目前所使用的食品包装主要由石油基塑料制成的，处理不当会影响环境和人身安全。此外，大多数食品包装很难保持食品的新鲜度。在某些情况下，可食用和可生物降解的膜有替代塑料包装的潜力。壳聚糖(chitosan，CS)是一种源自几丁质的天然线性氨基多糖，是自然界中仅次于纤维素的第二丰富多糖。它可生物降解、无毒、可再生，同时，它对多种细菌有抑制作用[1]，因此壳聚糖在食品包装领域的应用引起了广泛的关注。壳聚糖膜抗氧化活性较低，导致其在食品工业中的应用受到限制。在壳聚糖膜中掺入或接枝抗氧化剂可以增强其抗氧化活性[2]。
酚类化合物是植物界最丰富的次生代谢产物。酚酸是一类重要的酚类化合物，已被证明具有优异的抗氧化活性[3]。近年来，研究人员致力于将天然酚酸与壳聚糖接枝来改善其抗氧化性。结果表明，酚酸接枝壳聚糖膜是一种新型的抗氧化膜，与没食子酸和咖啡酸接枝改变壳聚糖膜的物理性质，增强其生物活性，包括抗氧化和抗菌活性[4]。此外，接枝度不同的没食子酸壳聚糖衍生物复合膜的物理性能和抗氧化性各异[5]。研究发现，5种羟基苯甲酸接枝壳聚糖膜的性能取决于羟基苯甲酸的类型和接枝率[6]。这些研究表明，酚酸的种类、接枝度和成膜方法将对酚酸接枝壳聚糖膜的性能有显著的影响。目前，接枝度相近的不同种类酚酸壳聚糖膜的对比研究还较少见。
本研究将咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸分别通过碳二亚胺介导的偶联反应制备接枝度相近的酚酸壳聚糖衍生物，进而得到了酚酸接枝壳聚糖膜以评估其物理性质、生物活性和对南美白对虾的保鲜效果。为壳聚糖膜在食品包装领域的应用提供了参考价值。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、Folin-Ciocalteu试剂、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、1,1-二苯基-2-吡啶基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、壳聚糖(脱乙酰度90%，分子质量100 kDa)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3 - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC]，中国上海生工生物技术有限公司；咖啡酸(caffeic acid，CA)、阿魏酸(ferulic acid，FA)、对香豆酸(p-coumaric acid, PA)，中国上海麦克莱恩生化科技有限公司。以上所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
U-3900紫外光谱仪，日立有限公司；Nicolest Is 10傅里叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔仪器有限公司；DCP-KZ300智能拉伸试验机，成都明驰有限公司；T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；FOSS 8400 凯式定氮分析仪，福斯分析仪器有限公司；FE28-Bio 台式pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.3 酚酸接枝壳聚糖衍生物(酚酸-g-CS)的制备
酚酸-g-CS样品采用文献[7]的方法制备。制备100 mL乙酸溶液(1%体积分数)，将干燥的2.0 g壳聚糖添加到其中，边加入边搅拌。PA和EDC(分别为0.324和0.383 4 g)溶解在乙醇(10 mL，70%体积分数)中，将NHS(0.230 2 g)加入其中，在冰浴中搅拌1 h。将含有酚酸的乙醇溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，并在冰浴中搅拌40 min。将混合物在黑暗中反应24 h后离心(10 000 r/min，30 min)。最后将上清液装入普通透析袋(14 kDa)用去离子水透析3 d，将样品冷冻干燥。
