酸笋主要以新鲜竹笋为原料，在低盐条件下密封发酵而成，发酵后的酸笋富含人体必需氨基酸和膳食纤维，具有降血脂、增强免疫力等保健功能[1]。在酸笋发酵过程中，硝酸盐在微生物所产生的硝酸还原酶的作用下生成亚硝酸盐，亚硝酸盐含量超标会影响酸笋品质[2]。过量摄入亚硝酸盐会引起人体中毒，导致高铁血红蛋白症，世界卫生组织规定亚硝酸盐每日摄入量限量为0.06 mg/kg[3-4]。
目前，对酸笋的研究主要集中在乳酸菌的筛选、营养物质和风味成分的解析。孙宁等[1]对自然发酵酸笋中的乳酸菌进行了筛选和鉴定，发现6株具有良好的益生性能和体外抗氧化活性的乳酸菌；郭荣灿等[5]对发酵酸笋气味物质的提取方法进行了优化，发现顶空固相萃取法为最佳萃取方法；朱照华[6]发现酚类、醇类、酸类和醛类物质为自然发酵酸笋的主要挥发性风味物质。然而现阶段对于研制低亚硝酸盐酸笋及其品质分析的报道较少，传统发酵酸笋存在发酵周期长、亚硝酸盐含量高等问题[7]，有研究表明乳酸菌在发酵过程中能够有效减少亚硝酸盐含量，其产生大量的乳酸有抑菌作用，能有效防止酸笋的腐败变质[8]。
本研究选用实验室保存的乳酸菌接种于酸笋发酵中，并与自然发酵酸笋对比分析。通过对酸笋发酵过程中各项理化指标及亚硝酸盐含量的检测和发酵后酸笋的质构分析，结合GC-MS解析发酵后酸笋的风味成分，研制低亚硝酸盐的发酵酸笋，以期为规模化生产安全性高和风味独特的柳州酸笋提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
新鲜采摘竹笋，购于广西柳州；乳酸菌菌株，分离自广西柳州酸笋发酵液中，保存于柳州市质量检验检测研究中心。
MRS肉汤培养基、MRS固体培养基,青岛海博生物技术有限公司；食盐，市售；NaNO2、NaOH、硼砂、乙酸锌、K4Fe(CN)6、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 主要仪器与设备
YX-280高压蒸汽灭菌锅，合肥华泰医疗设备有限公司；U-1750紫外可见分光光度计，日本岛津公司；ZXDP-B1160生化培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；PHS-3C pH计，上海精科仪器有限公司；TA.XT.Plus质构仪，英国Stable Micro System公司；Agilent 7000D/8890气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦仪器有限公司；50/30 μm DB/CAR/PDMS纤维萃取头，美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 乳酸菌的活化
将保存于-80 ℃的3株取自柳州酸笋发酵液中的乳酸菌(P51、P52、P53)解冻后，取1环接种于50 mL MRS液体培养基中(121 ℃灭菌20 min)，37 ℃恒温静置培养24 h。按接种量2%(体积分数，下同)接种至50 mL MRS液体培养基中并扩大培养22 h。
1.3.2 乳酸菌降解亚硝酸盐能力测定
以2%的接种量将活化后的乳酸菌P51、P52、P53分别接种于含有150 mg/L NaNO2的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养48 h，取样并测定亚硝酸盐含量[9-10]。亚硝酸盐含量的测定参考GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，标准曲线为y=0.600 1x+0.007 6，R2=0.999。
1.3.3 生长曲线的测定
取适量活化两代的乳酸菌P51 8 000 r/min离心10 min后用无菌水洗涤2次，重悬乳酸菌细胞并以2%接种量接种于50 mL MRS液体培养基中，37 ℃静置培养并测定乳酸菌在600 nm处的吸光值以确定其生长情况[11]。
1.3.4 酸笋的发酵工艺
本实验选用产自广西柳州的新鲜无虫害竹笋，采取自然发酵和纯种乳酸菌发酵酸笋，发酵工艺如下：
自然发酵：新鲜竹笋→去根、去壳→清洗、切块→盐渍(6%食盐水)→密封发酵
纯种乳酸菌发酵：新鲜竹笋→去根、去壳→清洗、切块→热水烫煮2 min→盐渍(6%食盐水)→接种乳酸菌(接种量为0.04 g/kg)→密封发酵
1.3.5 酸笋发酵过程中各项理化指标的检测
酸笋发酵周期为14 d,每隔2 d取样。参照GB 12456—2008《食品中总酸的测定》测定pH值和总酸含量；参照GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》中直接滴定法测定还原糖含量；参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中盐酸奈乙二胺比色法测定亚硝酸盐含量。每个实验组设置3个平行。
