蓝靛果忍冬(Lonicera caerulea)又名蓝靛果、黑瞎子果等，属于忍冬科忍冬属落叶灌木，具有较强抗寒能力和抗病性，原产于俄罗斯东北部、日本北海道、中国东北等地区。蓝靛果忍冬果实富含矿物质、维生素、氨基酸等营养成分和花色苷、类黄酮等活性物质，是一种兼备营养价值与医疗保健价值的新兴浆果[1-3]。蓝靛果忍冬果实具有种小皮薄、出汁率高、颜色饱和度极高等特性，是制作果汁的良好原料，但因其果实具有调配无法掩盖的苦味[4]，且传统热杀菌技术会破坏果汁的营养成分、风味等[5]，以致目前市场上尚未出现风味可被消费者接受的蓝靛果忍冬果汁产品。因此，为进一步开发利用蓝靛果资源，需在加工过程中加入脱苦环节以改善不良口感，选择适宜的杀菌技术，才能更好地保留果汁中的营养物质，改善风味。
目前，用于果汁苦味物质的脱除方法主要有吸附法、β环糊精包埋法、酶解法等，但这些方法还具有明显的缺点。例如，β环糊精包埋法只能去除果汁中部分特定成分的苦味，酶解法因其需要温和的条件而限制了在工业化上的应用[6]。活性炭是一种极佳的吸附剂，具有孔隙结构发达、比表面积大、表面官能团种类繁多、性能稳定、可再生等吸附优势，常应用于食品脱色、脱味[7]。超高压杀菌技术(ultra-high pressure processing，UHP)是指在常温条件下，将食品置于100～1 000 MPa的超高压设备中从而实现灭酶、杀菌的目的。与热杀菌相比，UHP极大地避免了热处理带来的营养成分损失和理化性质的不利变化[5]。但是单一超高压杀菌所需压力较高，对设备要求严格，使其杀菌成本过高，难以在食品工业中普遍推广。因此超高压联合温度杀菌(温-压联合)技术是一种有效手段，达到良好杀菌效果的同时更好的保留食品中的营养物质[8]。鉴于此，本试验首次对蓝靛果忍冬果汁进行脱苦研究，使用HPLC-MS/MS定性和定量分析蓝靛果忍冬果汁中的苦味物质，以活性炭为脱苦剂进行吸附脱苦，并探究温-压联合技术对蓝靛果忍冬果汁杀菌效果及贮藏期稳定性的影响，为蓝靛果忍冬的开发与利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蓝靛果忍冬购自辽宁省丹东市，于-20 ℃冰箱保存。乙腈(色谱级)，赛默飞世尔有限公司；甲酸、没食子酸、福林酚、氯化钾、无水碳酸钠(均为分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；活性炭(食品级)，平顶山绿林活性炭有限公司；醋酸钠(分析纯)，西陇化工股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Agilent6530-1290液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪、XDB-C18色谱柱，安捷伦公司；JYL-C010打浆机，九阳股份有限公司；L3660D低速离心机，上海知信实验仪器有限公司；TS-100B摇床，天呈仪器有限责任公司；ATC手持折光仪，上海勃基仪器仪表有限公司；UV-6100分光光度计，上海元析仪器有限公司；PHSJ-3F pH计，上海精科仪器公司；SC-80全自动色差计，北京仪康光光学仪器有限公司；Asrree Ⅱ/LS16电子舌，法国Alpha MOS公司。
1.3 实验方法
1.3.1 果汁样品制备
蓝靛果忍冬于室温下解冻，然后按照果实与水质量比1∶7放置于榨汁机内，打浆30 s，6层纱布过滤果渣，4 000 r/min离心10 min，上清液即为蓝靛果忍冬果汁。
1.3.2 苦味物质分析及果汁脱苦
1.3.2.1 色谱和质谱条件
色谱柱：XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；流动相：溶剂A为0.1%甲酸溶液，溶剂B为乙腈溶液；流速1 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL；梯度洗脱程序：0～15 min 10% B，15～25 min 60% B，25～35 min 70% B；254 nm下进行检测。
质谱仪型号：LCMS-IT/TOF；检测器：PDA检测器；离子源：ESI(电喷雾离子源)；检测模式：负离子模式；离子源温度：300 ℃；采用全自动二级质谱扫描100～1 200 m/z。
1.3.2.2 果汁脱苦
准确量取蓝靛果忍冬果汁200 mL于锥形瓶，加入6%活性炭混匀，置于摇床上进行脱苦，脱苦时间为65 min，脱苦温度为45 ℃，然后用4层纱布过滤，4 000 r/min离心10 min除去果汁中的活性炭，获得澄清果汁。苦味物质含量用脱苦前后液相色谱中苦味物质峰面积的变化表示[9]。