FA-g-CS采用相同方法合成，FA、NHS和EDC的量分别为0.180 2、0.115 1和0.191 7 g。
CA-g-CS采用同样的方法合成，咖啡酸、NHS和EDC的量分别为0.194 2、0.115 1和0.191 7 g。
1.4 酚酸-g-CS共价结构表征
红外光谱：通过傅里叶变换红外光谱仪在波数4 000～400 cm-1测量。其分辨率为2 cm-1。
紫外光谱：样品的紫外光谱(0.2 mg/mL)在紫外分光光度计上获得，扫描范围：250～400 nm。
壳聚糖衍生物样品的接枝率采用Folin-Ciocalteu法测定[8]。建立酚酸的标准曲线以获得样品的总酚含量。
1.5 酚酸接枝壳聚糖膜
采用SUN等[9]的方法制备。制备100 mL乙酸溶液(1%体积分数)，然后向其中加入PA-g-CS(2.0 g)。将2.5 g明胶和0.6 g甘油分别放入PA-g-CS溶液中，将溶液在60 ℃下混合60 min，超声脱气并涂在塑料板上(30 cm×20 cm)。膜在室温下干燥2 d后从板上剥离，测试前在容器(25 ℃，50%相对湿度)中保存2 d。CS、FA-g-CS和CA-g-CS膜分别使用上述方法制备与样品质量相同的样品。
1.6 酚酸-g-CS膜的性能
1.6.1 膜的物理性质
透光率：通过紫外分光光度计(200～800 nm)评估膜样品(1 cm×4 cm)的透光率。
厚度：使用螺旋千分尺评估膜厚度。
不透明度：使用紫外可见分光光度计测量。计算如公式(1)所示：
不透明度
(1)
式中：A，膜在600 nm处吸光度；d，膜的厚度。
水分含量和水溶性：根据文献[10]测量。
膜的水蒸气透过率(water apor permeability，WP)根据文献[10]测定，计算如公式(2)所示：
(2)
式中：m，称量瓶增加的质量，g；d，膜的厚度，mm；t，称量瓶质量增加的时间，h；A，膜的穿透面积，cm2；ΔP，膜两侧的蒸气压差(27 ℃时为3 567 Pa)。
1.6.2 机械性能
根据LIU等[6]的方法，将矩形膜(100 mm×6 mm)安装在智能拉伸试验机上，测量其力学性能，包括杨氏模量(young modulus，YM)、断裂伸长率(elongation at break，EB)和抗拉强度(strength of extension，TS)。
1.6.3 复合膜的抗氧化性
根据文献[10]对膜的DPPH清除能力和其总酚释放量进行了测定。膜的总酚释放量采用Folin-Ciocalteu法测定。根据DPPH溶液和样品的混合物的吸光度来测定膜的DPPH清除能力。DPPH清除能力由混合物的吸光度(波长为517 nm)测量，计算如公式(3)所示：
DPPH清除力
(3)
式中：A0，空白吸光度；A1，混合物吸光度。
1.6.4 抗菌活性
采用YOON等[11]的方法进行测定。将200 μL的细菌悬浮液(106CFU/mL)均匀分布在含有琼脂的板上，将直径6 mm的膜放置在含有琼脂的板上。将培养皿在37 ℃下孵育36 h，测量膜周围抑制区的直径。无菌水和山梨酸钾分别作为空白和阳性对照。
1.7 南美白对虾的保鲜
1.7.1 样品处理
将膜应用于保鲜南美白对虾来评估酚酸-g-CS膜的保鲜能力。选择质量相近的活虾(15.00±1.00) g，随机分为5组。虾用冷水清洗并用酚酸-g-CS膜(10 cm×10 cm)包裹。然后将虾在4 ℃下储存，并在储存期间对其指标进行评估[12]。
1.7.2 失重率
称量南美白对虾在储存期间的质量，失重率表示虾的初始体质量和每天体质量之间的百分比损失。
1.7.3 pH值
根据HUANG等[12]的方法，使用数字pH计评估虾样品的pH值。
1.7.4 总挥发性盐基氮(total olatile base nitrogen，TB-N)
使用凯式定氮分析仪测量，以mg/100 g表示。
