幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是国际公认的致病菌，可引起慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等疾病。世界上超过50%的人口感染了这种细菌，并且感染患者的病情严重程度与体内H. pylori的数量密切相关[1]。目前，根除H. pylori感染的治疗方法是由《马斯特里赫特IV/佛罗伦萨共识报告》推荐的三联疗法或含铋四联疗法，10 d治疗根除率超过90%[2-3]。除了抗生素疗法外，还有许多辅助治疗H. pylori感染的饮食疗法。有研究报道印度苦楝树防风草内酯的乙醇提取物可降低与H. pylori感染相关的免疫因子(NF-κB和IL-8)的活性和分泌量，即缓解H. pylori介导的炎症。除此之外，通过细胞或小鼠实验证实了一些植物，如土荆芥、石莲子等的提取物对H. pylori的感染有拮抗作用[4-5]。
此外，乳杆菌的补充疗法也被认为是治疗H. pylori感染的另一有效方法[6]。遗传学上不同的2个细菌(如乳杆菌与致病菌H. pylori)通过菌体表面的特定分子相互连接，结合形成大分子聚集体的过程叫做细菌的共聚集[7]。特异性共聚集作为一种恢复稳态的手段，在疾病治疗中已经被广泛讨论[8-9]。乳杆菌可通过在口腔、阴道、胃肠道内共聚集致病菌，阻止致病性生物膜的形成，从而减缓疾病的发展[10-11]。乳杆菌除可与H. pylori[11]发生共聚集外，还可与大肠杆菌(Escherichia coli)[12]、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)[13]、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)[12]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[14]、无毒李斯特菌(Listeria nontoxic)[13]、白色念珠菌(Candida albicans)[15]和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)[16]等常见病原菌发生不同强度的共聚集(共聚集率在4%～80%)。世界范围内的多项临床研究表明，可共聚集H. pylori的益生菌DSMZ17648(Pylopass/Lonza)具有良好的临床表现，患者在连续补充益生菌14 d后，H. pylori水平(13C呼气值)显著降低[11, 17]。但是关于乳杆菌发生聚集分子机制的解释各不相同，其机理可能是简单的表面静电效应和表面疏水性导致的聚集[13]，也可能是带有表面电荷的乳杆菌与带有相反电荷的凝集素或与菌体本身带有相反电荷的细菌发生共聚集[18]。此外，蛋白类凝集素(包括菌毛、鞭毛、大黏附素、小β-蛋白等[19-20])也可以使细菌发生非吸附性的自动聚集或共聚集。有学者认为共聚集相互作用通常涉及细胞表面相关的凝集素样蛋白黏连素，这种蛋白能够识别并结合伴生物种细胞表面含有辅助多糖的受体[21-22]。
乳杆菌与H. pylori的共聚集与多种因素有关，如细菌的培养方式(需氧度、培养基含糖量等)、pH、温度、表面疏水性、蛋白酶和碳水化合物的干预等[23]。由于胃部的特殊环境需求，温度、pH和稳定性(孵育转速)是筛选益生菌时必须考虑的因素。HOLZ等[11]已经证实喷雾干燥的DSM17648乳杆菌与未处理细菌诱导共聚集体无显著差异。而FKMEKCI等[10]研究了阴道环境中的乳杆菌与大肠杆菌的共聚集，发现pH值、温度、疏水性、好氧或厌氧条件、某些酶和高碘酸钠等因素都可以显著影响菌株间的共聚率。
虽然目前有很多关于某一乳杆菌与致病菌的共聚集的体内和体外研究，但是还没有对不同种乳杆菌与H. pylori的聚集特性的系统性研究，且缺乏差异菌株的比较基因组分析讨论。因此本研究旨在从不同种乳杆菌中筛选出对H. pylori具有共聚集活性的乳杆菌，并探究乳杆菌表面疏水性、时间、温度、pH、超声波处理和孵育转速等因素对共聚集能力的影响。同时运用比较基因组分析，预测乳杆菌与H. pylori聚集作用的结合位点(表面蛋白质或多糖)及相关基因。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
