异麦芽酮糖(isomaltulose)，又称帕拉金糖，是一种功能性二糖。异麦芽酮糖作为蔗糖的同分异构体，与蔗糖有着相似的口感和物理性质。与蔗糖相比，异麦芽酮糖具有良好的酸稳定性、极低的吸湿性和较高的安全性，在食品中具有广阔的市场应用前景[1-3]。作为新型的甜味剂，异麦芽酮糖还具有甜度低(约为蔗糖甜度的50%)、易于吸收、非致龋齿性和低热量等优点，非常适合肥胖患者、糖尿病人和体育运动员等食用[4-5]。此外，本身为还原糖的异麦芽酮糖还可作为前体生产新型功能性食用糖醇[6]。鉴于其优良的特性，异麦芽酮糖也受到越来越多人的关注。
目前，异麦芽酮糖主要是利用蔗糖异构酶(sucrose isomerase, SIase, EC 5.4.99.11)异构催化蔗糖生成，催化作用如图1所示。然而，游离SIase在工业生产中存在产物的纯化分离难度大，不可回收再利用等缺点，酶固定化成为解决上述问题的手段之一。近年来，关于SIase固定化的研究已有少量报道。CONTESINI等[7]利用微胶囊包埋法和硅藻土吸附法将来源于Erwinia sp.的SIase进行固定化，所得2种固定化酶的酶活力回收率和操作稳定性均较差；为了提高固定化后的酶活力，WU等[8-9]采用ε-poly-L-lysine修饰的介孔TiO2和海绵作为载体固定化SIase，所得固定化酶的酶活力回收率分别为84.5%和93.2%；在此基础上，孟虹等[10]又制备了SIase-Cu2+纳米花固定化酶，在4 ℃保存15 d后仍能保留80%的初始活性，且循环使用6次后，仍剩余40%酶活性。表明固定化明显提高了SIase的操作稳定性和酶活力回收率，且固定化材料较为新颖，但由于生产成本较高，限制了工业化的大规模生产。因此，寻求成本经济、操作简单、酶活力回收率高且操作稳定性良好的SIase固定化方法受到越来越多的关注。
吸附固定化与交联固定化是酶固定化的常用方法。然而，单纯物理吸附所得固定化酶稳定性较差，酶易泄露，且随机的物理吸附无法控制载体表面酶的密度，易形成多层吸附继而对酶的催化活性造成不利影响[11]；而直接通过交联得到的酶聚集体，大小无法控制，对于较大的交联聚集体，大量的酶被包裹在聚集体内部，不易与底物接触，造成酶催化活性降低，且聚集体的机械性能较差，实际应用受到限制[12]。因此在实际生产中常常将这2种方法结合使用，吸附-交联固定化可将酶的回收与固定化同时进行，适用于发酵液中酶的固定化，不仅提高了酶的构象稳定性和固定化酶的机械性能，还具有成本低廉、制备过程简单、酶结合牢固、适用于非特异性载体等优点。硅纳米粒子(silica nanoparticle, SNP)具有机械强度高、化学/热稳定性好、成本低、易获得、不与酶反应、比表面积大等特性，在酶的固定化领域应用广泛[13-14]。
图1 蔗糖异构酶的水解作用和异构化作用的反应机理
Fig.1 Reaction mechanism of SIase-catalyzed hydrolysis and isomerization
本研究拟利用吸附-交联法对SIase进行固定化。首先采用硅纳米粒子为载体对SIase进行吸附，后用戊二醛(glutaraldehyde,GA)对吸附在硅纳米粒子周围的酶进行交联，优化蔗糖异构酶吸附-交联固定化条件，并对固定化酶的酶学性质(催化活性、热稳定性、pH耐受性和操作稳定性)进行探讨，以期得到高效的SIase固定化酶，为其工业化应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌种：毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115，本实验室保藏。
材料和试剂：硅纳米粒子(500 nm，实心球体)，Aladdin；戊二醛(250 g/L)、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4，上海麦克林生化科技有限公司；蔗糖，上海源叶生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、YNB培养基、甘油、琼脂粉，北京索莱宝科技有限公司；甲醇、生物素， 赛默飞世尔科技公司。
1.2 仪器与设备
DYY-6D电泳仪，北京市六一仪器厂；HZS-H水浴恒温振荡器，哈尔滨东联电子有限公司；Mettler-Toledo电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司；Centrifuge 5418小型高速离心机、Heto Drywinner冷冻干燥机、MaxQ6000恒温调速摇床、Multiskan Spectrum酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；WP25AB台式电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 蔗糖异构酶的制备