1.7.5 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)
采用ZHANG等[5]的方法。将虾(5.0 g)与TCA(25 mL, 10%)混合并均质30 s。悬浮液用双层滤纸过滤，移液管吸出2 mL滤液，在试管中与TBA溶液(2 mL)充分混合。将其置于水中(100 ℃)45 min后快速冷却至室温，测量混合物的吸光度(532 nm)。
1.7.6 微生物评价
菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[13]，结果表示为lg CFU/g。
1.7.7 感官评价
由随机选取的6名评估员(3名男性和3名女性)根据HUANG等[12]的方法进行。评估员通过对虾的颜色、质地、气味和整体可接受性来给出感官评分(10分为最理想，1分为最低质量)。
1.8 统计分析
所有实验均重复3次，并使用SPSS 20.0通过方差(ANOA)分析数据。如果P<0.05，则认为差异具有统计学意义。
2 结果与讨论
2.1 酚酸-g-CSs的表征
2.1.1 傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)分析
如图1所示，4个样品在1 648 cm-1附近具有特征带，这归因于C
O拉伸(酰胺I)。4组样品在1 550和1 320 cm-1附近具有特征带，这分别归因于残余N-乙酰基的N—H弯曲(酰胺II)和C—N拉伸(酰胺III)[14]。同时，酚酸-g-CSs在1 635 cm-1附近的峰(酯基的CO伸展)变得更加明显，在1 550 cm-1附近的特征带减少，表明伯胺数量减少，酰胺含量增加[15]。结果表明，酚酸与壳聚糖成功接枝。
图1 CS和酚酸-g-CSs的FT-IR图谱
Fig.1 FT-IR spectra of CS and phenolic acid-g-CSs
2.1.2 紫外光谱
由图2可知，壳聚糖的紫外光谱中没有出现明显的吸收峰，而FA-g-CS、PA-g-CS和CA-g-CS的紫外光谱在275～325 nm出现了特征吸收峰。特征吸收峰是由酚酸苯环的π体系引起的。这一结果与文献[16]的报道一致，这也表明酚酸成功接枝到壳聚糖。
图2 壳聚糖和酚酸接枝壳聚糖的紫外光谱
Fig.2 U spectra of chitosan and phenolic acid-grafted chitosan
2.1.3 酚酸-g-CSs的接枝率
根据表1中的反应条件，酚酸-g-CS的接枝率分别为54.7、53.5、55.7 mg/g。
表1 酚酸-g-CSs的制备条件及其接枝率
Table 1 Preparation conditions of phenolic acid-g-CSs and its grafting ratios
酚酸接枝壳聚糖成分质量/g壳聚糖酚酸EDCNHS接枝率/(mg·g-1)PA-g-CS2.00.328 40.383 40.230 254.7FA-g-CS2.00.180 20.191 70.115 153.5CA-g-CS2.00.194 20.191 70.115 155.7
2.2 复合膜的特性
2.2.1 膜的物理性能
如图3所示，与壳聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜的紫外透射率较低。表明酚酸接枝可以有效提高CS膜的紫外线阻挡性能，这主要是由酚酸基团的紫外线吸收引起的[16]。CA-g-CS膜具有最低的紫外线透光率，表明它在包裹食品时可以有效地延缓紫外线引起的氧化。
图3 壳聚糖和酚酸接枝壳聚糖膜的透光率
Fig.3 Light transmission of chitosan and phenolic acid-grafted chitosan films
由表2可知，4种膜的厚度没有明显差异(P>0.05)，与先前的研究一致，即原儿茶酸接枝壳聚糖膜的厚度也与壳聚糖膜的厚度相似[6]，酚酸接枝共聚并不能改变壳聚糖膜的厚度[5]。
