我国核桃产量高居世界第一。核桃仁营养丰富，具有益智补脑功效。以干物质含量计，核桃仁中，油脂占55%～70%，蛋白质占18%～24%，且 18 种氨基酸齐全，8 种必需氨基酸的含量合理[1]。以核桃仁为原料研制植物酸奶具有较好的市场前景，且乳酸菌发酵核桃乳，既能保留核桃的营养价值，又能产生乳酸及其他乳酸菌代谢产物如功能活性物质γ-氨基丁酸及共轭亚油酸[2-4]。T/WSJD 12—2020《植物蛋白饮料 植物酸奶》规定，使用单一植物原料包括巴旦木、杏仁和核桃等提供蛋白质的植物酸奶，蛋白质含量要求不低于1%，糖含量不高于10%。碳氮源对乳酸菌生长繁殖以及发酵产酸十分重要。但是目前以核桃仁为原料，关于糖类和蛋白质浓度对核桃乳发酵特性的影响研究较少。有研究报道，核桃乳中的糖类物质较少，只含有少量的蔗糖、棉子糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖，无法满足乳酸菌的正常发酵，因此应外加碳源促进发酵[5]。夏君霞等[6]优化得到益生菌发酵纯核桃乳的工艺中碳源添加比例为m(葡萄糖)∶m(蔗糖)=5∶2。
核桃蛋白质由谷蛋白(72.06%)、球蛋白(15.67%)、清蛋白(7.54%)和醇溶谷蛋白(4.73%)构成[7]。可见核桃蛋白主要是谷蛋白，因此溶解性较差[8]。由于蛋白质的性质差异，乳酸菌在核桃乳中的适应力弱，产酸性能有所下降[9]。目前很多研究报道都是通过外加氮源(牛奶、大豆)来促进核桃乳发酵。ILYASO
LU等[10]用核桃浆(10%～50%)和脱脂牛奶(50%～90%)制备富含多不饱和脂肪酸的酸奶。贾建会等[11]以大豆和核桃为主要原料，研究乳酸发酵制作核桃酸豆乳的工艺。本文以核桃仁为原料，使用直投式酸奶发酵剂制备发酵核桃乳，根据发酵特性和感官评价筛选出合适的糖类和蛋白质浓度，进一步提高发酵核桃乳的酸度，为工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
核桃仁(辽核1号)，河北涉县缔鑫食品加工厂；直投式酸奶发酵剂(德氏乳杆菌保加利亚亚种，嗜热链球菌)，丹尼斯克公司；蔗糖，市售；葡萄糖，浙江一诺生物科技公司；大豆，市售；新西兰恒天然脱脂乳粉，恒天然商贸(上海)有限公司；MRS固体培养基，杭州百思生物技术有限公司。
1.1.2 仪器与设备
YJ-HS-1超净工作台，无锡一净设备有限公司；AB204分析天平、PHS-3TC数显pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪、DSX-18L-1手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SC202-2电热恒温培养箱，江苏南通实验电器厂；BLST4090B-073搅拌器，东莞汇勋电器有限公司；JML-65立式胶体磨，温州强忠机械科技有限公司；FA25高速剪切机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；AH210高压均质机，ATS工业有限公司；HH-S数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗仪器厂；TA-XT-Plus质构仪，英国SMS公司。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵核桃乳的制备工艺流程
核桃仁→去皮→打浆→磨浆→剪切→搅拌→调配→均质2次(30～40 MPa)→灭菌(95 ℃，10 min)→冷却到室温→接种直投式酸奶发酵剂→发酵(42 ℃)→冷藏后熟(4 ℃)
1.2.2 发酵复原乳制备工艺流程