取适量保存于本实验室-80 ℃冰箱的毕赤酵母，采用三区划线法接种于YPD固体培养基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%琼脂粉)上，于30 ℃恒温培养箱中倒置培养2 d，获得单菌落。将单菌落接种至5 mL的YPD液体培养基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中，30 ℃、220 r/min恒温培养24 h，转移至250 mL的BMGY培养基[1%酵母粉、2%蛋白胨、2%甘油、0.2%生物素、25 mL 10×YNB、磷酸盐缓冲液(1 mol/L，pH 6.0)]中传代培养16 h(30 ℃、220 r/min)；3 000 r/min条件下离心5 min收集菌体，用BMMY培养基[1%酵母粉、2%蛋白胨、0.2%的生物素、25 mL 10×YNB、磷酸盐缓冲液(1 mol/L，pH 6.0)]清洗菌体2遍以除去甘油等物质。最后将菌体重悬于250 mL BMMY培养基中进行诱导培养，每天早晚各加入0.5%(体积分数)的甲醇，30 ℃、220 r/min培养5 d后，将发酵液于3 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，所得上清液即为SIase粗酶液，保存于4 ℃备用。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)测定SIase的纯度。
1.3.2 酶活力测定
将400 μL含有蔗糖(250 g/L)的磷酸盐缓冲溶液(10 mmol/L，pH 6.0)和100 μL适当稀释的酶溶液在2 mL的EP管中充分混合，置于35 ℃水浴中反应10 min，后煮沸5 min以终止反应。利用3,5-二硝基水杨酸比色法(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)测定生成还原糖的量。1个酶活力单位是指1 min内催化蔗糖异构产生1 μmol异麦芽酮糖所需的酶量。固定化酶活力回收率按公式(1)计算：
酶活力回收率
(1)
1.3.3 蔗糖异构酶的固定化
称取25 mg硅球，加入4 mL含一定酶活力的磷酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH 6.0)，于4 ℃振荡吸附一段时间，得到硅球吸附固定化酶(S-CLEAs)；后加入适量戊二醛溶液进行交联，在4 ℃条件下振荡交联一段时间，离心收集固定化酶，用磷酸盐缓冲溶液反复洗涤以除去未交联的游离酶和戊二醛，得到硅球吸附交联固定化酶(S-CLEAs-GA)。
以固定化酶活力回收率为指标，分别研究酶添加量(5.2、6.9、8.6、10.4、12.1 U/mL)、吸附时间(2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)、交联时间(1、2、3、4、5 h)和戊二醛添加量(0.5、0.6、0.8、0.9、1.0 g/L)对固定化效果的影响。
1.3.4 固定化酶的稳定性测定
1.3.4.1 温度对酶活性的影响
为考察温度对SIase固定化前后酶活性的影响，测定了各种酶制剂在不同温度下处理后的剩余酶活力。用10 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)配制等浓度的游离和固定化酶溶液，并将各种酶制剂分别置于不同温度(25～55 ℃)的恒温水浴中处理30 min后，按照1.3.2中的酶活性测定方法，以蔗糖为底物在25 ℃条件下测定各酶制剂的剩余活性。
1.3.4.2 pH对酶活性的影响
为考察pH对SIase固定化前后酶活力的影响，测定了这种酶制剂在不同pH下处理后的剩余酶活力。具体如下：以不同pH的缓冲液[磷酸氢二钠-柠檬酸钠(pH 4.0、5.0),磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH 6.0、7.0)和Tris-HCl(pH 8.0、9.0)]为溶剂，分别配制相同浓度的游离和固定化酶溶液，并将其置于25 ℃水浴摇床中处理2 h；按照1.3.2中的酶活性测定方法，以蔗糖为底物在25 ℃条件下测定各种酶制剂的剩余活性。