当膜具有阻隔紫外线和可见光的特性时可以保护包装食品免受光辐射。与壳聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜表现出更高的不透明度(表2)。CA-g-CS膜的不透明度最高，为(1.47±0.11)，其次是FA-g-CS膜和PA-g-CS膜。可能是由于酚酸具有可以吸收光的芳香基团[17]，不透明度的差异与接枝酚酸的种类有关[11]。
膜的水分含量对膜在潮湿环境中的耐水性有明显的影响，因此，它是一个重要的指标。与壳聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜具有低一些的水分含量(表2)。可能是壳聚糖的官能团(—OH/—NH2)与水分子之间的氢键相互作用引起的，当酚酸接枝到壳聚糖膜时，氢键相互作用被大幅度破坏，结果也与原儿茶酸接枝壳聚糖膜的现象相似[5]。在食品包装应用中，膜的防水性是一项至关重要的能力，这与膜的水溶性相关。与壳聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜显示出更高的水溶性(表2)(P<0.05)。可能是酚酸-g-CS分子间氢键的数量减少所致[6]。此外，HU等[13]也注意到了类似的现象和研究结果。CA-g-CS膜的含水量最低，同时其水溶性也最低。这种现象可能与咖啡酸中的官能团(—OH)有关。
WP是膜最重要的特性之一，因为暴露在外面的食物和周围环境之间会发生水分转移，而膜会阻碍这种转移。如表2所示，酚酸-g-CS膜显示出比壳聚糖膜更低的WP。这可能与壳聚糖拥有的官能团有关，这些官能团可以为水分子提供结合位点。然而，在酚酸接枝壳聚糖中，壳聚糖的亲水结构的可用性极为有限，因此，羟基苯甲酸接枝壳聚糖膜对水的亲和力降低[9]。研究表明，将水杨酸接枝到壳聚糖膜上也可以降低壳聚糖膜的WP[18]。CA-g-CS膜的WP低于其他壳聚糖膜的WP，这可能与CA的二羟基结构密切相关，可能因为CA接枝到CS后，酚酸上的羟基与CS之间产生相互作用，阻碍了水分子通过膜。根据WANG等[4]的研究，与其他膜相比，CA接枝壳聚糖膜显示出较低的WP。
表2 酚酸-g-CS膜的厚度、不透明度、含水量、水溶性、水蒸气渗透率
Table 2 Thickness, opacity, moisture content, water solubility, and water apor permeability of phenolic acid-g-CS films
膜名称厚度/mm不透明度/mm水分含量/%水溶性/%WP×108/[g·mm·(h·cm-2·Pa)-1]CS膜0.063±0.002a0.97±0.06a14.82±0.11d31.28±0.12a4.35±0.09cPA-g-CS膜0.062±0.003a1.08±0.04a14.34±0.09c39.52±0.35c4.04±0.07bFA-g-CS膜0.060±0.005a1.30±0.07b13.76±0.14b38.64±0.24c3.92±0.12bCA-g-CS膜0.061±0.003a1.47±0.11c13.27±0.17a34.53±0.21b3.61±0.10a
注：数值以平均值±标准差表示，同一列中不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2.2 机械性能
膜的机械性能与其在食品加工和运输过程中的抗压能力密切相关，同时具有良好机械性能的膜可以保护食品免受损坏。由表3可知，酚酸-g-CS膜的YM、EB、TS等机械性能均高于壳聚糖膜，其中CA-g-CS膜的TS，EB和YM值最高。结果表明，酚酸提高了壳聚糖膜的机械性能。壳聚糖与酚酸的接枝过程中形成了分子间氢键，同时聚合物网络之间也形成了物理连接，从而降低了膜的自由体积和分子迁移率，进而酚酸-g-CS膜具有更致密的分子结构[19]。与CS膜相比，不同羟基肉桂酸接枝壳聚糖膜的机械性能有所提高[5]。
