐基氮>20 mg/100g)时颜色从亮黄色变成蓝紫色，可较好辨识出青鱼的新鲜度。而BTB标签虽然颜色变化也较明显，但平滑性和准确性相较于溴甲酚紫标签略有不足。
单一的化学染料指示剂往往变色范围窄，颜色过渡不平滑，利用化学染料的复配可在一定程度上提高指示效果。例如黄佳茵等[41]采用溴甲酚紫和甲基红溶液3∶2比例，以复配溴甲酚紫甲基红作为鲜度指示剂制备鲜度指示膜，用于南美白对虾(Litopenaeus vannamei)的实时新鲜度监测。虾在冷藏条件下贮藏4 d，指示膜颜色由红褐色转为紫褐色，对应次级鲜度，随后在贮藏第8天完全腐败时转变为黑色，不同鲜度等级指示膜颜色存在明显差异且与鲜度化学指标显著相关，相较于单一化学染料指示剂具有更为优良的指示效果。
2.1.2 化学染料型指示剂的安全性研究
化学染料通常具有明显的毒性，如亚甲基蓝和甲基溴易导致新生儿贫血症、高胆红素血症等[48]，特别是容易发生染色液迁移现象，化学染料容易从固定载体迁移到食物上，对食品的安全性具有较大的威胁，有学者通过加强固定的方法来增强化学染料指示剂的稳定性和安全性。例如WANG等[42]利用金属有机框架Cr-MIL-101接枝BTB，以CA和PEG-4000为载体制作的指示标签，离子键和多孔构架阻止染色迁移和改善着色稳定性。不仅在草鱼(Ctenopharyngodon idella)的新鲜度检测中表现出明显的颜色变化，安全性也一定程度上得到提高；张星辉等[40]利用静电纺丝技术，制备BTB/玉米醇溶蛋白比色标签，具有良好的微观结构和化学稳定性，在有效监测黄鳍金枪鱼(Thunnus albacores)新鲜度的同时也具有较好的安全性。
虽然关于化学染料鲜度指示剂的应用与改善有一定的研究，但安全隐患依然突出，食品安全问题较难避免，并且化学染料难以降解，潜在的环境问题也较为严重，商业应用上受到很大的限制。因此目前研究的重点开始偏向寻求无毒灵敏的敏感材料[49]。
2.2 基于天然提取物型指示剂的的水产品新鲜度检测
天然提取物型指示剂常选用从植物中提取的具有pH响应变色特性的提取物，相较于化学染料，具有来源广泛、无毒无害、可降解的特点，并且还具有一定的抗菌和药理作用，因此逐渐成为目前水产品新鲜度指示剂研究的重点关注对象[18,50]。
2.2.1 不同天然提取物型指示剂的应用进展
天然提取物种类多样，目前用来开发指示剂的主要有花青素、姜黄素、茜草色素、紫草素等，每种提取物均具有不同的特性，近年来有大量利用不同天然提取物进行水产品新鲜度检测的研究。
花青素是一种多酚类的黄酮化合物，在植物中分布广泛，已知存在600多种，花青素的黄酮离子对pH的变化有极高敏感性，可产生显著的颜色变化，并且具有一定的抗菌作用，是天然提取物型指示剂的极佳来源，近年许多研究都集中在采用不同花青素用于水产品新鲜度的检测[13]。例如MORADI等[31]以黑胡萝卜花青素作为鲜度指示剂制作的指示标签，在pH 2～11范围内表现出从红色到灰色的明显色差，肉眼可清晰识别。在鲤鱼(Cyprinus carpio)和虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的新鲜度检测中具有良好的颜色变化，并且与细菌总数和挥发性盐基氮结果具有正相关性，有很好的应用潜力；MERZ等[28]采用蒲桃花青素作为指示剂制作的指示膜，用于南美白对虾的新鲜度检测，结果表明不同时间(0～93 d)和温度(-20～20 ℃)下，显示出从红色到蓝色的明显变化，可用于监测虾的新鲜度。
姜黄素是从姜黄中提取的一种酚类物质，除对pH具有敏感性外，还具有抗菌抗氧化的作用，不仅可作为鲜度指示剂，还可以提供一定的保鲜作用[51-52]。ZHANG等[23]用姜黄素作为鲜度指示剂，制成一种水凝膜指示薄膜，用于对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的新鲜度检测，随着对虾贮藏时间的延长，呈现出由黄色到红色的明显颜色变化，并且与挥发性盐基氮也具有相关性，可为罗氏沼虾的新鲜度提供了一种有效的鲜度显示计。
除此之外，利用不同天然提取物作为指示剂进行水产品新鲜度检测的研究多种多样，例如MOHAMMADALINEJHAD等[26]采用蓝蓟花天然染料制成的指示剂对独角新-9-对虾(Metapenaeus monoceros)进行新鲜度监测，肉眼可明显分辨出从紫罗兰色(新鲜)到灰色(半新鲜)再到黄色(变质)的颜色变化，并与菌落总数和挥发性盐基氮测定结果一致；HUANG等[29]以紫草根天然染料制备鲜度指示膜，可通过颜色变化来指示团头鲂(Megalobrama amblycephala)的变质情况，而且相较于花青素指示剂更具有稳定性，在鱼类的实时新鲜度检测上有很好的效果。
2.2.2 天然提取物型指示剂稳定性研究