脱脂奶粉→60 ℃去离子水溶解(控制蛋白质质量分数1.5%)→灭菌(95 ℃，10 min)→冷却至室温→接种直投式酸奶发酵剂→发酵(42 ℃)→冷藏后熟(4 ℃)
1.2.3 发酵豆乳工艺流程
大豆→浸泡→磨浆(控制蛋白质质量分数1.5%)→灭菌(95 ℃，10 min)→冷却至室温→接种直投式酸奶发酵剂→发酵(42 ℃)→冷藏后熟(4 ℃)
1.2.4 培养基的配制
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉粉5、酵母粉4、葡萄糖20、K2HPO4 2、柠檬酸三铵2、乙酸钠5、MgSO4 0.2、MnSO4 0.05、吐温-80 1 mL，琼脂15，调节pH至6.2。
1.3 理化指标的测定
1.3.1 pH值的测定
采用PHS-3TC型数显pH计测定。
1.3.2 酸度的测定
根据GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品中酸度的测定》中第二法pH计法测定。
1.3.3 糖类成分及含量的测定
根据GB 5009.8—2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》中第一法高效液相色谱法(HPLC)测定。HPLC分析条件：色谱柱：Hypersil APS2(4.6 mm id×250 mm)；流动相V(乙腈)∶V(水)=70∶30；检测器：示差折光检测器；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样体积10 μL。
1.3.4 乳酸菌活菌数的测定
根据GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物检验 乳酸菌检验》测定乳酸菌活菌数。
1.3.5 缓冲能力的测定
参考SALAÜN等[12]的方法。取30 mL样品，室温下滴加盐酸标准溶液，边加边搅拌，从样品初始pH滴定至pH为3.9，每隔0.2pH值记录盐酸溶液消耗的体积以及样品pH值，根据公式(1)计算样品的缓冲能力。
(1)
式中：dB/dpH，样品的缓冲能力；V1，样品的体积，mL；V2，盐酸标准溶液消耗的体积，mL；c(HCl)，盐酸标准溶液的摩尔浓度，mol/L；ΔpH，盐酸标准溶液滴定前后样品pH值的变化量。
1.3.6 三氯乙酸-可溶性氮的测定
参考CHEN等[13]的方法并作适当修改。称取适量待测样品加入相同体积30%(质量分数)的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液，使体系中TCA的终质量分数为15%，混匀，室温静置1 h后离心(7 690×g，10 min，4 ℃)，再用滤纸过滤，所得滤液用凯氏定氮法测定，为滤液可溶性氮含量与样品总氮含量的比值。
1.3.7 质构特性的测定
参考ZHOU等[14]的方法并做适当修改。采用质构仪对发酵核桃乳进行测定，采用圆柱形探头P25；测试前探头下降速度1.0 mm/s；测试速度1.0 mm/s；测试后探头回程速度1.0 mm/s；应变程度30%。
1.3.8 感官评定
参考RHB 104—2020《发酵乳感官评鉴细则》。选取8名经过培训的同学组成感官评定小组，分别对发酵核桃乳的色泽、滋味、气味和组织状态打分。在计算过程中先将各组得分最大值和最小值去除后计算各个指标的平均值，具体指标分值如表1所示。
1.4 数据分析
所有样品均重复测定3次，实验数据以平均值±标准差表示，借助Origin软件得到pH和酸度随发酵时间变化的趋势图。采用SPSS 23.0对数据进行显著性分析，P<0.05认为差异显著。
表1 发酵核桃乳感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented walnut milk
