色泽是反映肉和肉制品新鲜度和品质最直观的指标，直接影响消费者的购买意愿，其主要由肌红蛋白(myoglobin, Mb)中铁离子的氧化还原状态决定。Mb由1条多肽链和1个辅基血红素组成，在牛肉、猪瘦肉等肌细胞中大量存在，起着储存和分配氧的功能，一般有脱氧肌红蛋白(deoxymyoglobin, DeoMb, MbFe2+)、氧合肌红蛋白(oxymyoglobin, OxyMb，MbFe2+O2)和高铁肌红蛋白(metmyoglobin, MetMb，MbFe3+)3种形式，分别呈紫红色、鲜红色和棕褐色[1]。在新鲜肉中，Mb主要以OxyMb形式存在，其中铁呈+2价并与O2配位结合而呈鲜红色。随着放置时间的延长，Mb中的铁逐渐被氧化成+3价而转变为MetMb，肉的颜色也随之变为棕褐色。由于Mb中铁的易氧化性，致使肉品在贮藏及加工过程中极易发生明显的颜色变化，从而造成其商品价值的降低。
除了可与O2配位结合以外，Mb也可与NO、CO结合生成亚硝基肌红蛋白(nitrosylmyoglobin，MbNO)和碳氧肌红蛋白(carboxymyoglobin，MbCO)，二者均呈鲜红色。因此，在肉制品加工过程中，在国家相关标准和法律法规许可范围内采用一定化学或物理方法选择性改变Mb结构以改善肉的色泽，这对提高产品的商业价值和竞争力有重要作用。目前常用的肉品发色方法的原理都是通过将Mb转变为MbNO或MbCO。本文对已有的能够改变Mb结构从而改变肉品色泽的化学、物理方法的原理、应用及不足进行了总结并对其未来发展方向进行了分析，以期为相关研究和产业应用提供参考。
1 化学方法
1.1 亚硝酸盐
亚硝酸盐作为最常用的发色剂，其应用可以追溯到古代：过去人们使用卤水、海水等腌制肉品以便长期保存，被腌制后的肉品具有鲜艳的红色，其机制正是由于卤水、海水中的亚硝酸盐与Mb反应生成了MbNO[2]。亚硝酸盐发色的原理是其在鲜肉的酸性条件下(主要是乳酸造成)生成亚硝酸[反应式(1)]，后者极不稳定，易分解生成NO[反应式(2)]，后者可与Mb结合生成MbNO[反应式(3)][3]。
(1)
HNO2+H++e-→NO+H2O
(2)
Mb Fe2++NO→MbFe2+-NO
(3)
虽然目前亚硝酸盐仍被广泛应用于腌肉制品加工，但其也有明显的不足之处。首先，亚硝酸盐与胃酸反应会生成N2O3，后者可与人体蛋白质代谢产物仲胺类化合物结合生成具有致癌性的N-亚硝胺[反应式(4)][4]，这是亚硝酸盐作为食品添加剂的最大问题。另外，亚硝酸盐具有强氧化性，过量食用会导致血液中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，诱发高铁血红蛋白血症[5]，造成人体组织中毒、呼吸中枢麻痹等与缺氧有关的症状，甚至引起窒息和死亡。此外，大量摄入亚硝酸盐也会干扰碘代谢，降低甲状腺对碘的吸收，导致甲状腺肿大[6]。由于上述原因，亚硝酸盐在肉制品加工中的应用受到严格限制。联合国粮农组织和世界卫生组织规定每日允许摄食量≤0.2 mg/kg(体重，以亚硝酸钠计)，我国相关国家标准(GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》)也规定腌腊肉制品中亚硝酸盐最大添加量为 0.15 g/kg，最大残留量为30 mg/kg(以亚硝酸钠计)。