1.3.3 温-压联合处理杀菌工艺筛选
根据前期预实验的结果，经感官评价，得到蓝靛果忍冬果汁配方为蓝靛果忍冬添加量6.67%，蔗糖添加量14%，柠檬酸添加量0.1%，三氯蔗糖添加量0.04%(均为质量分数)。将果汁装入无菌采样袋内，然后置于超高压设备中，根据前期预试验结果，将压力设置为200、300、400 MPa，处理时间3 min，经超高压处理后分别于40、50、60 ℃下各加热2、5、8 min，迅速冷却至室温，测定其杀菌效果。以致死率表示杀菌效果[9]，确定所有可行的温-压联合杀菌条件。
1.3.4 蓝靛果忍冬果汁贮藏期稳定性测定
将经上述所有可行杀菌条件处理的果汁于4 ℃冰箱内贮藏35 d，每隔7 d测定贮藏期菌落总数变化，筛选出满足安全保质期的温-压联合杀菌条件，并对其贮藏期内营养物质及理化特性进行检测。菌落总数的测定参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》的方法，结果以对数记。
1.3.5 生理指标测定
花青素含量测定：采用双波长pH示差法[10]。以矢车菊素3-O-葡萄糖苷为参照。取1 mL果汁加去离子水稀释10倍，加入pH 1.0的KCl缓冲液3 mL；再取1 mL果汁稀释10倍，加入pH 4.5的醋酸钠缓冲液3 mL，均于暗处静置反应1 h，然后用紫外-可见分光光度计分别测定510 nm和710 nm处吸光值。花青素含量的计算如公式(1)和公式(2)所示：
(1)
A=(A510-A710)pH=1.0-(A510-A710)pH=4.5
(2)
式中：X，花青素含量，g/L；A，样品在pH 1.0和pH 4.5 缓冲液体系中测得的吸光度之差；M，矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子质量(449.2)；ε，矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数(29 600)；F，测试溶液的稀释倍数；L，比色皿距离(1 cm)。
总酚含量测定：采用福林酚法测定[11]。取1 mL提取液，加入1 mL 福林酚试剂、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，用去离子水定容至10 mL，混匀后在室温下暗反应60 min，然后用紫外分光光度计测定其在765 nm处的吸光值计算总酚含量，计算如公式(3)所示：
(3)
式中：M，样品中的多酚含量，mg/g；C，样品待测液中的多酚质量浓度，μg/mL；V，样品待测液的体积，mL；N，稀释倍数；m，样品质量，g。
pH和可溶性固形物含量测定：分别使用阿贝折光仪和pH计测定果汁中可溶性固形物含量和pH值。
果汁褐变度测定：采用分光光度法测定果汁褐变度。
1.3.6 电子舌分析果汁风味变化
采用电子舌结合主成分分析检测未经脱苦处理的蓝靛果果汁样品(WTK)、脱苦后未经调配的果汁样品(WTP)、调配后未杀菌的果汁样品(YTP)、杀菌处理后的果汁样品(YMJ)、4 ℃贮藏35 d的果汁样品(YZC)的风味变化。
1.4 数据分析
试验数据采用Origin 2018进行统计并绘图；采用SPSS 25.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 苦味物质的鉴定及脱苦效果
利用HPLC-MS/MS技术共检测到蓝靛果忍冬果汁中3种苦味物质[12-13]，如图1所示。第一种是马钱苷酸(C16H24O10)，根据检测到的一级质核比375.131 5，确定[M-H]-为母离子，通过二级质谱(图1-a)分析，检测到特征子离子对应的二级质谱质核比为149.060 7、167.071 2、179.057 0、193.051 7、211.061 4、241.119 7、347.334 5和373.115 5，保留时间为7.629 min。第二种是开联番木鳖苷(C17H24O10)，根据检测到的一级质核比433.137 6，确定[M+HCOO]-为母离子，通过二级质谱(图1-b)分析检测到特征子离子对应的二级质核比为153.091 9、161.045 9、205.122 9、223.135 0、269.046 5、385.188 6、392.427 7、431.193 8和480.871 4，保留时间为21.431 min。第三种是马钱苷(C17H26O10)，检测到一级质核比435.132 6，确定[M+HCOO]-为母离子的准分子离子，通过二级质谱(图1-c)分析检测到特征子离子对应的质核比为151.002 7、271.061 9、295.067 4、313.075 7、360.358 9和 433.120 2，保留时间为24.355 min。