MRS培养基、BHI完全培养基、牛肉膏、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、甘油、磷酸盐缓冲溶液、二甲苯，国药化学试剂有限公司；胃蛋白酶(10 000 U)、高碘酸钠，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA SE)荧光染色剂，碧云天生物技术；胎牛血清，南京森贝伽生物科技有限公司。
SU8100冷场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；FV3000激光共聚焦显微镜， 日本Olympus公司; BSC-1000Ⅱ A2生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；GRP-9080恒温恒湿培养箱，上海森信公司；i160三气培养箱、MULTISCAN GO全波长多功能自动酶标仪，美国Thermo Fisher公司。
1.2 菌株的培养
H. pylori SS1菌株受赠于南方医科大学陈烨教授团队。将H. pylori SS1接种于含5%(体积分数)胎牛血清的BHI完全培养基中，在三气培养箱中培养3～4 d。
实验所需的乳杆菌菌株均取自江南大学(中国无锡)食品学院生物技术中心菌种保藏库(乳杆菌均从新疆、四川、西藏等省份的健康人肠道或泡菜样品中分离得到)。将乳杆菌接种于MRS培养基，在37 ℃恒温培养箱中培养18 h。
1.3 共聚集菌株的筛选
根据EKMEKCI等[10]的方法并稍加改良。取培养超过3代的乳杆菌离心，用PBS(pH=7.42±0.02)洗涤培养物2次，并重悬于无菌的PBS中；配制人工胃液(3 g/L胃蛋白酶，5 g/L NaCl)，并调节pH=4.00±0.02。用同样的方法收集培养3代后的H. pylori SS1，进行洗涤、重悬于人工胃液中。使用全自动酶标仪调节乳杆菌和H. pylori的菌悬液OD600 nm=0.50±0.02，即菌液浓度标准化(107～108 CFU/mL)。
将等体积的乳杆菌悬液(2 mL)与H. pylori悬液(2 mL)混合，用旋涡振荡器混合至少10 s。在室温条件下孵育2 h后，用分光光度计测定此时混合菌液上清液的吸光度，共聚率按公式(1)计算：
共聚率
(1)
式中：ODL，乳杆菌在600 nm处的吸光度；ODHP，H. pylori在600 nm处的吸光度；ODmix，混合菌液在600 nm处的吸光度。
1.4 扫描电子显微镜分析
据1.3的方法制备乳杆菌和H. pylori SS1菌悬液，并在相应的缓冲液(PBS或人工胃液)中重悬。乳杆菌和H. pylori SS1以等体积比混合，诱导产生共聚体。在室温孵育2 h后，离心得到共聚体，用4%的戊二醛固定液重悬，置于4 ℃冰箱中固定过夜。次日固定好的共聚体使用不同体积分数的乙醇溶液(70%、80%、90%、95%、100%、100%)进行梯度脱水，每次脱水10 min。室温晾干，充分挥发有机试剂后，用保鲜膜包裹放置样品的平皿，戳孔后进行真空冷冻干燥处理。最后用钯溅射制备样品，采用冷场发射扫描电子显微镜对样品扫描观察[24]，放大倍数为5 000×，12 000×。
1.5 激光共聚焦显微镜分析
按1.3的方法制备H. pylori SS1的菌悬液，使用荧光染料CFDA SE染色，37 ℃孵育15 min。然后将菌体重新悬浮在BHI完全培养基中，避光处理30 min，以去除多余的染料。根据BASCHONG等[25]的方法，将预染后的H. pylori SS1和乳杆菌混合，按照上述方法进行共聚集试验。孵育后收集混合菌液，滴1滴在玻片上，用激光共聚焦显微镜进行观察，操作条件为Ex=494 nm, Em=521 nm。
1.6 乳杆菌的表面疏水性
按EKMEKCI等[10]的方法进行测定。通过离心收集3代后的乳杆菌培养物，冲洗2次后，将其重新悬浮在OD600=0.6±0.02的PBS中。然后，将用于测试的碳氢化合物(二甲苯，1 mL)添加到乳杆菌悬液中(3 mL)。用旋涡混合器混合90 s，悬浮液静置至少30 min，使两相完全分离。静置结束后，测定水相的OD600，按公式(2)计算各菌株的表面疏水性：
表面疏水性
(2)
式中：ODbefore，混合前乳杆菌的吸光度；ODafter，混合后菌液水相的吸光度。
1.7 乳杆菌的其他处理