1.3.6 酸笋的品质分析
对发酵后的酸笋进行品质分析，选取形状、大小尽量一致的酸笋，将其切成4 cm长。使用质构仪检测发酵后酸笋的硬度和脆度，检测模式为穿刺模式，实验参数参考刘洪等[12]的研究并略作修改。选用P/2 N-2 mm不锈钢针形探头，测前速度1.0 mm/s、测试速度3.0 mm/s、测后速度10.0 mm/s、穿刺距离5 mm、触发力3.0 g。样品测试5次取平均值。
1.3.7 酸笋的感官评价
对发酵后酸笋进行感官评价，由8人组成感官评价小组(4男4女，包括2名感官评价专家)，分别从酸笋的色泽、口感、滋味和风味3方面进行评分，评分标准如表1所示。
表1 不同发酵方式的酸笋感官评价标准
Table 1 Sensory ealuation standard of sour bamboo shoots with different fermentation methods
感官指标评分标准评分/分色泽(20分)色泽均匀(乳白色)16～20色泽一般,无黑点11～15色泽灰暗5～10口感(50分)口感脆嫩36～50口感稍脆21～35口感较差10～20滋味和风味(30分)酸味适宜,笋香浓郁,无异味21～30风味较酸,有竹笋香味11～20酸味不适宜,无竹笋香味5～10
1.3.8 酸笋风味成分分析
采用气相色谱-质谱联用仪分析发酵后酸笋的风味成分。将发酵14 d的自然发酵酸笋和纯种乳酸菌发酵酸笋剁碎后取8 g分装至20 mL顶空瓶中，于80 ℃平衡10 min后，插入经老化处理后的萃取头，顶空吸附30 min后将萃取头插入进样品口解析5 min。气相色谱条件：毛细管柱为HP-5 (30 m×250 μm×0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至250 ℃，保持3 min；载气He，流速1.0 mL/min，不分流进样，进样量1.0 μL。质谱条件：电子电离源EI，电子能量70 e，四级杆温度和离子源温度分别为150 ℃和200 ℃，数据采集为全扫描[13]。在NIST 05质谱库中分析检测到的挥发性风味物质质谱数据。
1.4 数据处理与分析
实验重复2次，采用Excel处理实验数据，SPSS 22.0对数据进行分析并用Origin 2018绘图。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌降解亚硝酸盐能力及生长曲线测定
将活化两代的乳酸菌(P51、P52、P53)分别加入到含有150 mg/L NaNO2的MRS液体培养基培养48 h后，NaNO2含量分别为0.069、10.071、16.545 mg/L，其降解率分别为99.95%、93.29%和88.97%。3株乳酸菌均具有较高的亚硝酸盐降解能力，其中菌株P51降解能力最强，故选择该菌株接种于后续酸笋发酵过程中。
如图1所示，乳酸菌P51在营养物质充足条件下，培养6 h后呈对数生长，在培养20 h后进入稳定期，因此将活化20 h的乳酸菌用于酸笋发酵。
图1 乳酸菌生长曲线
Fig.1 The growth cure of lactic acid bacteria
2.2 酸笋发酵过程中pH值和总酸含量的变化
如图2所示，酸笋初始pH为6.96，发酵过程中，发酵液pH值随时间的变化逐渐降低，且纯种发酵酸笋的pH值均低于自然发酵；总酸含量逐渐增多且纯种发酵中总酸含量高于自然发酵。
a-pH值；b-总酸含量
图2 酸笋发酵过程中pH值和总酸含量的变化
Fig.2 Changes of the pH, total acid content of sour bamboo shoots during fermentation
在发酵前期，乳酸菌生长代谢迅速，发酵液的总酸含量不断增加且pH值显著下降；在发酵后期，pH值逐渐降低且变化速率趋于平缓，总酸含量在发酵第12天达到最大值后略有降低，这是由于大量乳酸的积累抑制了乳酸菌的生长，降低了其产酸能力[14]。
研究表明，当泡菜液的pH值为3.5～3.8时，发酵结束[15]。在发酵第6天时，纯种发酵酸笋发酵液pH值为3.73，总酸含量为0.39%；而自然发酵酸笋在第12天时，pH值为3.69，总酸含量为0.48%。乳酸菌在生长代谢过程中，能产生大量乳酸和乙酸等物质[16]，在纯种发酵酸笋中，乳酸菌作为优势菌群其繁殖速度更快，产酸更多，因此纯种乳酸菌发酵酸笋能显著缩短酸笋的发酵周期。
2.3 酸笋发酵过程中还原糖含量的变化
由图3可知，2种不同发酵方式的发酵液中还原糖含量均呈下降趋势。在第2～6天时，乳酸菌的生长代谢需消耗碳源，因此还原糖消耗速率较快；发酵第8～14天时，还原糖含量逐渐减少。在自然发酵酸笋中存在大量微生物，乳酸菌含量较少，因此在发酵过程中其还原糖消耗速率均低于纯种乳酸菌发酵酸笋。
图3 酸笋发酵过程中还原糖含量的变化