a-马钱苷酸；b-开联番木鳖苷；c-马钱苷
图1 苦味物质质谱图
Fig.1 Mass spectrum of bitter substances
苦味物质含量可以用高效液相色谱法测定并以峰面积表示[14]，吸附过程中，活性炭吸附剂的孔径与吸附质分子或离子的几何尺寸需要有一定的匹配。本试验检测到的未经脱苦的果汁中3种苦味物质在高效液相色谱图中总面积为5.03×105，而经活性炭脱苦后苦味物质总面积为3.08×105，降低了39%，可能是由于此实验所用食品级活性炭的孔径与苦味物质大小吻合[7]，因此利用活性炭对蓝靛果果汁产生良好脱苦效果。
2.2 温-压联合处理对蓝靛果果汁杀菌效果的影响
温-压联合处理对蓝靛果果汁杀菌效果的影响如图2所示。200 MPa条件下的温-压联合杀菌效果均低于2.5 lg，且优于单独超高压(1.03 lg)；300 MPa联合60 ℃ 5 min/8 min、400 MPa联合50 ℃ 5 min/8 min、60 ℃ 2 min/5 min/8 min处理后的果汁，微生物的致死率均达到2.78 lg，此时趋近于无菌状态，且均优于单纯的超高压杀菌(300 MPa，1.73 lg；400 MPa，1.95 lg)和热杀菌(1.5 lg)。这说明温-压联合杀菌能够显著降低果汁中的微生物数量，且杀菌效果与超高压压力、处理时间和温度等有关。因此，选择300 MPa联合60 ℃ 5 min/8 min，400 MPa联合50 ℃ 5 min/8 min、60 ℃ 3 min/5 min/8 min以及单独热杀菌、超高压组为对照进行贮藏期稳定性检测，进一步筛选最佳杀菌条件。
a-200 MPa；b-300 MPa；c-400 MPa
图2 不同处理条件对微生物致死率的影响
Fig.2 Effects of different treatment conditions on the microbial lethality
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
2.3 温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期稳定性的影响
2.3.1 温-压联合处理对果汁贮藏期间菌落总数的影响
温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间菌落总数的影响如表1所示。4 ℃贮藏条件下，组1、组2温-压联合处理组及组8、组9对照组贮藏至第21天时，菌落总数增至不可计数，>100 CFU/mL，说明300 MPa温-压联合处理(组1、组2)、单一超高压处理(组8)及热杀菌处理(组9)的果汁在贮藏期内不满足食品卫生标准GB 7101—2015中对于果蔬汁菌落总数100 CFU/mL的要求，而400 MPa温-压联合处理组(组3～组7)在整个贮藏期内菌落总数小于或等于1 CFU/mL，可以在4 ℃条件下贮藏35 d。故选组3～组7及组8、组9的前14 d作为贮藏期试验处理条件，后续生理指标的测定以此7组进行。
表1 温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间菌落总数的影响 单位：CFU/mL
Table 1 Effect of temperature-pressure combined treatment on the total number of colonies in juice during storage
注：un：菌落总数多不可计;组1：300 MPa 3 min-60 ℃ 5 min，组2：300 MPa 3 min-60 ℃ 8 min，组3：400 MPa 3 min-50 ℃ 5 min，组4：400 MPa 3 min-50 ℃ 8 min，组5：400 MPa 3 min-60 ℃ 2 min，组6：400 MPa 3 min-60 ℃ 5 min，组7：400 MPa 3 min-60 ℃ 8 min，组8：超高压组(400 MPa 3 min)，组9：热杀菌组(60 ℃ 3 min)
贮藏时间/d组1组2组3组4组5组6组7组8组9730.00±2.082.00±0.580000011.00±1.5234.00±3.051428.00±2.3120.00±3.601.00±0.001.00±0.0000024.67±1.7660.67±4.2621unun1.00±0.581.00±0.00000unun28unun1.00±0.581.00±0.58000unun35unun1.00±0.581.00±0.00000unun