1.3.4.3 固定化酶的操作稳定性
取一定量的S-CLEAs和S-CLEAs-GA，配制成相同浓度的固定化酶溶液，在最适反应条件下以蔗糖为底物测定其活性。将反应溶液离心分离去上清液，用磷酸盐缓冲液(10 mmol/L, pH 6.0)反复洗涤，以除去未反应的底物和产物；随后将离心洗涤后的固定化酶重新分散于缓冲液中，加入新的底物进行下一次的反应，如此重复15次。连续测定固定化酶在循环多次后的剩余酶活力，将第一次使用时的酶活力定义为100%。
2 结果与分析
2.1 SIase游离酶的制备
发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析如图2所示，在分子质量约为65 kDa处观察到明显的目的条带，说明发酵上清液中主要含有SIase。
M-蛋白质标准；1-SIase发酵上清液
图2 蔗糖异构酶的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of sucrose isomerase
2.2 固定化酶的制备与优化
在硅球质量浓度为6.25 mg/mL、4 ℃条件下，吸附足够长的时间，以考察不同酶加量对固定化酶活力回收率的影响，结果如图3所示。当酶加量为8.6 U/mL时，酶活力回收率达到最大，为51.7%。但继续提高酶加量，酶活力回收率却明显下降，这可能是由于大量酶沉淀在硅球表面导致聚集，即SIase在载体上形成多层吸附，导致了空间位阻效应，限制了底物的传质，从而催化活性降低[11]。因此，选取初始酶加量为8.6 U/mL。
图3 酶加量对固定化酶活力回收率的影响
Fig.3 Effect of enzyme concentration on actiity recoery of immobilized enzyme
在硅球质量浓度为6.25 mg/mL、加酶量为8.6 U/mL、4 ℃的条件下，研究了吸附时间对固定化酶活力回收率的影响，结果见图4。随着吸附时间的延长，固定化酶的酶活力回收率先增加后降低，在吸附时间为5 h时，载体和酶的作用达到饱和，酶活力回收率达到最大值，为51.5%。当吸附时间大于5 h，酶活力回收率下降明显，这可能是由于酶自身稳定性的限制，酶失活的几率随吸附时间的延长而增加。因此确定吸附时间为5 h，且此时所得的硅球吸附固定化酶命名为S-CLEAs。
图4 吸附时间对固定化酶活力回收率的影响
Fig.4 Effect of adsorption time on actiity recoery of immobilized enzyme
在硅球质量浓度为6.25 mg/mL、加酶量为8.6 U/mL、吸附时间为5 h、4 ℃的条件下，研究了戊二醛添加量对固定化酶活力回收率的影响(图5)。戊二醛是酶固定化制备过程中最常用的交联剂。从图5可以看出，固定化酶活力回收率随着戊二醛添加量的增加先增大后减小，主要是因为戊二醛既可作为交联剂又是酶的变性剂[15]。当加入少量戊二醛时，酶因为在硅球表面不充分的交联而导致酶活力回收率较低，且在使用过程中酶易脱落，损失较多；继续提高戊二醛添加量后，酶活力回收率下降，这是由于过量的戊二醛造成了酶分子之间的过度交联，且将过多的酶交联在一起，影响了酶蛋白的活性[12]；当戊二醛添加量为0.08%时，S-CLEAs-GA的酶活力回收率最高，达到44.9%。因此，S-CLEAs-GA的最适戊二醛添加量为0.08%。
图5 戊二醛添加量对固定化酶活力回收率的影响
Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on actiity recoery of immobilized enzyme
在硅球质量浓度为6.25 mg/mL、加酶量为8.6 U/mL、吸附时间为5 h、戊二醛添加量为0.08%、4 ℃的条件下，研究了交联时间对固定化酶活力回收率的影响，结果如图6所示。当交联时间为2 h时，酶活力回收率达到最高值，为44.2%。继续延长交联时间，酶活力回收率下降趋势明显。这可能是由于过长时间的交联，导致形成的固定化酶的网络结构太过紧密，使S-CLEAs-GA空间位阻变大，阻碍了酶与底物的接触，造成酶活力的下降[16]。因此，制备S-CLEAs-GA的最佳交联时间是2 h。
图6 交联时间对固定化酶活力回收率的影响
Fig.6 Effect of cross-linking time on actiity recoery of immobilized enzyme