除腌肉制品以外，还有研究显示亚硝酸盐对新鲜鱼体也有明显的发色作用。王晶[7]将罗非鱼置于含0.5～2.0 g/kg亚硝酸钾的溶液中暂养一定时间(0.5～2.0 h)后发现，鱼片的a*值明显增大。亚硝酸盐活体发色的原理是其通过血液循环传输到鱼肌肉组织中并与肌红蛋白结合生成MbNO。用亚硝酸钾溶液处理鱼片也得到了类似的结果，且鱼片中亚硝酸盐含量均未超出国家标准。
虽然亚硝酸盐具有一定的潜在危害，但由于其对肉制品色泽、质地、风味等的改善作用，及其较强的抑制微生物增殖的能力，目前尚未有能完全替代亚硝酸盐的方法。提高亚硝酸盐使用安全性以及寻找亚硝酸盐替代物仍是重要研究内容。
1.2 植物提取物
近年来，植物源发色剂受到了越来越多研究人员的关注，它具有来源广泛、发色效果好、绿色健康、富含多种天然活性成分和色素等优点，并具有一定的抑菌和改善肉制品风味的作用。已有研究显示，芹菜、甜菜、菠菜和生姜等多种植物提取物都具有改变Mb结构并实现发色的作用，其原理为这些植物都富含硝酸盐，后者在具有硝酸盐还原能力的微生物(如菌瓦式微球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌等)的作用下被还原成亚硝酸盐[8]，进而实现发色。因此，植物源发色剂在使用前都需要经微生物发酵处理，将其中的硝酸盐转变为亚硝酸盐。
芹菜粉因硝酸盐含量高、植物色素含量低、风味温和等优点，是一种常用的植物源发色剂。为避免使用前发酵带来的繁琐，有研究人员将芹菜汁液经发酵、浓缩等处理后得到亚硝酸盐含量为10～15 g/kg的浓缩液，后者可直接商业化应用[9]。此外，研究发现相比于亚硝酸盐，植物源发色剂能有效减小腌肉制品中亚硝酸盐残留量，其可能的原因是植物源发色剂含有多种抗氧化剂(还原剂)，后者能促进亚硝酸盐分解为NO[10]。常见的植物源发色剂及其应用如表1所示。
表1 常见植物源发色剂及其应用
Table 1 Common botanical colorants and their applications
植物发色剂种类应用主要结论参考文献芹菜提取物将发酵后的芹菜汁粉应用于肉的腌制处理后的腌肉与亚硝酸钠腌制的肉具有相似的品质特性[11]使用芹菜粉腌制作香肠0.8%的芹菜粉增加了香肠的红度值并能有效地保护香肠在贮存过程中不变质,可作为亚硝酸钠的有效替代品,用于生产符合标准的香肠[12]甜菜提取物以RC4发酵乳杆菌和B6植物乳杆菌为发酵剂,配合甜菜红色素等着色剂,乳酸链球菌素为抗生素,替代亚硝酸盐腌制腊肉以该植物发色剂腌制的腊肉的a*值达到了28.89,远高于亚硝酸盐添加组(a*=16.1),且前者表现出更低的亚硝酸盐残留量、更好的感官特性、更高的游离脂肪酸含量和更多的挥发性化合物[13]使用甜菜粉与糖基化酰基血红蛋白复合物腌制中式香肠甜菜粉的添加不仅可有效降低产品中亚硝酸盐残留量,还具有较好的助色效果,且不会影响香肠的质构特性[14]欧芹提取物将欧芹提取物粉末应用于香肠生产添加欧芹提取物和添加亚硝酸盐的香肠具有相近的红度,同时欧芹提取物还具有良好的抑菌作用[15]菠菜提取物使用发酵菠菜作为天然亚硝酸盐源,腌制猪里脊肉菠菜提取物的添加明显提高了腌制的猪里脊肉的红度,同时抑制了脂质氧化和微生物增殖[16]生姜提取物使用生姜提取物混合亚硝酸盐对肉糜进行发色生姜提取物能有效降低腌制肉糜中亚硝酸盐残留量,并提高了发色效果[17] 胡萝卜提取物使用胡萝卜提取物发酵干香肠添加1%胡萝卜粉和150 mg/kg亚硝酸钠的干香肠具有相近的红度值,均显著高于对照组[18]
