近年来食品生产加工过程的微生物污染导致严重的安全问题，对消费者的健康构成巨大威胁。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐的食源性致病菌，广泛存在于海产品中，可直接依附在海产品的表面形成生物被膜。生物被膜又称生物膜、菌膜等，是由吸附于固体表面或气液界面的微生物相互黏附在一起，并嵌入其所分泌的胞外多聚物中而形成的固着微生物群落。副溶血性弧菌一旦形成生物被膜，会对外界刺激产生抗性并且会促使更多细菌协同共生，同时生物被膜具有严重的致病性，会导致难以解决的食品质量安全问题。
常见用于控制致病菌生物被膜的方法主要分为物理和化学技术，包括超声波、低电流、抗生素等。苏泽红等[1]发现布鲁姆林式脉冲系统能有效杀灭副溶血性弧菌,且细胞毒性下降；许愈等[2]的研究表明，仅用超声波处理，副溶血性弧菌的数量只减少了0.63 lgCFU/mL；而这些方法对生物被膜的控制具有局限性，如成本高、效率低、出现耐药性，对人类和环境产生负面影响。
光动力灭活(photodynamic inactivation, PDI)是一种新型杀菌技术，以其优良的杀菌效果、成本低等优点受到了广泛的关注。PDI的原理是采用特定波长的光源激发光敏剂(photosensitizer，PS)以产生活性氧化物氧化破坏蛋白质和DNA等生物大分子，从而实现对病原微生物的有效灭活。PS是决定PDI效果的关键因素，它可以提高PDI的有效性、选择性和安全性，然而部分天然PS存在水溶性低的问题，因此目前PDI的大部分研究集中在天然PS的合成或改进。
姜黄素(curcumin, CUR)具有来源广泛、毒副作用小、光效率高等特点，已成为食品杀菌领域最有潜力的天然PS[3]。CORR
A等[4]发现，CUR介导的PDI可以显著减少牛肉、猪肉和鸡肉中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的污染。HUANG等[5]研究表明，CUR介导的PDI技术通过破坏胞内DNA和蛋白质可以有效控制单核细胞增生李斯特氏菌浮游菌及其生物被膜的形成。尽管CUR在PDI中具有显著作用，但由于其低溶解性，在食品工业中的应用受到限制[6]。因此，研究如何提高CUR的溶解度是很有意义的。
共晶是由药物活性成分和共晶形成物之间通过分子相互作用(氢键、范德华力等)形成，不改变组分的各自结构，而使物理化学性质(如溶解度、生物利用度)得到改善[7]。为了提高CUR的溶解度并保持其原有的光敏特性，已尝试将CUR分别与氨基酸、酸、糖、羟基喹啉和苯三醇合成共晶[8]，然而目前关于CUR共晶应用于PDI的研究较少。本研究通过制备姜黄素的D-酪氨酸共晶(CUR-D-Tyr co-crystals, CDC)，探究CDC介导的光动力对副溶血性弧菌及其生物被膜的作用效果，并初步研究其作用机制，为食品的非热加工提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
副溶血性弧菌ATCC17802，广东微生物菌种保存中心；姜黄素(纯度>98%)，上海谱振生物科技有限公司；D-酪氨酸(Tyr)，上海麦克林生物化学有限公司；LED灯(450～460 nm，20 W)，江苏徐州爱佳电子科技有限公司；TSB培养基，广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂，广东广州铎洋生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
D8 ADVANCE粉末X射线衍射，德国布鲁克公司；STA449F5热重分析仪，德国耐驰公司；FP-1100-C全自动生长曲线仪，芬兰Bioscreen公司；UV-1800PC紫外-可见光分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；LD-Y96A多功能微孔板读板机，山东莱恩德公司；LSM 800高分辨率激光共聚焦显微镜，德国蔡司公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 共晶的制备