按1.3的方法制备乳杆菌和H. pylori SS1菌悬液，并重悬于适当的缓冲液中。测试共培养不同时间(4～180 min)下乳杆菌与H. pylori共聚率的变化。将混合后的菌株混合液暴露在不同的温度(4、37、80 ℃)和不同的pH环境中(pH=3～9)，计算共聚率的变化。另外，测试乳杆菌与H. pylori SS1混合液在不同转速(0、150、250 r/min)下孵育2 h后的共聚集能力。
按1.3的方法制备乳杆菌和H. pylori SS1菌悬液，并重悬于适当的缓冲液中。使用细胞超声波破碎仪对乳杆菌细胞超声波处理12 min，比较超声与未超声组的共聚率。
1.8 比较基因组分析
使用Illumina HiSeq 2000对共聚集表现不同的同种乳杆菌进行测序，得到全基因组草图，测序部分由上海美吉生物医药科技有限公司完成。将拼接好的乳杆菌的基因组序列进行基因功能注释，通过BLAST方法(版本：BLAST+2.9.0；主要参数设置：e-value<10-5，identity>80%)与蛋白质直系同源簇数据库(Clusters of orthologous groups of proteins，COGs，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)进行比对，找出同源相近的基因对编码蛋白进行功能分配[26]。
1.9 数据统计分析
所有实验重复3次结果以平均值±标准差表示。使用Dunnett检验和对照组之间的差异进行评估，单因素方差分析认为P<0.05即为差异显著。使用SPSS 13.0软件进行统计计算。
2 结果与分析
2.1 乳杆菌和H. pylori的共聚集
关于乳杆菌的聚集特性有很多报道，包括其自聚集和与病原菌的协同共聚集[27]。EKMEKCI等[10]研究了来自阴道的19种乳杆菌与大肠杆菌的共聚集，发现它们的共聚集率在15%～53%。本研究选取江南大学食品生物技术中心菌种保藏库的57株乳杆菌进行H. pylori体外共聚集试验，如图1所示，除少数菌株不存在共聚集现象，乳杆菌与H. pylori的共聚率主要在10%～60%。HOLZ等[11]将罗伊氏乳杆菌DSM17648与H. pylori共聚集，可观察到白色的絮凝体，与本实验结果一致。此外，本研究中共聚集现象无种间差异，有株间显著差异。COLLADO等[28]检测的益生菌和病原体的聚集能力也呈现出株间特异性。在测试的乳杆菌菌株中，北酸乳杆菌(Lactobacillus kitasatonis)Guxi82GMM、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)984、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GL14、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)JSSZ21、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)S5等表现出显著的高共聚集率(共聚率>40%)。从中选出3株具有共聚集效果代表性的菌株(北酸乳杆菌Guxi82GMM、罗伊氏乳杆菌984和鼠李糖乳杆菌FS75)进行影响因素分析。
图1 乳杆菌菌株的共聚集能力
Fig.1 The co-aggregation ability of Lactobacillus spp.strains
注：数据采用单因素方差分析，与对照组Pylopass进行比较*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1(下同)
如图2所示，北酸乳杆菌Guxi82GMM和H. pylori的共聚集发生较为迅速，可以在10 min内达到较高的共聚率，这与HOLZ等[11]提出的观点一致，专利菌株DSM17648(Pylopass)与H. pylori混合后在数秒内发生共聚集。TONOIKE等[29]称乳杆菌和酵母的聚集特性与2种细菌细胞间的静电作用力有关，这可能也是导致乳杆菌和H. pylori发生共聚集的速度较快的原因之一。
图2 孵育时间对共聚集速率的影响
Fig.2 Effect of incubation time on the co-aggregation rate
2.2 电子显微镜表征共聚集
使用扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜进一步证实共聚集的存在。首先用CFDA SE对共聚集体中的H. pylori进行荧光染色，以确认2种细菌(H. pylori和乳杆菌)都存在于共聚体内。图3-b的明场视图可以同时观察到北酸乳杆菌Guxi82GMM和H. pylori SS1，并且二者互相聚集。
