枸杞是我国药食两用的传统药材，富含营养物质与活性成分，是良好的滋补品，具有极大的开发价值和广阔的应用前景。类黑精是美拉德反应所产生的一种结构非常复杂的褐色大分子高聚物，具有较强的抗氧化、抗菌、促进铁吸收等多种活性[1-2]。最近科研人员对于采用美拉德反应制备类黑精活性成分，及对其结构、活性分析方面进行了大量研究[3-4]。毛肇洁等[5]在对小磨香油的研究中发现类黑精有较强的抗氧化活性。刘志等[6]将人参高温蒸煮后，发现天冬氨酸与人参皂苷上水解产生的糖发生美拉德反应生成的类黑精增强了人参的抗氧化活性。赵天琦等[7]报道，经九蒸九曝加工制备的黑参富集了大量类黑精物质，具有更强的抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等生物活性。
熟化枸杞子是基于美拉德反应，将枸杞经高温、高湿熟化而成，熟化期间产生了大量的黑褐色类黑精物质，抗氧化活性也有了较大提高[8]。目前纯化类黑精的方法，主要有树脂纯化与超滤分离，其中，王月丽[9]利用超滤技术将黑蒜类黑精根据分子质量的不同分为了4个组分；何健等[10]利用X-5型树脂精制了曲霉型豆豉类黑精；王明慧[11]在研究糯米藕类黑精中采用了大孔树脂与凝胶层析联用的方法进行纯化。本实验在乙醇溶液提取熟化枸杞类黑精的基础上，采用大孔吸附树脂法，根据现有研究与类黑精特性，选择树脂极性以弱极性与非极性为主、相差较大的比表面积、平均孔径与粒径的树脂。比较6种大孔吸附树脂[12-13]对枸杞熟化产物类黑精的静态吸附、静态解吸和动态解吸中的效果，并测定了纯化前后类黑精的抗氧化性能。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
中宁干枸杞:产于宁夏，早康枸杞股份有限公司，含水量3%；大孔吸附树脂(AB-8、HPD-100、CAD-40、X-5、D101、D312)，东鸿化工有限公司；乙醇(分析纯)，天津市北方天医化学试剂厂；盐酸、氢氧化钠、DPPH、水杨酸硫酸铁、氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸，均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HY-2调速多用振荡器，国华电器有限公司；DBS-100电脑全自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂有限公司；SHZ-D循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 熟化枸杞的制备
采用王娜[8]的方法，将枸杞洗净，沥干，装入聚乙烯盘中，每盘枸杞不多于30 g。置于60 ℃的烘箱中加热处理48 h，即得到熟化枸杞。
1.3.2 枸杞熟化产物类黑精粗提物的制备
参照文献[14-16]的方法，将熟化枸杞研磨碾碎，用稀释后的乙醇溶液在45 ℃下提取，抽滤获得提取液，加入无水乙醇至乙醇体积分数达到70%。透析2 d，以除去游离的单糖、氨基酸等小分子物质，最后冷冻干燥得到类黑精粗提物。
1.3.3 类黑精的检测波长
类黑精颜色呈深褐色，其最大吸收峰值在420 nm左右[17]，因此本研究选取420 nm作为熟化枸杞类黑精的检测波长。将提取出的类黑精粗提物，分别配制成质量浓度0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL溶液，在420 nm下测定吸光度。在420 nm下的吸光度值随着枸杞熟化产物类黑精浓度的升高而升高，两者间呈显著的正相关,y=0.808x+0.029 8(R2=0.995 8)，符合朗伯比尔定律，因此选择420 nm作为类黑精的检测波长是可行的。
1.3.4 大孔吸附树脂的筛选
采用静态吸附解析法评估大孔树脂纯化的效果，树脂的预处理工艺参照郑佳佳[18]的方法，具体工艺如下：
无水乙醇中浸泡24 h→用纯水洗至流出液不浑浊→5% HCl溶液通过树脂柱，浸泡2 h左右→纯水洗至中性→2% NaOH溶液通过树脂柱，浸泡2 h左右→纯水洗至中性→待用
表1 大孔吸附树脂的物理特性
Table 1 Physical properties of macro-orous resins
树脂型号极性平均粒径/mm平均孔径/nm比表面积/(m2·g-1)AB-8弱极性0.30～1.2512～16480～520CAD-40弱极性0.25～0.840.50～0.60450～500X-5弱极性0.30～1.2529～30500～600HPD100非极性0.30～1.258.5～9 ≥650D101非极性0.30～1.259～10500～550D312非极性0.30～1.258.5～9 480～520
1.3.5 静态吸附容量及吸附率的计算