量取100.0 mg姜黄素和50.0 mg D-Tyr(摩尔比为1∶1)，分别用100 mL无水乙醇、25 mL PBS(pH=6.0)溶解，随后混合上述溶液，避光连续搅拌3 h，置于黑暗处贮藏直至溶液完全挥发，最终得到自然挥发制备的姜黄素共晶(CDC)；按上述同样的条件混合溶液后，避光连续搅拌3 h后，在50 ℃下减压蒸馏，最终得到减压蒸馏制备的姜黄素共晶(CDX)；按同样的比例混合CUR和D-酪氨酸，用研钵将其研磨至颜色均匀的粉末，即得研磨制备的姜黄素共晶(CDY)[9]。
1.3.2 粉末X-射线衍射
通过粉末X射线衍射分析样品晶体结构[10]，测试条件为：扫描角度为5～50 ℃，速度为0.02 ℃/s，Cu靶，λ=1.540 598 A，步长为0.013 130 3°。
1.3.3 溶解度的测定
溶解度根据田会婷等[11]和刘红星等[12]的方法进行改进。分别建立CUR、CDC、CDX、CDY的标准曲线，在10 mL刻度试管分别加入不同体积的母液(0.06 g/L)，用体积分数为95%的乙醇定容使各试管终质量浓度为0.001、0.002、0.004、0.008、0.012、0.016 g/L，再以同样浓度的乙醇为参比液在425 nm处测定吸光度。用0.5%乙醇分别溶解过量的姜黄素及3种姜黄素共晶，将其在4 000 r/min下离心5 min，测定上清液在425 nm处的吸光度。
1.3.4 菌株的培养
取微量甘油保存的副溶血性弧菌(ATCC17802)在TSB固体培养基上划平板，置于恒温培养箱过夜活化，再挑取单菌落接种到10 mL TSB液体培养基，置于恒温摇床(200 r/min)过夜培养，传代2次后将其稀释至6 lgCFU/mL备用。
1.3.5 PDI对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度
通过自动生长曲线分析仪测定CUR和CDC介导的PDI对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)[13]。往100孔板的样品孔中加入100 μL TSB培养基，再往第一列样品孔加入100 μL 0.3 mg/mL的药液，采用二倍稀释法进行梯度稀释，弃去最后一列孔中100 μL的废液，再往每个孔中加入100 μL 6 lgCFU/mL的菌液，置于LED蓝光下(20 W，40～45 mW/cm2，450～460 nm，下同)照射20 min。再添加同等条件下的黑暗孵育组，设置两组对照，分别加入无菌水(control)和1%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，每个浓度设置3个平行，下同。最后测定每隔1 h的生长曲线，周期为18 h。
1.3.6 结晶紫定量检测生物被膜生物量
参考罗俊[14]的方法，往96孔板的每个样品孔中加入100 μL的菌液，再往孔板中分别加入系列不同质量浓度(0.010、0.005 0、0.002 5、0.00 g/L)的药液，蓝灯下光照20 min，置于恒温培养箱中孵育24 h后，弃去孔板中溶液，往每个孔中注入200 μL无菌水洗涤，重复3次。接着每个样品孔中注入200 μL结晶紫染色15 min，弃去废液，用流水缓慢冲洗孔板，将多余的染料冲走，最后再往每个样品孔中加入200 μL体积分数为95%的乙醇，静置15 min后测定其在570 nm下的吸光度，观察其对生物被膜的抑制效果。
1.3.7 酶解实验
在96孔板中培养生物被膜至成熟后，往实验组分别加入0.1 g/L 200 μL Proteinase K、2.0 mg/mL DNaseI和10 μmol/L高碘酸钠，对照组加入无菌水，恒温培养3 h，最后弃去孔板中溶液，用无菌水洗涤3次，根据1.3.6的方法使用结晶紫染色处理，于570 nm 下测定吸光度[15]。
1.3.8 胞外聚合物的提取
取1 mL 6 lgCFU/mL的菌液注入24孔板，分别添加不同质量浓度的药液(0.005 0、0.002 5、0.001 3、0.00 g/L)，光照20 min，恒温培养24 h，弃去孔板中菌液，无菌水洗涤3次。沥干多余水分后往每个样品孔中加入1 mL无菌PBS(pH=7.0)，反复吹打直至被膜脱落，收集被膜混合液，细胞破碎仪破碎8 min后，在12 000 r/min下冷冻离心10 min，收集上清液。往上清液中加入15 mL无水乙醇，置于4 ℃下避光贮藏24 h，同样条件下离心30 min，弃去上清液，用无菌水洗涤3次，再加入18 mL无菌水，超声至完全溶解，冷藏备用。