虽然植物源发色剂有诸多优点，但也存在如下不足：(1)植物提取物一般都有独特的风味和颜色，会一定程度上改变肉制品原有的风味。为防止对肉制品风味产生不良影响，一般植物源发色剂的添加量都较低，如芹菜浓缩物的添加量通常控制在0.2%～0.4%[19]；(2)发酵后的植物源发色剂虽然含有较高浓度的亚硝酸盐，但其在肉制品加工中的推荐使用量并不能完全抑制腐败微生物的增殖，因而需要额外的减菌处理；(3)植物提取物中硝酸盐含量受收获条件、地域、植物自身特性等多种因素的影响，同时硝酸盐的还原程度也受发酵时间、温度和pH等影响，因此最终所得的植物源发色剂中亚硝酸盐含量难以控制；(4)植物源发色剂还可能会引起部分人群发生过敏现象。为避免此问题，研究人员开发了一系列不含过敏原的发色剂，例如使用喷雾干燥技术从不含过敏原的瑞士甜菜中提取的甜菜发色剂[20]。因此，如何实现植物源发色剂的规范化生产和应用是该技术实现广泛实际应用所需突破的瓶颈问题。
1.3 NO
近年来，有部分研究人员尝试利用NO溶液和NO气体发色肉制品。溶液发色是指将NO气体通入到含有一定浓度还原剂的脱氧的水中一定时间以制备饱和发色液，将待发色样品置于发色液中一段时间以实现发色。气体发色通常是将发色样品置于经惰性气体稀释的NO气体中并保存一定时间。已有研究表明，NO发色速度快，效果稳定，且亚硝酸盐残留量(约20 mg/kg)低于国家对加工肉制品亚硝酸盐含量的限量标准(30 mg/kg)。此外，鱼肉中的研究还显示NO可有效延缓样品的pH变化、抑制挥发性盐基氮的生成和减小滴水损失等，这表明NO可延缓鱼体腐败、保持鱼肉品质。关于NO发色的研究如表2所示。
表2 NO在肉制品发色中的应用
Table 2 Applications of NO in coloring of meat products
发色方式应用主要结论参考文献含NO的溶液处理肉制品使用NO溶液(含0.05 %抗坏血酸)处理罗非鱼片冷藏15 d后样品中红色肉的a*值从初始的3.20增加到8.15,白色肉的a*值从1.87增加到2.84,这表明NO溶液能显著提高其红度(P<0.05)[21]使用含NO溶液浸泡腌肉NO溶液浸泡提高了产品红度并使其保持稳定[22]NO气体直接处理肉制品使用V(NO)∶V(N2)=0.4∶99.6气调包装保藏罗非鱼片NO气调包装显著改善了鱼片在贮藏过程中的品质,使鱼片保持良好的鲜红色泽(a*=15.37)并长时间保持稳定,且鱼片更柔软,滴水损失减小,保质期延长[23]
虽然NO作为发色剂具有一定的应有前景，但也有明显的不足。NO具有较强的刺激性和一定的毒性，这是限制该方法应用的主要原因。另外，NO易与空气中的O2接触而生成NO2，进而生成亚硝酸根[反应式(5)～(6)][24]，最终可能会生成亚硝胺等致癌物。因此，如何提高NO发色工艺的安全性以及抑制有毒有害副产物的生成是实现该方法实际应用的重要研究内容。
NO+O2→NO2
(5)
NO+NO2+H2O→HNO2
(6)
1.4 CO
除了O2和NO，CO也可与Mb辅基血红素中的铁配位结合生成呈鲜红色的MbCO。由于Mb与CO的亲和力远大于其与O2的亲和力，且生成的MbCO极其稳定，因此CO发色的肉制品可长时间保持鲜红色[25]。CO发色的常用形式有气调、浸泡和活体发色3种。气调发色是指将肉品暴露在经CO2、N2、空气等稀释的CO气体(0.1%～5.0%)中一定时间，浸泡发色是将CO溶解于碱性液体中制成发色液，利用后者对样品进行浸泡处理。活体发色主要用于水产品，将CO通入水中并经高压高速旋转剪切后形成微米级气泡，发色对象通过呼吸作用吸入CO，后者经血液循环而与Mb结合生成MbCO，此种方法的发色时间短且发色均匀。已有的关于CO发色的研究如表3所示。