指标(分值)标准分值色泽(20)色泽均匀,乳白色,有光泽16～20色泽均匀,灰白色,有光泽11～15色泽不均匀,灰色,无光泽6～10色泽不均匀,其他异常颜色0～5滋味(20)酸甜比适中,不苦涩16～20略酸或略甜,有点苦涩11～15过酸或过甜,苦涩味较重6～10滋味异常0～5气味(20)核桃发酵香气宜人,无异味16～20核桃发酵香味平淡,略带其他气味11～15核桃发酵香气差,其他气味较重6～10无核桃自然发酵香气或有不愉悦的气味0～5组织状态(40)组织细腻、均匀,顺滑、无颗粒感,黏稠度良好,无乳清析出31～40组织较为细腻,有细小颗粒,黏稠度一般,轻微乳清析出21～30组织粗糙,有明显颗粒感和乳清析出11～20组织粗糙,颗粒感很重,乳清析出严重0～10
2 结果与分析
2.1 糖类对核桃乳发酵的影响
2.1.1 核桃乳自身糖类对发酵特性的影响
图1是在不外加碳源条件下，复原乳、豆乳和核桃乳(蛋白质质量分数均为1.5%)在发酵过程中pH和酸度的变化。
a-pH;b-酸度
图1 不外加碳源条件下复原乳、豆乳和核桃乳发酵过程中pH和酸度的变化
Fig.1 Changes of pH and acidity during fermentation of reconstituted milk, soybean milk and walnut milk without additional carbon source
由图1-a 可知，在发酵6 h时，复原乳和豆乳的pH趋于一致，呈缓慢下降趋势，核桃乳pH在发酵6～10 h无明显变化。由图1-b可知，发酵10 h，复原乳酸度可达41 °T，豆乳是27 °T，核桃乳是13 °T，3者间均有显著性差异(P<0.05)。复原乳和豆乳在前2 h发酵速率趋于一致，在2～10 h发酵速率为复原乳>豆乳>核桃乳，且核桃乳在发酵6 h后酸度不再增加，可见乳酸菌依靠核桃乳自身糖类难以达到发酵终点(pH≤4.5，酸度≥30.0 °T)，所以需要外加碳源来促进发酵。
表2为复原乳、豆乳和核桃乳糖类组成及含量。各组灭菌乳蛋白质浓度均为1.5%，使用HPLC法对糖类组成成分和含量进行测定。复原乳含有乳糖(2.527 g/100 g)；豆乳糖类种类较丰富，包括葡萄糖、蔗糖、棉籽糖和水苏糖；核桃乳含有葡萄糖和蔗糖。乳糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖和水苏糖都是可被乳酸菌发酵降解的糖，经发酵后主要代谢产物为乳酸[15-16]。复原乳、豆乳和核桃乳可发酵糖类总量分别为2.527、0.279和0.099 g/100 g，有显著性差异(P<0.05)。
表2 复原乳、豆乳和核桃乳糖类组成及含量
Table 2 Composition and content of sugars in reconstituted milk, soybean milk and walnut milk
糖类组成糖含量/[g·(100 g)-1]复原乳豆乳核桃乳葡萄糖-0.002±0.000a0.002±0.000a蔗糖-0.168±0.009a0.097±0.006b乳糖2.527±0.139--棉籽糖-0.007±0.000-水苏糖-0.102±0.009-
注：-表示未检测到；不同字母表示同一行数据有显著差异(P<0.05)
2.1.2 外加碳源对核桃乳发酵特性的影响
图2为外加葡萄糖(1.0%～5.0%，质量分数)核桃乳发酵过程中pH和酸度的变化。由图2-a可知，添加1.0%葡萄糖，发酵过程中pH下降最慢；添加(2.0%～5.0%)的葡萄糖，发酵过程中pH变化曲线几乎重合。由图2-b可知，添加葡萄糖(3.0%～5.0%)发酵24 h后，酸度在25 °T左右，其中添加3.0%葡萄糖的发酵核桃乳酸度最高；并且添加3.0%～5.0%葡萄糖后的酸度同添加1.0%～2.0%的葡萄糖相比存在显著差异(P<0.05)。