1.3.9 光动力对生物被膜胞外聚合物的影响
1.3.9.1 对胞外DNA的影响
向5 mL 6 lgCFU/mL的菌液中分别加入1.6 mL 0.01 mg/mL的CUR和CDC，置于蓝灯下照射20 min后再置于摇床中孵育2 h。随后在12 000 r/min下离心10 min，弃去上清液，用5 mL预冷的无菌水重悬菌株，再在相同的条件下离心回收菌株，将其重悬于含有5 mL Triton X-100的Tirs-HCl(0.05 mol/L，pH=7.0)缓冲溶液，最后置于全自动生长曲线分析仪每隔30 min测定其在600 nm处的吸光度，持续8 h[15]。
1.3.9.2 对胞外多糖的影响
分别吸取葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于试管中，将各试管用蒸馏水补充至1.0 mL，随后往各试管中加入0.5 mL体积分数为5%的苯酚溶液，再逐滴加入2.5 mL体积分数为98%的浓硫酸，混匀后置于90 ℃中水浴反应30 min，待溶液温度冷却至室温后，测定其在490 nm处的吸光度，最后绘制葡萄糖的标准曲线。根据苯酚-硫酸法[14]测定胞外多糖的相对含量。取1 mL 1.3.8提取的胞外聚合物混合液于试管中，往其中加入0.5 mL 5%的苯酚溶液，再逐滴加入2.5 mL 98%的浓硫酸，混匀后置于90 ℃中水浴反应30 min，测定其在490 nm处的吸光度。
1.3.9.3 对胞外蛋白的影响
分别吸取蛋白质标准溶液(0.5 mg/mL)0、1、2、4、8、12、16、20 μL于96孔板中，将各孔用无菌水补充至20 μL，再往各孔加入250 μL的G-250染料，静置5 min后，测定其在570 nm处的吸光度，最后绘制蛋白质的标准曲线。根据Bradford蛋白质测试盒测定胞外蛋白的相对含量。取20 μL 1.3.8制备的胞外聚合物混合液于试管中，往其中加入250 μL的G-250染料，静置5 min后，测定其在570 nm处的吸光度。
1.3.9.4 激光扫描荧光显微镜(laser scaning conforcal microscope, LSCM)观察生物被膜生长情况
在玻底培养皿培养的生物被膜经过PDI处理后，在恒温培养箱孵育24 h后弃去混合液，用无菌水洗涤培养皿，重复3次，再往培养皿中注入200 μL SYTO9/PI混合染料，摇匀后置于黑暗处静置15 min，随后弃去混合液，用同样的方法清洗培养皿，干燥后置于LSCM下随机挑选视野进行拍照。
1.3.10 数据处理
所有实验均重复3次，采用IBM SPSS 21.0对实验数据进行统计分析，在95%置信区间下，采用ANOVA分析各组之间的显著差异，应用Duncan’s法确定各组平均值之间的显著差异，P<0.05表示差异显著。采用Origin lab Origin 2018作图。
2 结果与分析
2.1 共晶的制备及筛选
如图1-a所示，CUR和CDC、CDX、CDY在425 nm处具有相同的最大吸收波长。在体积分数为0.5%的乙醇中CUR的溶解度为0.001 3 g/L，而同等条件下，CDX的溶解度为0.010 7 g/L，CDY的溶解度为0.000 8 g/L，而CDC具有最高的溶解度为0.010 9 g/L，是CUR的8.58倍(图1-b)，故挑选CDC及CDX继续研究。
不同方法制备的姜黄素共晶的粉末X射线衍射如图1-c所示，CUR的特征峰出现在8.80°、12.18°、14.62°、17.13°、21.10°、23.36°、24.65°、25.58°和28.96°，这与陈德等[16]的结果相近，D-Tyr的特征峰出现在13.48°、15.39°、18.00°、20.30°、24.69°、25.77°、27.20°、28.76°、36.46°和42.62°，CDC的特征峰出现在7.10°、14.03°、15.11°、17.97°、19.70°和25.4°，CDX的特征峰出现在8.83°、15.24°、17.24°、17.91°、24.80°、25.75°，与原始成分相比，姜黄素共晶的特征峰均发生改变，且呈现出不同于各组分的新晶体结构；晶体衍射峰强度变弱，这可能是在制备过程中晶体结构受到破坏，导致形成了非晶体成分。