天然提取物指示剂一般安全性较好，但也存在较大缺陷，多数天然提取物的稳定性较差，易受到温度、pH、O2、光照和金属离子等外界因素的影响，如花青素容易与自由电子或活性氧基结合，在实际应用中易受到限制[53]。常通过改变基质材料和制备方法来增加天然提取物指示剂的稳定性和分散均匀性，例如添加壳聚糖、聚乙烯醇和羧甲基纤维素等材料，以及采用溶液浇铸、纳米颗粒包埋法等方法[54-55]。
通过不同基质材料与花青素结合的特性，可提高花青素在贮存和检测过程中的稳定性和准确性。例如JIANG等[27]将羧甲基纤维素/淀粉与紫甘薯花青素复合，通过产生的新相互作用，不仅提高鲜度指示薄膜的拉伸强度和厚度，也降低了断裂伸长率、含水率和透光率。在稳定性测试中，指示薄膜20 d后仍可保持颜色稳定，并且在草鱼的新鲜度检测中也具有良好的指示效果。GE等[33]以氧化甲壳素纳米晶/明胶为载体，再与黑米糠花青素复合制备一种具有pH敏感性和抗氧化活性的纳米复合膜, 具有特异的紫外-可见光阻光性和抗氧化性。在带鱼(Trichiurus lepturus)和对虾的新鲜度检测应用研究中，也具有良好的颜色变化。除了利用基质材料的特性外，制备方法也具有重要影响，如MERZ等[28]在制备花青素鲜度指示剂膜时，以壳聚糖、PVA为基质来稳定花青素，并且采用溶液浇铸法，可避免花青素受到高温而分解，有利于提高花青素的稳定性。
基于天然提取物的水产品新鲜度指示剂不仅安全性高，而且简单快速灵敏，相关的研究进展很快，具有极高的应用潜力。然而天然提取物的提取技术相对不成熟，而且由于稳定性较差，需要和载体复合提高稳定性，并且相关制备技术也不成熟，不具备大规模生产条件，仍面临重大挑战。因此，虽然目前相关研究较多，但天然提取物指示剂的应用还处于实验室阶段，仍需要进一步完善，以实现工业化生产和应用。
2.3 基于其他鲜度指示剂的水产品新鲜度检测
由于酸碱度(pH值)感知型鲜度指示剂的敏感性较高，受环境影响较大，尤其是水产品的pH值变化并非完全线性、pH值与新鲜度的特异性较差，易产生错误结果。因此，寻求其他类型的鲜度指示剂也是目前重点的研究方向之一。
例如对挥发性胺具有高特异性、高灵敏响应的传感材料麦氏酸活化的呋喃(meldrum′s activated furan, MAF)，可与胺类化合物发生开环反应，形成光敏感分子。李宁等[44]以麦氏酸活化呋喃和聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)为挥发性胺指示剂和载体，制备一种用于检测鱼肉新鲜度的MAF/PVC薄膜，结果表明MAF/PVC薄膜的色差值(ΔE)变化与样品中挥发性盐基氮含量具有较好相关性，可准确和快速指示鱼肉的新鲜度，并且易于制备、成本较低，在水产品新鲜度检测中有良好的应用前景。LIU等[46]利用刺激响应型PANI和TPE的聚集诱导发射特性，研制一种新型比色荧光双模传感标签，不仅可显示鱼变质过程中颜色变化，且可通过紫外光下荧光信号的变化定量评估鱼类的新鲜度。然而，尽管这类鲜度指示剂加工简单、成本低廉，但安全性差，灵敏性和精确度也有待提高。
2.4 基于鲜度指示剂的水产品快速新鲜度检测智能化显示研究
鲜度指示剂的数字化、智能化应用也是当前的热点研究，相较于人眼识别，计算机对颜色变化更加敏感和准确，将含指示剂的标签、膜、包装等载体与食品一起保藏，其显色变化和条形码、传感器等智能技术相结合，通过智能设备可更直观清晰地展现新鲜度的状态[56]。如FANG等[21]通过丝网印刷法制作的红甘蓝花青素比色标签，通过BP神经网络训练来确定标签颜色与挥发性盐基氮值之间的关系，消费者可通过手机快速、准确的识别标签以确定鱼类的新鲜度，准确率可达到92.6%。
3 结语
基于鲜度指示剂的快速测定凭借其高效、操作简单、成本低廉等优势，在水产品新鲜度快速检测应用方面受到广泛关注。基于pH变化的鲜度指示剂是主要研究热点，但在实际应用中还存在一些问题：
(1)目前大多指示剂的原理都是依据水产品腐败产生的酸碱度变化，而pH值的变化对新鲜度不够准确，一些新鲜度高的鱼pH值往往先下降后上升,而不是单调变化，并且环境因素如湿度、温度以及包装的密封性都会对指示剂的准确性产生影响；(2)化学染料指示剂往往存在安全隐患，而天然色素提取物指示剂则稳定性不佳，在实际应用上存在困难；(3)一些指示剂的颜色变化反应是可逆转的，易造成错误的指示。
基于上述问题，水产品鲜度指示剂可在如下方面做进一步研究：(1)研发新型稳定、安全的敏感材料，例如对某些生物胺特异性、敏感性均较好的指示剂；(2)提高鲜度指示剂的稳定性、响应速度与灵敏性；(3)寻求更稳定、安全的固定载体与制备工艺，提高检测的安全性与稳定性；(4)基于鲜度指示剂制作的实时指示智能标签、包装对环境有较高要求，准确性容易受到影响，可以尝试将气调包装技术与活性包装技术有机结合，弥补存在的问题。
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