2.3.2 温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间总酚和花青素含量的影响
温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间总酚和花青素含量的影响如图3所示。在4 ℃贮藏条件下，温-压联合处理组(组3～组7)的果汁中总酚含量均呈先增加后降低的趋势，且贮藏末期其含量略高于初始含量，这可能是前期苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)发挥主要作用而促进了酚类物质的合成，导致总酚含量增加。贮藏后期PAL等受到反馈抑制，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等用于多酚氧化的酶发挥主要作用，同时伴随着酚类物质与蛋白质的聚合，导致总酚含量逐渐下降[15]。而超高压组(组8)和热杀菌组(组9)在前14 d 总酚含量与温-压联合处理组无明显差异。这表明温-压联合处理可以有效维持果汁贮藏期间的总酚含量。
a-总酚含量；b-花青素含量
图3 温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间总酚和花青素含量的影响
Fig.3 Effects of temperature-pressure combined treatment on the contents of total phenols and anthocyanin in juice during storage
4 ℃贮藏条件下温-压联合处理组(组3～组7)的果汁中花青素含量在前14 d内呈下降趋势，然后趋于较弱回升状态，这可能是贮藏前期花青素与酚类化合物(如阿魏酸和丁香酸)发生氧化和缩合使其含量降低，贮藏后期酚类物质减少使得氧化和缩合反应分解进而释放了花青素，此外贮藏期内果汁pH、金属离子等因素的变化也会影响花青素稳定性[5,16]。不同处理组果汁中花青素含量基本一致，说明不同温-压联合处理条件对果汁贮藏期间花青素含量变化的影响无差异。而贮藏期内前14 d热杀菌处理组(组9)高温破坏了花青素稳定性以致其含量低于温-压联合处理组，说明温-压联合处理可以有效延缓蓝靛果忍冬果汁贮藏期内花青素含量的降低。
2.3.3 温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间pH、可溶性固形物和褐变度变化的影响
温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间pH、可溶性固形物和褐变度变化的影响如图4所示。4 ℃ 贮藏条件下不同的温-压联合处理组(组3～组7)及贮藏期前14 d超高压组(组8)、热杀菌组(组9)pH值变化趋势基本一致，且在贮藏期内略有下降。果汁中酸和钾盐(如柠檬酸钾和苹果酸钾)易形成缓冲溶液，导致pH变化不显著，但果汁在贮藏期内营养成分的改变也会伴随pH值的改变。邓红等[17]发现超高压处理的猕猴桃果浆pH值随着贮藏时间延长而降低，与本研究的结论一致，这可能是由于高压处理使果汁中的果胶酶分解，在贮藏期间形成果胶酸而使其酸性提高导致pH降低。可溶性固形物是衡量蓝靛果果汁品质的重要指标。超高压组(组8)、热杀菌组(组9)及不同温-压联合杀菌(组3～组7)处理后的果汁可溶性固形物含量在整个贮藏期间无明显变化，始终维持在(12±0.1)Brix。有研究表明经超高压处理的石榴汁[18]在贮藏期间也维持稳定的可溶性固形物含量。不同温-压联合处理组(组3～组7)的果汁贮藏至28 d时褐变度逐渐升高，然后趋于稳定，这可能是由于果汁中发生多酚氧化物的氧化缩合和降解反应，贮藏前期多酚物质的合成为酶褐变的发生提供了原始底物，贮藏后期随着多酚类物质含量的下降，酶促褐变也趋于停滞[19]。此结果与超高压杀菌处理冷破碎猕猴桃果浆贮藏期间褐变度的变化一致[17]。而贮藏期前14 d热杀菌组(组9)褐变度要高于温-压联合处理组及超高压组(组8)，这说明温-压联合杀菌可以有效延缓褐变度的升高。
a-pH值；b-可溶性固形物；c-褐变度
图4 温-压联合处理对蓝靛果忍冬果汁贮藏期间pH、可溶性固形物和褐变度的影响