a-暗场；b-明场；c-叠加场
图3 激光共聚焦显微镜分析
Fig.3 Confocal laser scanning microscopy analysis
注：带有CFDA SE的H. pylori呈绿色，图中的箭头指示为聚集体
随后收集共聚集形成的聚集体，进行真空冷冻干燥处理，取冻干后的样品置于冷场发射扫描电子显微镜下观察。由于北酸乳杆菌是近几年从嗜酸乳杆菌中发现并分离出来的乳杆菌新种，所以在此补充了嗜酸乳杆菌S5的扫描电镜图与之作对比。图4-a、图4-b显示了单独的H. pylori和乳杆菌的形态，H. pylori SS1呈弯曲的杆状，嗜酸乳杆菌S5表现为细长的杆状，二者的区别度较高。图4-d～图4-f显示的是北酸乳杆菌Guxi82GMM和嗜酸乳杆菌S5分别与H. pylori SS1形成的聚集体的结合形态。图4-e、4-f中白色的箭头处所示，多个H. pylori菌体与1个北酸乳杆菌Guxi82GMM或嗜酸乳杆菌S5结合，并且乳杆菌之间存在自聚集的现象，从而2种菌相互交联形成更大的共聚集物。电子显微镜下未发现菌株表面特殊的结合位点，这与HOLZ等[11]报道的结果一致。
a-H. pylori SS1；b-L.acidophilus S5；c～d-H. pylori SS1
和L.kitasatonis Guxi82GMM的聚集体；e～f-H. pylori SS1和L.acidophilus S5的聚集体
图4 扫描电子显微镜分析
Fig.4 Scanning electron microscopy analysis
2.3 共聚集的影响因素
乳杆菌与H. pylori SS1的共聚集作用与乳杆菌菌体的表面成分有关，温度和pH值是益生菌生长的2个重要生理指标。乳杆菌本身对温度敏感，4、37、85 ℃分别代表它的休眠、最佳生长和失活状态。实验结果表明共聚集可发生在任何温度，37 ℃下的共聚率最高的菌株在所有温度下均表现出最好的共聚特性，且80 ℃处理2 h后灭活的乳杆菌仍具有较强的共聚集能力(图5-a)。此前已有报道称嗜酸乳杆菌S1和大肠杆菌ATCC 11229在不同的pH值和温度下均可以有效地共聚集[10]。为了确定环境pH对共聚集的影响，将乳杆菌在不同pH下进行预处理，检测细菌共聚集的变化(图5-b)。空腹时胃部是一种高酸性的环境(pH≤2.0)，在进食后约2 h胃液被稀释，pH值将升至3.0～5.0。在本研究中在很宽的pH范围内(pH=3.0～9.0)均可以观察到共聚集活性，并且随着pH的降低，共聚率更高，这或许与乳杆菌表面蛋白的变性有关。
人体的消化系统常伴有由胃肠道蠕动和身体运动引起的剪切力。只有当益生菌能够克服剪切力的作用和病原菌发生共聚集时，胃内的H. pylori才能被顺利地排出体外。孵育转速可以用来反映剪切力的大小，如图5-c所示，在0～150 r/min的孵育转速下，乳杆菌与H. pylori的共聚集作用无显著差异。当速度达到250 r/min时，共聚率略有下降，但仍保持在较高水平。鼠李糖乳杆菌FS75的共聚效果差，共聚率始终低于20%。对乳杆菌进行超声波处理以去除其表面结构(图5-d)，超声波处理后的罗伊氏乳杆菌984共聚集率略低于未进行超声波处理的细胞，但北酸乳杆菌Guxi82GMM和鼠李糖乳杆菌FS75的无显著变化。
黏附是一个复杂的过程，包括疏水性和配体-受体机制，细胞表面特性往往在细菌黏附中起重要作用。细菌共聚集也是细胞黏附的一种，所以它具有与黏附相同的性质。在一些乳杆菌菌株中，已经观察到黏附能力和疏水性之间存在相关性，这是由微生物对烃类的黏附决定的[30]。乳杆菌与二甲苯混合测定表面疏水性的结果如图5-e所示，乳杆菌的表面疏水性在20%～90%。其中表现出较高共聚集活性的罗伊氏乳杆菌984和北酸乳杆菌Guxi82GMM，同时也表现出较高的表面疏水性，反之，效果不好的鼠李糖乳杆菌FS75和保加利亚乳杆菌BJLY1的表面疏水率显著低于前者。这与前人的报道结果一致[10]，微生物的细胞表面化学研究表明，细胞表面蛋白质上乙二醇基团的存在导致了更高的疏水性，而亲水表面则与多糖的存在有关。这个结果提示我们乳杆菌的聚集特性与菌体表面的蛋白组成相关。
a-温度；b-pH；c-孵育转速；d-超声处理；e-乳杆菌的表面疏水性
图5 乳杆菌共聚集的影响因素