采用吸附法和吸附-交联法对SIase进行固定化，并对其固定化条件进行了优化，确定最优的固定化条件为：加酶量为8.6 U/mL，吸附时间为5 h，戊二醛添加量为0.08%，交联时间为2 h。得到2种固定化酶，硅球吸附固定化酶(S-CLEAs)和硅球吸附-交联固定化酶(S-CLEAs-GA)，酶活力回收率分别为51.2%和44.9%。
2.3 固定化酶的酶学特性
温度对游离酶和固定化酶活性的影响见图7。随着温度的上升，游离酶和固定化酶的活性也随之降低，且当处理温度较高时，酶制剂活性急剧下降，这可能是由于高温引起的酶的变性所致[17]；但固定化酶在实验测定所有温度下均表现出较高的抗热应力稳定性。
图7 温度对游离SIase和固定化酶活性的影响
Fig.7 Effect of temperature on the actiities of free SIase and immobilized enzyme
为了进一步研究固定化酶在极端pH条件下的耐受性，将各种酶样品置于不同pH缓冲溶液中处理并测定其剩余活性，结果如图8所示。可以看出，游离SIase受环境酸碱度变化的影响更大，且在酸性环境中活性下降的更为明显。在相同处理条件下，固定化酶的耐受性提高，尤其是在酸性环境中，说明SIase的固定化有利于稳定酶的结构[18]。
图8 pH对游离SIase和固定化酶活性的影响
Fig.8 Effect of pH on the actiities of free SIase and immobilized enzyme
稳定性实验结果表明，与游离酶相比，固定化酶表现出优异的热稳定性和pH耐受性。将SIase通过非共价键吸附固定在硅球表面(S-CLEAs)，由于不涉及共价键的形成，很大程度地保留了酶分子结构的完整性，减少了因构象变化造成的活性损失[19-20]。而S-CLEAs-GA主要是酶分子间通过交联剂多点共价连接在硅球的周围，这样可增强酶的刚性、提高构象稳定性、防止酶的构象转变并保护酶结构不被破坏，增强了酶抵抗外界条件的能力[21-22]。但由于交联对酶分子构象的影响较大，与S-CLEAs(51.2%)相比，S-CLEAs-GA的酶活力回收率比较低(44.9%)。
2.4 固定化酶的操作稳定性
固定化酶的重复使用稳定性对其工业应用具有重要意义。以蔗糖为底物，分别考察了S-CLEAs和S-CLEAs-GA在连续使用15次后酶活力回收率的变化，结果见图9。可以看出，随着循环使用次数的增加，2种固定化酶的酶活力回收率都有所降低。循环使用15次后，S-CLEAs和S-CLEAs-GA的酶活力回收率分别为55.1%和77.9%。表明S-CLEAs-GA的操作稳定性明显优于S-CLEAs，主要是由于S-CLEAs在连续振荡、回收、洗涤、重复使用等频繁处理过程中，吸附在载体表面的酶脱落，引起整个反应体系中酶活力的降低[23]。而经戊二醛交联所得的S-CLEAs-GA面对这些操作时，可以很好地将酶保留在载体的表面。此外，在重复使用过程中酶的变性也是固定化酶活力损失的一个重要原因[24]。THMTURK等[25]将聚乙烯亚胺包裹在SNP表面，并以此为载体通过静电吸附固定化乙酰胆碱酯酶，所得固定化酶的酶活力回收率为91%，但在重复使用12次后，其相对活性就降到50%以下；随后，NGUYEN等[26]用活性炭颗粒吸附漆酶后所得固定化酶循环使用12次后，可保留初始活性的71%；本实验室前期制备的交联磷脂酶D聚集体，在最适条件下的酶活力回收率高达118.8%，但重复使用10次后，仅保留50.4%的初始活性[27]。这些结果都说明吸附-交联固定化所得的S-CLEAs-GA不仅具有较高的催化活性，且优异的操作稳定性使其在实际生产中具有更强的竞争力。
图9 固定化酶S-CLEAs和S-CLEAs-GA的重复使用性
Fig.9 Reusability of S-CLEAs and S-CLEAs-GA
3 结论
本文以硅纳米粒子为载体，戊二醛为交联剂，利用吸附法和吸附-交联法固定化蔗糖异构酶，得到S-CLEAs和S-CLEAs-GA两种固定化酶。在酶加量为8.6 U/mL、吸附时间为5 h时，S-CLEAs的最大酶活力回收率为51.2%；随后加入0.08%的戊二醛、交联2 h后，得到的S-CLEAs-GA的最大酶活力回收率为44.9%。固定化酶表现出优异的的热稳定性和pH耐受性，且S-CLEAs-GA的稳定性优于S-CLEAs。在重复使用15次后，S-CLEAs和S-CLEAs-GA仍然能够保持55%以上的初始酶活力。表明此方法得到的固定化酶拥有良好的酶活力回收率和操作稳定性，其性能远优于游离酶，具有良好的发展前景。
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