Fig.4 Effects of temperature-pressure combined treatment on the pH, soluble solids and browning degree in juice during storage
2.4 不同加工阶段的果汁样品电子舌分析结果
电子舌模拟人体味觉系统是近年来分析滋味的新型检测手段，其原理是将测试样品的电势值转化为味觉进而对味道进行综合信息评价[20]。不同加工阶段的果汁样品电子舌分析结果如图5所示。根据电子舌响应雷达图，WTP与WTK相比，脱苦后的果汁苦味响应值反而加强，而酸味显著降低，甜味显著提高，但是口感上苦味降低，这可能是酸味的降低及甜味的提高而混淆大脑味觉从而掩盖了苦味；YTP与WTP相比，调配后甜味反而降低，酸味提高，这可能是柠檬酸的酸作用强于蔗糖的甜作用；YMJ与YTP相比，两者响应值几乎一致，说明温-压联合杀菌不会对果汁滋味产生影响；而YZC与YMJ相比，苦味、甜味响应值显著提高，酸味显著降低，这可能与贮藏期内营养成分的变化有关。所以，对于口感上苦味的降低，应结合电子舌响应雷达图综合分析味道的掩盖作用。
a-响应雷达图；b-主成分分析图
图5 不同加工阶段的果汁样品电子舌分析图
Fig.5 Electronic tongue analysis diagram of juice samples at different processing stages
根据主成分分析图，各组处理第一主成分(principal component 1，PC1)和第二主成分(PC2)的累积贡献率分别为94.6%和3.9%，两者累积贡献率解释了样品之间98.5%的差异，样品之间的差异足以使用主成分分析方法进行区别分析。样品在主成分分析图中的距离远近可以表示不同样品之间滋味的差异，距离越远说明样品差异越大[21]。其中，WTK与WTP距离较远，说明脱苦效果显著，WTP与YTP距离较远，说明调配可以改善果汁滋味；YTP与YMJ出现重叠，且与YZC距离较近，说明果汁经温-压联合处理后风味无明显变化，且4 ℃下贮藏35 d对果汁风味变化亦无显著影响。这说明经活性炭处理可有效实现果汁脱苦，调配后果汁风味明显改善，温-压联合处理亦有效维持其杀菌后及贮藏期间的风味。
3 结论与讨论
环烯醚萜类、单萜类、二萜类、三萜类等成分是“苦味”的主要物质基础，而蓝靛果忍冬因含有环烯醚萜类，使其具有明显的苦味而不被人们喜欢[22-23]。活性炭作为一种有效的脱苦剂，在果汁、活性肽等方面具有良好的脱苦效果。本试验采用活性炭作为蓝靛果忍冬果汁的脱苦剂，经检测脱苦后苦味物质含量减少了
等[23]发现蓝靛果忍冬(品种“Wojtek”)果汁中含有的苦味物质为马钱苷酸、马钱苷、开联番木鳖苷和獐牙菜苷，本试验仅鉴定出前3种苦味物质，这可能是由于獐牙菜苷在本试验果汁中含量过低、品种及检测仪器灵敏度等差异所致，且其含量约占蓝靛果忍冬(品种“Wojtek”)果汁中苦味物质总含量的1/20，因此对脱苦效果影响不大。
超高压技术作为一种非热加工技术，不仅能够杀灭果汁中的致病菌和腐败菌，还能最大程度地保留营养成分[5]。但也有研究发现单独超高压处理可导致发酵石榴汁[18]等在贮藏期间的总酚和花色苷含量降低，使刺梨汁贮藏期间褐变度上升[24]。而本研究发现，与单纯的热或超高压杀菌相比，温-压联合杀菌处理的果汁微生物致死率更高，杀菌效果更好，且有效延缓了贮藏期内花色苷含量的下降和褐变度的升高，在4 ℃贮藏条件下可达到35 d食品安全贮藏期。这说明温-压联合杀菌不仅能够有效杀灭果汁中的微生物，还可以有效维持果汁贮藏期间的营养品质。
目前，电子舌技术已应用于分析草莓果汁、西瓜汁、红枣汁等果汁滋味，且研究发现超高压处理能够明显改善果汁品质[25]。本试验首次利用电子舌分析温-压联合处理后的蓝靛果果汁，结果显示虽然脱苦后苦味响应值增加，酸味降低，但相比于脱苦前改善了苦味口感，说明酸对苦味口感发挥了协同增效作用。调配果汁可以改善口感，且温-压联合处理果汁可以较好维持贮藏期内果汁品质和风味。因此，综合成本、贮藏效果因素考虑，宜选择400 MPa 3 min-50 ℃ 5 min贮藏4 ℃作为蓝靛果忍冬果汁杀菌及贮藏条件。
综上所述，活性炭具有良好的脱苦效果，温-压联合杀菌处理对果汁具有良好的杀菌效果，维持贮藏期稳定性，该方法对提升蓝靛果忍冬加工产品品质及推进蓝靛果忍冬的开发与利用有重要意义。本研究已确定蓝靛果忍冬的苦味物质和活性炭的脱苦工艺，可依据苦味物质的特性，筛选多种脱苦剂联合脱苦，进一步脱除果汁中的苦味，优化脱苦工艺，促进蓝靛果果汁产业化发展，提高蓝靛果忍冬的资源利用率。
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