a-pH;b-酸度
图2 外加葡萄糖核桃乳发酵过程中pH和酸度的变化
Fig.2 Changes of pH and acidity during walnut milk fermentation with glucose
图3为外加蔗糖(1.0%～9.0%，质量分数)核桃乳发酵过程中pH和酸度的变化。由图3-a可知，发酵0～4 h，各组pH变化曲线几乎重合，而后曲线出现较大变化；发酵24 h后，添加1.0%蔗糖和3.0%的核桃乳pH值无显著差异(P>0.05)，而蔗糖添加量为5.0%、7.0%和9.0%时，pH值存在显著差异(P<0.05)。
a-pH;b-酸度
图3 外加蔗糖核桃乳发酵过程中pH和酸度的变化
Fig.3 Changes of pH and acidity during walnut milk fermentation with sucrose
由图3-b可知，随着蔗糖添加量的增加，酸度也随之增加，发酵24 h后，添加1.0%和3.0%蔗糖，酸度无显著差异(P>0.05)，而添加3.0%、5.0%、7.0%和9.0%蔗糖酸度均存在显著差异(P<0.05)，而且添加7.0%和9.0%蔗糖的发酵核桃乳的酸度均超过30 °T，达到发酵终点。所以对于核桃乳体系，添加蔗糖更有利于乳酸菌产酸。
2.1.3 外加蔗糖对发酵核桃乳感官特性和活菌数的影响
图4为外加蔗糖(1.0%～9.0%，质量分数)后制备的发酵核桃乳的感官评价结果，由色泽、滋味、气味和组织状态4部分组成。感官特性可直观反映发酵核桃乳的品质。从色泽看，添加5.0%、7.0%蔗糖的发酵核桃乳的得分显著高于1.0%、3.0%和9.0%添加量组；从滋味看，添加7.0%蔗糖制备的发酵核桃乳的得分最高，添加7.0%和9.0%蔗糖组的得分显著高于1.0%、3.0%和5.0%蔗糖添加组，可见较高的蔗糖添加量使得发酵核桃乳滋味更佳。从气味和组织状态看，7.0%蔗糖添加量组的得分最高，且与5.0%和9.0%蔗糖添加量组的得分无显著性差异(P>0.05)，但显著高于1.0%和3.0%蔗糖添加组的得分。这说明不同的蔗糖添加量对发酵核桃乳的感官特性有较大影响，3%及以下蔗糖添加量，发酵核桃乳各项指标评分都偏低，蔗糖添加量(5.0%～9.0%)主要影响发酵核桃乳的滋味，对气味和组织状态影响不大。综合考虑，添加7.0%蔗糖制备的发酵核桃乳感官评价最佳。
图4 外加蔗糖发酵核桃乳的感官评价
Fig.4 Sensory evaluation of fermented walnut milk with sucrose
表3为不同蔗糖添加量(1.0%～9.0%，质量分数)的核桃乳发酵24 h并冷藏12 h后的活菌数，结果表明随着蔗糖添加量的增加，各组的活菌数也随之增加且均大于106 CFU/g。
表3 外加蔗糖发酵核桃乳的活菌数
Table 3 The viable counts of fermented walnut milk with sucrose
蔗糖添加量/%1.03.05.07.09.0活菌数/(CFU·g-1)5.6×1066.2×1066.3×1067.5×1069.0×106
2.2 蛋白质浓度对核桃乳发酵的影响
2.2.1 蛋白质浓度对核桃乳发酵特性的影响
通过控制磨浆时核桃仁与水的比例，调节核桃乳的蛋白质质量分数为1.0%～3.0%。图5为不同蛋白质浓度的核桃乳(添加7.0%蔗糖)发酵过程中pH和酸度的变化。核桃乳在发酵过程中pH明显下降，但不同蛋白质浓度(1.0%～3.0%)的pH差别不大，曲线几乎重合(图5-a)，但酸度随蛋白质浓度的提高而明显增大(图5-b)。当核桃乳发酵至pH为4.5时，酸度与其蛋白质浓度呈线性正相关(R2>0.995)，因此蛋白质浓度对提高发酵核桃乳的酸度至关重要。