准确称取树脂5 g置于100 mL锥形瓶中，加入30 mL 5 mg/mL的类黑精粗提液，在振荡器中振荡24 h，充分吸附后过滤，分别测定树脂吸附前后样液在420 nm下的吸光度值，吸附容量按公式(1)计算；吸附率按公式(2)计算：
(1)
(2)
式中：Q，吸附容量，mg/g;ω0，样液中类黑精的质量分数，mg/g；ω1，吸附液中类黑精的质量分数，mg/g；，吸附液体积，mL；m，树脂质量，g；E，吸附率，%。
1.3.6 解析率的计算
取吸附后的树脂加入一定浓度的30 mL乙醇溶液进行解吸。置于振荡器中振荡24 h，充分解吸后过滤，测定解吸液在420 nm下的吸光度值，解析率计算如公式(3)所示：
(3)
式中：B，解析率，%；ω2，解析液中类黑精的质量分数，mg/g；1，解析液体积，mL；ω0，样液中类黑精的质量分数，mg/g；ω1，吸附液中类黑精的质量分数，mg/g；，吸附液体积，mL。
1.3.7 解析剂浓度对类黑精解析率的影响
为探究最佳洗脱液浓度，称取5 g饱和的AB-8树脂，分别加入20%、40%、60%、80%、100%体积分数的乙醇溶液作为洗脱剂，测定洗脱液在420 nm下的吸光度值，计算解析率。
1.3.8 类黑精的动态吸附试验
调整自动收集器，每2 min收集1管样品[19]，用48 mL 40%的乙醇溶液进行洗脱，于420 nm下测定收集样品的吸光度值。
1.3.9 总还原力的测定
参考韩慧敏[20]的方法，采用铁氰化钾法在700 nm波长处测定其吸光度值。吸光度值越大，说明还原能力越强。
1.3.10 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基[19]，参考陈放[21]的方法，取1 mL样品加入4 mL 95%乙醇溶液和2 mL 0.05 mg/mL的DPPH-乙醇溶液，摇匀，黑暗反应30 min，在517 nm波长处测定其吸光度值。DPPH清除率按公式(4)计算：
DPPH清除率
(4)
式中：A0，空白对照组的吸光度值；A1，样品组的吸光度值；A2，不加反应剂的样品的吸光度值。
1.3.11 ·OH清除能力
参考王文祥[22]的方法，采用水杨酸捕获Fenton反应[·OH]法，在510 nm波长下测其吸光度值，·OH清除率按公式(5)计算：
·OH清除率
(5)
式中：A0，空白对照组的吸光度值；A1，样品组的吸光度值；A2，不加反应剂的样品吸光度值。
1.3.12 数据分析
本实验设置3个平行组，数据在Excel中统计与整理，在Origin 2017中绘图，应用SPSS 19统计软件进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同型号树脂对类黑精的静态吸附效果
由于不同型号树脂的粒径孔径不同，导致树脂吸附率不同。由图1可以看出，不同型号的树脂吸附率依次是AB-8(弱极性)>D101(非极性)>D312(非极性)>X-5(弱极性)>CAD-40(弱极性)>HPD-100(非极性)，其中AB-8型树脂的吸附率最高为70.24%，吸附容量为6.322。分析原因可能是由于AB-8型树脂对比同为弱极性的X-5树脂与CAD-40树脂，其孔径更为合适，X-5树脂的孔径过大，CAD-40树脂的孔径过小都不利于吸附。AB-8 树脂的孔径略大于D101、D312、HPD-100三种树脂更有利于吸附。在P<0.05水平下AB-8型树脂吸附率显著高于其他组，AB-8型树脂吸附效果最好，可以推出枸杞熟化产物类黑精为弱极性物质。
图1 六种型号树脂对类黑精的吸附率
Fig.1 Adsorption capacities of six resins of melanoidins 注：图中不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著(下同)
2.2 不同型号树脂对类黑精的静态解吸效果
由图2可知，各个类型树脂的解析率均在80%以上，其中AB-8、CAD-40、HPD-100这3种树脂的解析率较高，且这3种树脂的解析率均在88%以上，AB-8略高于其他2种树脂，其解析率为88.84%。6种树脂之间的解吸率不存在显著性差异(P<0.05)，结合吸附率的实验结果，AB-8的吸附率和解析率都是最高的，因此可以选取AB-8大孔吸附树脂作为类黑精的纯化分离树脂。
图2 六种型号树脂对类黑精的解吸率
Fig.2 Desorption capacities of six resins of melanoidins
2.3 不同乙醇体积分数对类黑精解析率的影响