表3 CO在肉品发色中的应用
Table 3 Applications of CO in coloring of meat products
发色方法应用主要结论参考文献气调发色使用0.1% CO+40%～60% CO2+60%～40% N2的混合气体对新鲜金枪鱼肉进行发色混合气体可有效提高金枪鱼肉的红度值并长时间保持稳定[26]使用0.4% CO+30% CO2+69.6% N2对牛肉气调包装保存牛肉在货架期内呈现鲜红色,且不会影响消费者对于牛肉新鲜度的判断[27]浸泡发色在0 ℃条件下使用3.5%氨水溶解CO制成发色剂对罗非鱼片进行浸泡发色CO浸泡处理能有效改善罗非鱼的色泽,使得鱼肉维持了较好的红度[28]活体发色对鲑鱼活体进行CO处理CO活体发色的鱼片色泽优良,呈鲜红色,CO消耗量低且省时(10 min)[29]
由于MbCO的高稳定性，CO发色后样品能长时间保持鲜红色，因此可能会掩盖腐败。另外，由于CO对健康可能造成的危害，因此目前CO发色已被多国禁止。针对前者，有研究人员建议使用低浓度CO气调发色，这样既能达到在货架期内良好的发色效果，又不会掩盖货架期后肉品的腐败变质[30]。针对CO可能带来的健康危害，多位研究人员的工作显示发色所需的CO浓度不足以影响血液中碳氧血红蛋白浓度，因此不足以对人体造成健康风险[31]。因此，CO发色仍具有应用前景，但也需对其工艺和其在体内的演变进行更深入研究。
2 物理方法
2.1 冷等离子体(cold plasma, CP)
等离子体是指气体在加热或强电磁场作用下被部分或完全电离成电子、正负离子、基态或激发态原子或分子等多种粒子的混合体系，是物质存在的第四态。根据其温度的不同，等离子体可分为高温等离子体和低温等离子体，后者又可分为热等离子体和CP[32]。作为一种新兴的食品非热加工方法，CP具有环境友好、应用范围广等优点，目前在杀菌、延长食品货架期方面已有较多研究。
除了上述应用以外，近期还有研究显示CP处理可以通过改变肉品中Mb结构而实现发色。CP发色的原理为N2和O2在等离子体处理过程中被电离生成N、O等，后二者可与O2、N2等反应生成多种氮氧化合物[反应式(7)～(11)][33-34]。生成的NO可与Mb结合生成MbNO，从而实现发色。
e+O2→O-+O
(7)
e+N2→N+N(2D)+e
(8)
O+N2→NO+N
(9)
N+O2→NO+O
(10)
NO+O3→NO2+O2
(11)
目前关于CP的研究总结如表4所示。
表4 CP处理用于肉品发色的研究 Table4 Studyon the direct CP treatment in the coloring of meat products