Fig.3 Changes of reducing sugar content of sour bamboo shoots during fermentation
2.4 酸笋发酵过程中亚硝酸盐含量的变化
自然发酵和纯种发酵酸笋在发酵过程中亚硝酸盐含量均低于GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中的限量标准。如图4所示，纯种发酵和自然发酵酸笋分别在第6天和第10天时产生“亚硝峰”，亚硝酸盐含量分别为1.815 mg/kg和2.157 mg/kg。
图4 酸笋发酵过程中亚硝酸盐含量的变化
Fig.4 Changes of nitrite content of sour bamboo shoots during the fermentation
在第14天时，纯种发酵和自然发酵酸笋中亚硝酸盐含量最低，分别为0.431 mg/kg和0.716 mg/kg。说明纯种发酵所接种的乳酸菌P51具有高效降解亚硝酸盐的能力，有效减少了酸笋发酵过程中亚硝酸盐的产生，因此纯种乳酸菌发酵酸笋具有更高的食用安全性。
2.5 发酵酸笋的质构分析
发酵后酸笋口感清脆，风味独特，酸笋的硬度和脆度与发酵过程中微生物、酶及原果胶含量有关[15,17]。用质构仪检测2种不同发酵方式酸笋的硬度和脆度，如表2所示，纯种乳酸菌发酵酸笋的硬度和脆度均优于自然发酵，这可能是由于发酵后期，纯种发酵酸笋的pH值较低，抑制了乳酸菌P51的生长，减少了酶类的产生，降低了酸笋中原果胶的水解作用。
表2 不同发酵方式酸笋的质构分析
Table 2 Texture analysis of sour bamboo shoots with different fermentation methods
发酵方式硬度/g脆度/g自然发酵177.752±15.4062.39±0.31纯种发酵238.536±27.5674.82±0.58
2.6 发酵酸笋的感官评价分析
在发酵第14天，自然发酵和纯种发酵酸笋中亚硝酸盐含量均低于国家卫生标准，可用于感官评价。如表3所示，纯种发酵酸笋在色泽和口感上均优于自然发酵，其色泽均匀，呈乳白色，口感清脆，感官脆度与质构分析结果一致；在滋味和风味方面评分略低于自然发酵，自然发酵酸笋香味更浓郁，这可能与自然发酵过程中微生物种类较多有关。综上，纯种发酵酸笋感官评价优于自然发酵酸笋。
表3 不同发酵方式酸笋的感官评分比较
Table 3 Comparison of sensory scores of sour bamboo shoots with different fermentation methods
发酵方式色泽口感滋味和风味总分自然发酵16372174纯种发酵19432789
2.7 发酵酸笋的风味成分分析
通过GC-MS对发酵后酸笋的风味成分进行分析，在自然发酵和纯种发酵酸笋中，挥发性风味成分主要由酯类、醛类、酚类和醇类等物质组成。如图5所示，纯种乳酸菌发酵酸笋中酯类物质含量高于自然发酵，其中乙酸甲酯含量最高(17.56%)，赋予酸笋一定的清香香味，此外乙酸苯酯(5.77%)、庚酸乙酯(2.45%)、辛酸甲酯(2.13%)、亚油酸乙酯(1.97%)、水杨酸甲酯(1.48%)等酯类物质也影响酸笋的风味。纯种发酵酸笋中醛类物质含量低于自然发酵，苯甲醛具有发霉的味道，其含量在2种酸笋的醛类物质中最高，分别为8.71%和16.37%。酚类物质具有一定的刺激性气味，有研究表明对甲苯酚是赋予发酵酸笋酸臭味的最主要成分[7,18]，2种方式发酵的酸笋中对甲苯酚含量分别为11.23%和10.63%。醇类物质具有花果香味[19]，2种方式发酵酸笋的醇类物质含量相近，主要为乙醇、苯乙醇、环乙醇、2-壬醇等物质。此外，醚类、酮类、酸类、烷类和烯类物质在酸笋中也有检出，但其种类和含量较少。
由图5可知，自然发酵和纯种发酵酸笋中风味成分的含量略有不同，但风味物质的种类较为接近，说明纯种乳酸菌发酵酸笋具有和自然发酵酸笋相近的风味。
图5 不同发酵方式酸笋中挥发性风味成分含量
Fig.5 Analysis of olatile flaor components of sour bamboo shoots with different fermentation methods
3 结论与讨论
本研究利用实验室保存的乳酸菌P51接种于发酵酸笋中，分别从食用安全性、品质和风味等方面与自然发酵酸笋进行对比分析。结果表明纯种乳酸菌发酵酸笋显著降低了亚硝酸盐的产生，在发酵第14天时亚硝酸盐含量最低为0.431 mg/kg；pH值、总酸和还原糖含量变化速率较快，缩短了发酵周期；其硬度和脆度均优于自然发酵，且保留了与自然发酵酸笋相近的风味成分。综上，纯种乳酸菌发酵酸笋中亚硝酸盐含量较低，具有更高的食用安全性，且在品质和风味上优于自然发酵酸笋，该研究为低亚硝酸盐酸笋的工业化生产提供了一定的理论依据。
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