热重分析检测CDC在25～290 ℃的热稳定性，CUR和CDX、CDC具有相似的分解温度，整个升温过程中CUR、CDX和CDC的质量损失分别为5.05%、23.13%、7.95%(图1-d)，这说明CDC具有比CDX更好的热稳定性。当温度上升至70 ℃时，CDC出现失重，失重率达3.1%，这是共晶制备时残留乙醇的特征，温度上升至200 ℃时，CDC出现第二次失重，CDC发生分解。
上述结果表明，本实验成功制备了3种异于CUR和D-Tyr的姜黄素共晶，CDC展现出较高的溶解度，且具有比CDX更好的热稳定性，故继续探究CDC对副溶血性弧菌的作用效果。
a-紫外全波长扫描；b-溶解度；c-粉末X射线衍射；d-热重分析
图1 姜黄素及共晶的表征
Fig.1 Characterization of curcumin and its co-crystals
2.2 CDC介导的PDI对副溶血性弧菌生物被膜的抑制效果
副溶血性弧菌的自动生长曲线如图2-a～图2-c所示，光照20 min后，当CUR和CDC的质量浓度分别大于0.010 g/L和0.005 0 g/L时，菌悬液的OD值保持在0.4以下，菌株出现生长滞后的现象[17](P<0.05)，这说明在PDI过程中，CDC展现出比CUR更低的MIC。D-Tyr作为细菌生物膜信号分子，本身不具备抗菌能力[18]，因此不存在协同抗菌作用，而CDC作为PS的抗菌效果更好可能是晶体结构发生改变，CDC的溶解性得到提升，生物利用度得以提高，进而增强PDI的光效率，后续采用小于MIC的CDC对生物被膜的作用进行进一步研究。
不同浓度的药物在光照20 min后对副溶血性弧菌生物被膜的总生物量的抑制效果影响如图2-d所示。与对照组相比，光照组的生物被膜抑制率均大于对照组，光照处理引起生物被膜总生物量显著的变化(P<0.05)；在光照组中，CDC组的生物被膜抑制率基本高于CUR组，且随着CDC浓度的升高，抑制率也逐渐增加，当CDC质量浓度为0.002 5 g/L(1/2MIC)，光照时间为20 min时，生物被膜抑制率为60.17%，而同等条件下，CUR组的生物被膜抑制率为42.17%；当CDC质量浓度提高到0.005 0 g/L(MIC)，其抑制率达到91.80%，而CUR的抑制率为57.07%(P<0.05)。
DENG等[19]发现0.05 g/L的亚甲基蓝在可见光下光照25 min后，使副溶血性弧菌完全失活。雷欢等[20]通过比较4种防腐剂对2株副溶血性弧菌的作用，发现壳聚糖具有最小的MIC(1.25 mg/mL)，且其对生物被膜形成的抑制效果最显著，在MIC时对2株菌生物被膜的抑制率分别为70.98%、67.90%。LU等[21]研究了肉桂提取物对副溶血性弧菌的抗菌及抗生物膜活性，结果显示MIC为6.25 mg/mL，且MIC抑制率为75.46%。综合上述结果表明，CDC介导的PDI对副溶血性弧菌具有良好的抑制效果，且CDC在天然黄酮化合物CUR的基础上合成，没有传统防腐剂剂量的严格限制，产生作用的浓度更小，效果良好，具有广泛的应用前景。
2.3 CDC介导的PDI对副溶血性弧菌生物被膜的作用机理
通过酶解实验探究副溶血性弧菌生物被膜胞外聚合物的主要成分。在成熟的生物被膜中加入proteinase K、高碘酸钠、DNaseI，分别用于检测胞外蛋白、胞外多糖、胞外DNA(eDNA)。结果显示，高碘酸钠组剩余生物被膜量最少，总生物量减少将近87.99%，Proteinase K组总生物量减少16.50%，DNaseI组剩余生物被膜量最多，总生物量减少7.21%(图3-a)，由此推测副溶血性弧菌生物被膜胞外基质成分主要是多糖，其次是蛋白，eDNA含量最少。
a-CUR介导的PDI下菌株的生长曲线；b-CDC介导的PDI下菌株的生长曲线；c-光照或黑暗下菌株的生长曲线； d-PDI对副溶血性弧菌生物被膜的抑制作用
图2 不同浓度的CUR和CDC介导的PDI对副溶血性弧菌及其生物被膜的作用
Fig.2 Effects of different concentrations of CUR and CDC-mediated PDI on Vibrio parahaemolyticus and its biofilm