发色种类应用主要结论参考文献CP处理肉糜在火腿肉糜斩拌过程中施加大气压CP处理大气压CP处理15 min的火腿肉糜与添加64.72 mg/kg亚硝酸钠制成的火腿贮藏30 d后,颜色、脂肪氧化程度、亚硝基色素含量等都基本相同[35]利用低温等离子体处理灌装火腿的肉糜低温等离子体处理30 min与添加42 mg/kg亚硝酸盐的肉糜a*值分别为6.67和6.31,二者相近,表明低温等离子体直接处理可有效诱导Mb发色,可作为一种火腿腌制过程中亚硝酸盐的替代方法[36]使用常压冷等离子体(atmospheric pressure plasma,APP)处理肉糜APP处理增加了肉糜中亚硝酸盐含量,提高了腌制后产品的红度。此外,APP的减菌作用明显优于直接添加亚硝酸盐[37]CP处理肉块使用空气冷等离子体直接处理腌制猪肉干APP处理60 min的猪肉干红度(a*=17.58)大于亚硝酸盐(100 mg/kg)添加组(a*=15.29)[38]
CP作为一种新型发色方法，具有清洁环保、发色效果好等优点，在一定条件下可替代亚硝酸盐而用于肉品加工，但其也存在以下不足：(1)CP直接处理过程中除了生成NO以外，还会生成多种活性氧基团，后者可能会引起食品中蛋白质、脂质等营养成分的氧化，导致肉制品褐变及营养成分的变化。(2)CP处理需要高压电源、等离子体发生装置、控制装置等，因此投入相对较高，且高压可能会带来一定的安全隐患。(3)其发色机制也还未完全明确。因此，该技术的实际应用还需要更深入细致的研究。
2.2 等离子体活化水(plasma activated water, PAW)
PAW指等离子体处理后的水。已有多项研究显示PAW可诱导肉制品中Mb形态的变化，从而实现发色。并且，PAW处理的肉制品在感官特性等方面都接近于直接添加亚硝酸盐。PAW发色原理为等离子体处理下生成的NO、NO2等多种氮氧化物溶解于水生成亚硝酸根、硝酸根等[反应式(12)～(15)]，后者被还原生成了NO。并且，PAW呈弱酸性，其中的亚硝酸盐会与H+反应并生成亚硝酸[反应式(16)]，更有利于发色[39]。PAW发色相关研究总结于表5。
(12)
(13)
(14)
(15)
↔HNO2
(16)
作为一种新型发色方法，PAW具有发色效果显著、氧化弱等优点，有效避免了等离子体产生的多种活性氧/活性氮基团引起的氧化损伤。但PAW的实际应用还需对等离子体处理条件，发色工艺等进行更深入的研究。等离子体工作气体(如空气、氮气、氧气、氩气等)及作用方式(如介质阻挡放电，等离子体射流等)都对PAW中各种成分及其含量有显著影响。例如，INGUGLIA等[45]分别对水进行了空气和氮气离子体射流处理，结果显示，2种条件下处理10 min后所得PAW中亚硝酸含量分别为90～184 mg/kg、3～17 mg/kg。目前关于PAW发色的研究还集中在效应研究阶段，对其发色工艺及其可能的负面作用都还鲜有涉及。因此，需要根据样品不同对PAW制备及发色条件、对样品各成分的影响等进行更深入细致的研究。
表5 PAW在肉制品发色中的应用
Table 5 Applications of PAW in coloring of meat products
应用主要结论参考文献PAW处理肉糜将PAW添加至制备乳化型香肠的肉糜中使用PAW(a*=5.48)处理的肉糜和添加亚硝酸盐(a*=5.85)、芹菜发色剂(a*=5.40)组红度相近,表明PAW可用于肉制品发色[40]采用PAW处理肉糜PAW处理的肉糜红度(a*=7.8)低于亚硝酸盐添加组(a*=10.4),但明显高于空白对照组(a*= 2.0)[41]使用射频PAW腌制火腿肉(猪肉糜)PAW处理的火腿肉红度(a*=8.22)显著高于添加焦磷酸钠的对照组(a*=3.48),且较高于亚硝酸钠添加组(a*=7.67),表明PAW可替代亚硝酸盐用于火腿腌制[42]PAW处理肉块采用PAW处理猪里脊肉PAW处理的猪里脊肉红度明显增加,并且脂质氧化受到明显抑制,表明PAW可替代亚硝酸盐用于肉制品腌制[43]使用空气PAW处理通脊火腿肉PAW直接处理通脊火腿肉,可有效地对其进行发色,可作为火腿制作过程中亚硝酸盐替代品[44]