根据王明慧[11]以及何健等[10]树脂纯化类黑精的方法，使用乙醇溶液作为解吸剂。由图3可知，类黑精的解析率随乙醇溶液体积分数逐渐提高，呈现先增高后降低的趋势，其中20%的乙醇由于体积分数过低，无法使类黑精被充分解析出来，此时类黑精的解析率最低，仅为77.98%；而当使用100%乙醇时则可能由于乙醇极性过大，不利于类黑精的析出，类黑精的解析率也较低，为83.12%；乙醇溶液为40%、60%、80%时，类黑精的解析率均较高，在95%以上，综合考虑成本，选择40%的乙醇溶液作为解析剂。
图3 不同体积分数的乙醇溶液对AB-8树脂静态解吸结果
Fig.3 Effects of different alcohol concentrations on static desorption capacity of AB-8 resin
2.4 40%乙醇溶液与AB-8树脂对类黑精的动态解吸效果
图4为采用弱极性AB-8树脂作为纯化分离树脂、40%乙醇溶液作为解析剂的类黑精动态解吸效果。
图4 40%的乙醇溶液的动态洗脱曲线
Fig.4 Dynamic desorption cure of 40% alcohol concentration
采用40%的乙醇溶液作为解析剂，可以很好地洗脱吸附在AB-8树脂上的类黑精，以1.5 mL/min的速度洗脱，在第8管时即可到达顶峰，第18管时已基本洗脱干净，由此可见，40%的乙醇溶液对于类黑精的洗脱速度快、且洗脱出的类黑精比较集中。因此，采用40%的乙醇溶液可以把类黑精基本洗脱完成，且峰形较对称、无拖尾。
2.5 最佳纯化条件下获得的熟化枸杞类黑精活性分析
为检测纯化效果及纯化工艺对类黑精活性的影响，分别测定了类黑精纯化前后的总还原力、DPPH自由基清除能力及·OH清除能力。其中S1为树脂纯化前粗类黑精，S2为纯化后类黑精。
还原能力是评判物质抗氧化活性高低的重要指标，一般与抗氧化能力呈正相关。由图5可知，对照组(维生素C)与S1组分、S2组分存在显著性差异。在相同浓度下，对照组的总还原力均比纯化前后的类黑精要高，但经过纯化后的S2组分的总还原力比纯化前S1组分的总还原力要高，从0.836提高到了1.36。
图5 纯化工艺对总还原力的影响
Fig.5 Effects of resin purification on total reducing power
由图6可知，S2组分与对照组不存在明显差异，与S1组分存在明显差异(P<0．05)。经过纯化以后，类黑精的DPPH自由基清除能力得到明显提高，S2组分的DPPH自由基清除能力不仅比S1组分高，与对照组相比也略有提高，分别提高了35.43%和2.88%。
图6 纯化工艺对DPPH清除能力的影响
Fig.6 Effects of resin purification on DPPH eliminating ability
由图7所示，S2组分与对照组和S1组分存在明显差异(P<0.05)。纯化后的S2组分的·OH清除能力明显要高出对照组与未纯化的S1组分，纯化前的S1组分与对照组的·OH清除率分别为39.03%和42.26%，两者相差不大，但纯化后的S2组分的·OH清除率达到了65.77%，相比于对照组与S1组分清除率提高了1倍。由上述结果可知，经此工艺纯化后的类黑精纯度有了较大提高，活性也保持较好。
图7 纯化工艺对·OH清除能力的影响
Fig.7 Effects of resin purification Hydroxyl radical scaenging ability
3 结论
基于美拉德反应对枸杞进行了熟化处理，对其美拉德反应的活性产物类黑精进行了分离纯化，研究大孔吸附树脂对类黑精的吸附、解析效果的影响，以及乙醇解析剂浓度对熟化枸杞类黑精的解析效果影响，最终确定采用AB-8型大孔吸附树脂作为纯化树脂，40%的乙醇溶液作为解吸剂，在该工艺条件下类黑精的洗脱速度快、洗脱出的类黑精也较为集中。本研究与王明慧[11]纯化糯米藕类黑精选取的树脂相同，都是AB-8型树脂，何健等[10]纯化曲霉型豆豉类黑精筛选的树脂为X-5，洗脱剂浓度为60%，选取的树脂多为弱极性，根据极性相似相容原理，说明熟化枸杞类黑精也为弱极性物质。解吸剂乙醇溶液的体积分数不同，相对应的极性也不同，会影响类黑精在乙醇溶液的溶解度，类黑精在合适的洗脱剂浓度下，解析率相应较高，不同产物的类黑精极性会有所不同。
对其纯化产物进行抗氧化分析发现，与纯化前相比，纯化后产物的总还原力从0.836提高到1.36，·OH清除能力提高了26.74%，DPPH自由基清除能力提高了35.43%，与郑佳佳[18]在研究酒糟类黑精UF3组分树脂纯化后·OH清除率提升了10.06%；郑金德[23]在研究啤酒类黑精中，非极性UF4组分经树脂纯化后的抗氧化性最强一致。综上，说明AB-8型树脂可以富集类黑精中有效成分，纯化之后的类黑精表现出较强的抗氧化活性。为之后进一步研究熟化枸杞类黑精提供了基础研究方法，对熟化枸杞类黑精的结构与活性有待进一步研究。
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