Fig.5 Influencing factors on the co-aggregation of Lactobacillus
2.4 比较基因组分析
SCHACHTSIEK等[16]通过研究棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)与大肠杆菌和空肠弯曲菌的聚集，发现了乳杆菌的表面存在1个分子质量为19.9 kDa的共聚集启动子。此外，S层蛋白和胞外多糖也被证明与聚集相关[31]。由此我们推测乳杆菌与H. pylori之间的共聚集机制也可能与细菌表面蛋白质和多糖的结构有关。另一方面，通过比较基因组分析作用机制已经被证实是一种可行的方法，如LIU等[32]通过差异基因分析解释了乳杆菌对肠易激综合征的缓解作用。将初筛得到的部分乳杆菌进行全基因组草图测序，选取同种乳杆菌中不同共聚集表现的菌株进行比较基因组的分析。基于筛菌实验及影响因素的分析，3株具有代表性的乳杆菌中，罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的遗传背景、生理特性等方面已经研究得较为透彻，是常见的益生菌种类，而关于北酸乳杆菌的研究较少，且缺乏对照菌株。因此本研究选取罗伊氏乳杆菌(984和1381)和鼠李糖乳杆菌(JSSZ21和FS75)中具有共聚集表现差异的菌株进行比较基因组学分析(基因草图原始数据见电子版增强出版附件http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031353)。同源基因分析显示，罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的核心基因分别有1 510和2 399个(图6-a)。进一步进行功能基因注释，在共聚集表现较好的罗伊氏乳杆菌984和鼠李糖乳杆菌JSSZ21的基因组中，与氨基酸转运和代谢相关的功能基因数量显著高于共聚集表现较差的同种乳杆菌(图6-b)。
如图6-c，COG0531和COG0765分别是罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中差异表达量最显著的蛋白，共聚集能力好的菌株中COG0531和COG0765基因的数量多于共聚集能力差的菌株(拷贝数差异大于5)。COG0531与氨基酸合成代谢有关，NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)将其注释为镁转运体CorA家族蛋白的成员。有报道称CorA是细菌内膜的主要镁转运体，它在大肠杆菌中的过表达可以合成大部分蛋白质，形成包涵体。包涵体被包裹在原核细胞外源基因表达时形成的膜中，并且由致密的不溶性蛋白颗粒组成，不表现出生物活性[33]。因此可以推测，罗伊氏乳杆菌984中存在的大量COG0531相关基因，可促进CorA的表达，并与H. pylori形成类似包涵体的蛋白结构，以促进聚集的发生。
a-韦恩图和进化树；b-COG功能注释；c-COG热图
图6 乳杆菌的比较基因组分析
Fig.6 Comparative analysis of the genomes of Lactobacillus spp. strains
结合以上乳杆菌共聚集H. pylori的体外影响因素的探索，差异菌株的比较基因组研究为乳杆菌与H. pylori发生共聚集提供了合理的猜想，后续可以从乳杆菌表面的蛋白方面着手深入研究共聚集的分子机制。同时比较基因组的分析也为筛选具有潜在共聚集能力的益生菌奠定了基础。
3 结论
综上所述，本研究从乳杆菌属中筛选得到5株与H. pylori具有较强共聚集能力的乳杆菌，通过电子显微镜进一步观察共聚体结构发现，菌株间的共聚集不存在特殊的结合位点。影响因素实验表明乳杆菌与H. pylori的共聚集作用可以快速、稳定地发生在胃酸环境中。不同于先前报道的拮抗H. pylori的益生菌，本研究中灭活状态的乳杆菌依旧可以结合H. pylori，发挥益生功能。最后，本研究通过表面疏水性的测定和比较基因组找到了乳杆菌参与聚集作用的潜在功能基因，为筛选具有降低H. pylori载量的灭活益生菌提供了新的研究方向。但是对于乳杆菌共聚集H. pylori的物质基础研究并不深入，后续可以利用乳杆菌的组分剥离、表面蛋白去除/提取和基因敲除等技术，进一步探究共聚集作用的物质基础与功能基因，以期更加直观地验证本研究的结果。
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