3 物理化学耦合发色
除上述化学和物理方法外，还有研究显示使用物理、化学耦合方法能更有效改变Mb结构而实现发色。类似于PAW，冷等离子体处理能够显著增加植物提取物中亚硝酸根和硝酸根等发色基团的含量，后二者在植物中各种还原剂的作用下被还原生成NO，从而实现发色。本文将物理化学耦合发色的相关研究总结于表6。对影响该方法的因素、可能生成的副产物及其影响等都还需进一步深入研究。
表6 物理化学耦合技术在肉品发色中的研究
Table 6 Study on the physical and chemical coupling methods in coloring of meat products
发色方法应用主要结论参考文献CP处理植物用于诱导肌红蛋白发色将CP处理后的紫苏汁冻干粉用于肉酱腌制添加CP处理的紫苏汁冻干粉末的熟肉酱相较于对照组(a*=1.50)呈现了更好的红度(a*=4.29)。[46]对含有30%(质量分数)蛋清的洋葱粉混合物进行常压CP处理并经冷冻干燥得到粉末,将所得粉末用于腌制香肠经APP处理的混合粉末使得腌制香肠的红度(a*=3.54)明显高于对照组(a*=-2.28),可以作为肉制品加工过程中亚硝酸盐的有效替代物[47]对海芦笋进行CP耦合超声处理,使用处理后的海芦笋提取物替代亚硝酸钠腌制意大利香肠添加CP处理的海芦笋提取物的意大利香肠(a*=15.96)与亚硝酸盐腌制组(a*=18.81)呈现了相近的红度,并且表现出了良好的抗氧化性,可有效替代亚硝酸盐用于香肠腌制[48]CP处理菌类由于诱导肌红蛋白发色对冬菇粉末进行CP处理,使用处理后的冬菇粉末腌制肉糜火腿使用CP处理的冬菇粉末腌制的碎肉呈现出良好的红度(a*=8.8),与亚硝酸盐添加组(a*=7.9)相近,并能有效地抑制脂质氧化,制得的香肠具有良好的质地[49]
4 结语
目前已有的通过改变Mb结构而发色的化学、物理方法中，直接添加亚硝酸盐仍最常用，其不仅能改善肉品色泽，还具有抑菌、改善风味等作用，但其安全性是最受关注的问题。因此，提高亚硝酸盐的使用安全性以及寻找亚硝酸盐有效替代物一直都是肉制品生产和研究的重要内容。植物源发色剂作为一种新型天然发色剂，具有来源广泛、发色效果佳等优点，但也存在对产品风味产生一定负面影响、抑菌能力弱、发色效果受多种因素制约等不足，降低其对产品风味等的影响和标准化生产与应用是其未来应用的重要研究内容。NO和CO气体发色均具有发色快、效果好且稳定等优点，但前者具有极强的刺激性，后者具有极大的安全隐患，且CO发色的产品所具有的长期稳定红色还有掩盖腐败变质的弊端。因此，提高气体发色工艺的安全性和发色后肉制品的食用安全性等都需要深入研究。CP作为一种新型非热加工方法，其本身及PAW都具有发色作用，是亚硝酸盐的一种可能替代方案，但也具有对被发色样品造成氧化等负面影响。优化CP发色的工艺参数和减弱其对发色样品的负面影响是该技术实际应用所需解决的瓶颈问题。物理化学耦合方法作为新型肉品发色方法，其优势及可能的不足都需进一步的研究。本文内容可为相关研究和产业应用提供参考。
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