表3 酚酸-g-CS膜的机械性能
Table 3 Mechanical properties of phenolic acid-g-CS films
膜名称抗拉强度/MPa断裂伸长率/%杨氏模量/(MPa·%-1)CS 膜20.90±0.32a17.32±0.28a1.18±0.04aPA-g-CS 膜26.34±0.31b19.81±0.29b1.30±0.06bFA-g-CS 膜28.58±0.27c21.90±0.31c1.33±0.10cCA-g-CS 膜30.36±0.37d22.32±0.30d1.38±0.09d
2.2.3 酚酸释放量及DPPH自由基清除能力
如图4所示，酚酸从膜中的总酚释放量以PA-g-CS膜最高，FA-g-CS膜次之，CA-g-CS膜最低。与CS膜相比，酚酸-g-CS膜表现出更强的DPPH自由基清除能力。研究表明，在接枝没食子酸后，CS膜的抗氧化活性也显著增强[20]。然而，总酚释放量最低的CA-g-CS膜表现出最好的DPPH自由基清除能力。据了解，酚羟基的数量和活性可能会影响其抗氧化能力。CASETARI等[21]的研究进一步证明，酚酸-g-CS中酚羟基的数量密切影响其抗氧化能力。因此，CA-g-CS膜DPPH自由基清除能力最强，可能取决于其二羟基结构，酚羟基在3和4位的接枝共聚物的DPPH自由基清除能力最强，因此具有3位和4位二羟基的CA-g-CS膜拥有最好的DPPH自由基清除能力[22]。
图4 膜的抗氧化性和总酚释放量
Fig.4 Antioxidant actiity and total phenolic content of films
2.2.4 抗菌活性
研究显示壳聚糖膜的抗菌活性在接枝酚酸后增加，所有酚酸-g-CS和CS膜的抗菌活性如表4所示。同时，与大肠杆菌相比，所有膜对金黄色葡萄球菌的抑菌活性更显著，这可能与细菌的细胞膜结构不同有关。据报道，与革兰氏阴性菌相比，水杨酸-g-CS膜对革兰氏阳性菌表现出更好的抗菌活性[23]。
表4 酚酸-g-CS膜的抗菌活性
Table 4 The antibacterial actiity of phenolic acid-g-CS films
样品抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌无菌水6.00±0.05a6.01±0.09a山梨酸钾10.49±0.11b9.24±0.18bCS膜10.32±0.23b11.94±0.23cPA-g-CS 膜11.03±0.31c12.23±0.25dFA-g-CS 膜11.78±0.26d13.64±0.27eCA-g-CS膜11.98±0.29e14.23±0.32f
在4组膜中，CA-g-CS膜对2种细菌均表现出最强的抗菌活性，这可能与CA中的2个酚羟基有关。据报道，酚羟基数量的增加会改善酚酸对微生物的抑制作用，CA-g-CS膜的抑菌能力优于其他2种膜，这主要因为CA的二羟基结构[24]。酚酸接枝后壳聚糖膜的物理性能、力学性能、生物活性均得到改善。在膜的所有性能中，CA-g-CS膜表现出最好的机械性能、抗氧化和抗菌活性。这种现象主要因为CA中的2个酚羟基。
2.3 南美白对虾的保鲜作用
2.3.1 失重率
防止水分流失是膜产品质量的一个重要特性。在储存过程中，虾的失重率如图5-a所示。无膜处理的虾的失重率最高，采用膜处理的虾的失重率较低。与壳聚糖膜处理的虾相比，酚酸-g-CS膜处理的虾具有更低的失重率，CA-g-CS膜包裹的虾表现出最佳的失重率降低能力，与水蒸气透过率结果一致，即膜的水蒸气透过率和虾的失重率之间具有相关性[21]。
2.3.2 pH值
虾的pH值一直被用作其新鲜度的指标。当pH<7.80时，虾的新鲜度被认为是可以接受的。由图5-b可知南美白对虾的pH值呈上升趋势，对照组在贮藏期间pH值最高，尤其是第7天，pH值达到最高(7.88±0.03)，CA-g-CS膜组pH值最低(7.34±0.04)。pH值结果表明，CA-g-CS膜能有效地延缓南美白对虾的pH值上升的速度。