a-pH;b-酸度
图5 不同蛋白质浓度的核桃乳发酵过程中pH和酸度的变化
Fig.5 Changes of pH and acidity during walnut milk fermentation with different protein concentrations
牛奶中的游离氨基酸和肽是乳酸菌生长的主要氮源[17]。对于牛奶酸奶发酵中，嗜热链球菌产生的甲酸、丙酮酸、叶酸等可为保加利亚乳杆菌所利用，同时该菌在发酵中水解乳蛋白产生的游离氨基酸和肽可为嗜热链球菌所利用[18-20]，因此核桃乳体系中游离氨基酸和小肽能促进乳酸菌产酸。TCA-可溶性氮含量用来表征体系中游离氨基酸和小肽的相对含量。表4所示为不同蛋白质质量分数(1.0%～3.0%)的核桃乳的TCA-可溶性氮含量及对应发酵核桃乳中的乳酸菌活菌数。结果表明，不同蛋白质浓度下的TCA-可溶性氮含量无显著差异(P>0.05)；但在相同体积的核桃乳体系中，蛋白质浓度越高，游离氨基酸和小肽含量越高，且两者呈线性正相关(R2>0.997)。同时结合图5-b的数据可见，游离氨基酸和小肽含量越高，对应的发酵核桃乳的酸度也越高。随着蛋白质浓度的提高，发酵核桃乳中的活菌数也随之增加，其中蛋白质质量分数为2.0%～3.0%的发酵核桃乳的活菌数均达到107 CFU/g。
表4 不同蛋白质浓度核桃乳的TCA-可溶性氮含量及其发酵核桃乳的活菌数
Table 4 TCA-soluble nitrogen of walnut milk and viable counts of fermented walnut milk with different protein concentrations
指标蛋白质质量分数/%1.01.52.02.53.0TCA-可溶性氮/%2.48±0.11a2.46±0.15a2.50±0.11a2.44±0.00a2.36±0.03a活菌数/(CFU·g-1)6.0×1068.8×1061.4×1072.8×1072.9×107
注：不同字母表示同一行数据有显著差异(P<0.05)
2.2.2 蛋白质浓度对核桃乳缓冲能力的影响
缓冲能力是酸奶发酵过程中菌种生长的一个重要参数。发酵体系的缓冲能力越高，乳酸含量变化引起的 pH 变化就越小，所以具有较大缓冲能力的乳体系更适宜于乳酸菌的生长[21-22]。
由图6可知，蛋白质浓度越高，核桃乳体系的缓冲能力越强，pH 5.0附近的缓冲能力最大。结合图5可知，核桃乳发酵8 h后，pH约为5.0，之后继续发酵，pH下降趋势慢慢变缓，但发酵核桃乳的酸度增加很快。同时，蛋白质浓度越高，缓冲能力越大，活菌数也越高。另外，随着缓冲能力的增大，核桃乳发酵体系的pH下降减慢，造成到达发酵终点(pH≤ 4.5)的时间也越长。
图6 不同蛋白质浓度的核桃乳的缓冲能力
Fig.6 Buffering capacity of walnut milk with different protein concentrations
2.2.3 蛋白质浓度对发酵核桃乳质构特性的影响