eDNA是细菌生物被膜基质的关键组分之一，其在释放到胞外后，吸附在菌体表面并向外延伸，从而促进生物被膜的形成。通过自溶实验检测PDI对副溶血性弧菌破裂的影响，间接证明PDI对eDNA的作用。结果如图3-b所示，实验组和对照组无明显差异(P>0.05)，表明CDC不抑制副溶血性弧菌自溶作用，因此也可以间接证明CDC对eDNA的释放几乎没有作用，这与曹凤娇[15]的结果一致。
胞外蛋白在生物被膜的形成过程中发挥各种作用，如参与对宿主细胞的黏附、与胞外多糖相互作用以形成被膜的三维结构等。如图3-c所示，在黑暗条件下，0.005 0 g/L CDC和CUR作用后，胞外蛋白的含量分别减少20.78%和7.05%，而当经过PDI处理后，随着PS浓度的升高，胞外蛋白的含量在逐渐下降，0.005 0 g/L CDC和CUR作用后胞外蛋白的抑制率分别为89.01%和52.37%，故CDC介导的光动力对副溶血性弧菌胞外蛋白的分泌具有显著抑制作用(P<0.05)。
胞外多糖执行一系列功能，包括促进对生物和非生物表面的黏附，构成和维护生物膜结构，同时在抗菌剂处理时起着保护细胞的作用。如图3-d所示，经过PDI处理的生物被膜胞外多糖含量远低于对照组(无光照)。此外，当CDC质量浓度为0.001 3 g/L(1/4MIC)时，胞外多糖的分泌量降低了72.04%，而同等条件下CUR组的胞外多糖和对照组相比，并未出现下降的趋势。随着PDI中PS浓度的提高，胞外多糖的含量也在降低，0.005 0 g/L(MIC)的CDC在光照20 min后，胞外多糖的分泌量降低了94.07%，CUR在同样条件下，胞外多糖的分泌量降低了61.58%，因此CDC介导的光动力能显著抑制副溶血性弧菌胞外多糖的产生(P<0.05)。副溶血性弧菌生物被膜胞外聚合物的主要成分呈动态变化，胞外多糖和胞外蛋白的变化趋势具有一致性，且胞外多糖和胞外蛋白含量越少，生物被膜的生物量越少，而单纯eDNA含量变化并未发现生物被膜生物量的显著改变，这可能是由于胞外蛋白和胞外多糖共同构成成熟的被膜骨架，而eDNA在其中主要起调控的作用。
激光共聚焦结果如图4所示，未经任何处理的副溶血性弧菌的生物被膜呈现致密紧凑的生物结构，经过CUR介导的PDI处理后，生物被膜呈现稀疏分散的生物结构，经过CDC介导的PDI处理后，生物被膜呈现极其稀疏且不均匀的生物结构。
a-酶解实验；b-胞外DNA；c-胞外蛋白；d-胞外多糖
图3 PDI对副溶血性弧菌生物被膜胞外聚合物的影响
Fig.3 Effect of PDI on the extracellular polymers in biofilm
a-对照组；b-CUR；c-CDC
图4 不同药物介导的PDI下副溶血性弧菌的CLSM图像
Fig.4 CLSM images of Vibrio parahaemolyticus under PDI mediated by different drugs
溶解度和生物利用度呈正相关的关系[22]，这是CDC介导的PDI对副溶血性弧菌生物被膜的抑制效果优于CUR的原因之一。同时，D-氨基酸在细菌稳定期产生并释放到胞外基质，可以改变肽聚糖结构并有效抑制细菌生物膜的形成和(或)裂解已形成的生物膜[23]，而D-Tyr还被证实可减弱生物菌膜对PDI的抗性，增大PDI的光效率[24]。因此，在PDI过程中，CDC可以更加有效的抑制副溶血性弧菌生物被膜胞外多糖和胞外蛋白的分泌，破坏生物被膜的三维结构，延缓生物被膜的成熟，从而对副溶血性弧菌生物被膜展现出更显著的抑制作用。此外，已有研究将姜黄素介导的光动力技术应用于水产食品中的霍利斯格里蒙特菌和溶藻弧菌等[25]，且展示出良好的灭菌效果，因此姜黄素共晶介导的光动力在食源性致病菌的灭活方法上具有一定的借鉴意义。
3 结论
本研究通过3种方法成功制备CUR共晶，其中CDC具有与CUR不同的晶体结构，且其溶解度是CUR的8.58倍。抗菌结果显示，CDC的MIC(0.005 g/L)比CUR(0.01 g/L)更低，0.005 g/L的CDC介导的PDI对生物被膜的抑制率为91.80%，而CUR的抑制率仅为57.07%。生物被膜胞外聚合物表明，CDC介导的PDI可显著减少胞外多糖和胞外蛋白的含量，从而使得生物被膜难以形成三维立体结构，减少生物被膜的生物量。尽管CDC展现出良好的光效率，但其在食品基质中应用的可能性以及对食品感官和理化特性的影响还需要深入研究。
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