2.3.3 TB-N
TB-N含量与虾肉内的细菌和内源性酶的作用有关。海虾的TB-N不超过30 mg/100 g是可以被接受的[5]。由图5-c可知，所有的虾都表现出相似的趋势，初始TB-N约为[(3.51±0.95) mg/100 g]，而在储存期间该值不断上升。第5天，对照组虾的TB-N值超过30 mg/100 g，表明虾肉已经腐败到让人不可接受的程度。第7天，壳聚糖膜组的TB-N值也已经超过30 mg/100 g。同时，CA-g-CS膜组仅为[(24.19±1.31) mg/100 g]，PA-g-CS膜组和FA-g-CS膜组分别为(29.89±0.98)和(27.85±1.02) mg/100 g。结果表明，CA-g-CS膜有效地延缓了虾肉的TB-N上升，进而表现出较好的保鲜能力。
2.3.4 TBA
TBA的值可以表示最终脂质氧化产物的浓度。如图5-d所示，所有虾的初始TBA值相似，约为(0.23±0.01) mg MDA/kg，而且随着储存时间的延长而不断增加。第7天，对照组虾的TBA值最高[(1.16±0.03) mg MDA/kg]，CS膜、PA-g-CS膜、FA-g-CS膜和CA-g-CS膜的TBA值分别为(0.88±0.04)、(0.76±0.02)、(0.70±0.04)和(0.62±0.03)mg MDA/kg，证实酚酸接枝壳聚糖膜有效延缓TBA上升，CA-g-CS膜的TBA值最低。
a-失重率；b-pH；c- TB-N；d- TBA；e-总菌落数；f-感官评价
图5 酚酸接枝壳聚糖保鲜南美白对虾在储存期间的变化
Fig.5 Preseratie effect of phenolic acid-grafted-chitosan on P.annamei during storage
2.3.5 微生物分析
大多数水产品的变质和腐败主要是由于微生物的活动，而水产品中的微生物通常与其环境中的微生物种群有关[25]。由图5-e可知，虾的总细菌数(total bacterial count，TBC)随着储存时间的延长而增加。对照组虾的总细菌数高于所有用膜处理的虾，对照虾组第6天的总细菌数超过6.00 lg CFU/g，表明虾已经过度变质。第7天，CA-g-CS膜组总细菌数最低[(5.21±0.07) lg CFU/g]，其次是PA-g-CS膜[(5.79±0.08) lg CFU/g]和FA-g- CS膜[(5.49±0.07) lg CFU/g]。综上，酚酸接枝壳聚糖膜降低了虾的总细菌数，这种现象可能与它们的抗菌特性有关。
2.3.6 感官评价
图5-f展示了壳聚糖膜和酚酸接枝壳聚糖膜保鲜虾的感官评分。所有虾的感官评分均有所下降，而对照组的感官评分最低。对照组第6天的感官评分低于(3.8±0.2)，表明虾肉已经腐败到不可接受的程度。第7天对照组感官评分下降到(2.9±0.1)，而壳聚糖膜、PA-g-CS膜、FA-g-CS膜和CA-g-CS膜组的感官评分分别为(3.9±0.2)、(4.6±0.2)、(4.9±0.4)和(5.8±0.2)。CA-g-CS膜组的感官评分最高，说明它能有效延长南美白对虾的新鲜度。
总而言之，酚酸-g-CS膜组对虾的保鲜效果优于CS膜，同时，CA-g-CS膜对虾的保鲜效果最好，FA-g-CS膜次之，PA-g-CS膜又次之。这可能与酚酸壳聚糖膜的抗菌和抗氧化活性有关。
3 结论
酚酸-g-CS膜的物理性能、机械性能和生物活性与接枝的酚酸息息相关。CA-g-CS膜表现出最好的性能，如机械和物理性能、抗菌和抗氧化活性，这可能取决于咖啡酸结构中的酚羟基。同时，CA-g-CS膜对虾的保鲜效果优于其他膜。结果表明，酚酸中羟基的位置和数量对壳聚糖膜的性能有显著影响。此外，CA-g-CS膜的实验效果最好，表明其在食品活性包装领域具有潜在的应用价值。
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