发酵核桃乳的质构特性可通过硬度、稠度、黏聚性和黏聚指数来表征。而质构特性很大程度上取决于产品成分如蛋白质浓度和脂肪含量等[23-24]。表5为不同蛋白质质量分数(1.0%～3.0%)的发酵核桃乳的质构特性。结果表明，随着蛋白质质量分数(1.0%～2.0%)的增加，发酵核桃乳质构特性均明显增强，且硬度、稠度、黏聚性和黏聚指数都有显著性差异(P<0.05)。但随着蛋白质质量分数(2.0%～3.0%)的持续增加，在硬度上2.0%蛋白质组和2.5%组无显著性差异(P>0.05)，与3.0%蛋白质组有显著性差异(P<0.05)。随着蛋白质浓度的增加，硬度整体呈增加趋势，这可能因为蛋白质浓度越高，到达发酵终点时发酵核桃乳的酸度越大，其凝胶强度越大。但因为核桃乳中油脂含量高且核桃蛋白溶解性较差，当蛋白质浓度越高时，形成的酸性凝胶网络结构较为粗糙, 发酵核桃乳的颗粒感也越强。所以在较高的蛋白质浓度下，稠度和黏聚性不再与蛋白质浓度呈线性正相关。因为发酵核桃乳需要适宜的硬度和稠度来提供顺滑的口感，因此2.0%蛋白质的发酵核桃乳的质构更佳。
表5 不同蛋白质浓度的发酵核桃乳的质构特性
Table 5 Texture characteristics of fermented walnut milk with different protein concentrations
ω(蛋白质)/%硬度/g稠度/(g·s)黏聚性/g黏性指数/(g·s)1.043.09±0.62d124.45±1.60d-6.97±0.19d-8.73±0.49d1.566.26±2.47c191.85±5.59c-9.62±0.28c-12.76±0.13c2.074.98±0.76b210.13±3.93ab-12.80±0.57b-18.00±1.84b2.573.57±1.44b217.74±6.32a-15.20±0.39a-24.22±2.68a3.084.64±0.74a208.70±5.45b-11.19±1.20b-13.46±2.12c
注：不同字母表示同一列数据有显著差异(P<0.05)
2.2.4 蛋白质浓度对发酵核桃乳感官特性的影响
图7为不同蛋白质质量分数(1.0%～3.0%)发酵核桃乳的感官评价结果。在色泽上，不同蛋白质浓度的发酵核桃乳无显著性差异(P>0.05)，呈乳白色，有一定光泽。滋味上，1.0%蛋白质的发酵核桃乳得分最低，与其他各组有显著性差异(P<0.05)，口感偏甜。2.0%蛋白质的发酵核桃乳在气味上得分最高，和1.5%蛋白质和2.5%组得分无显著性差异(P>0.05)，但与其他2组有显著性差异(P<0.05)。因为蛋白质浓度越低，核桃自身香气和发酵香气越平淡；而蛋白质浓度高，由于核桃乳中油脂含量高，在发酵过程中也会产生一些其他的风味。在组织状态上，2.0%蛋白质的发酵核桃乳得分最高，和2.5%蛋白质组得分无显著性差异(P>0.05)，但与其他组均有显著性差异(P<0.05)。蛋白质质量分数为3.0%时，口感更厚重，但颗粒感更明显；蛋白质浓度较低组，口感比较稀薄。2.0%蛋白质的发酵核桃乳感官得分最高，酸甜比适宜，核桃的发酵香气较为浓郁，且比较细腻顺滑，黏稠度适中。
图7 不同蛋白质浓度发酵核桃乳的感官评价
Fig.7 Sensory evaluation of fermented walnut milk with different protein concentrations
3 结论
与牛奶复原乳和豆乳制备的发酵乳相比，结合考察核桃乳自身糖类组成，发现核桃乳中可发酵糖类的总量很少，核桃乳发酵6 h后即不再产酸，因此需要外加碳源。通过测定pH、酸度、活菌数和感官评价，确定发酵核桃乳外加碳源为7.0%的蔗糖。通过考察不同蛋白质浓度下核桃乳的发酵特性，发现发酵核桃乳的酸度与核桃乳的蛋白质浓度关系密切。随着蛋白质浓度的提高，一方面相同体积核桃乳中游离氨基酸和小肽含量增加，进而促进乳酸菌产酸；另一方面缓冲能力提高，适宜的pH环境使得乳酸菌可以更好地生长繁殖，提高了发酵核桃乳的酸度。比较核桃乳的发酵特性、缓冲特性并结合发酵核桃乳的质构特性及感官评价，确定2.0%蛋白质的核桃乳作为发酵基料是较为适宜的。
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