随着人们饮食习惯的改变和自身运动的减少，糖尿病和肥胖发生率显著增长。我国居民长期以谷物类食品为主，碳水化合物的摄入量占膳食总能量的70%～80%，容易影响血糖及胰岛素水平，从而引起糖尿病[1]。国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)发布的统计结果显示，截至2019年，我国糖尿病患病人数已经达到1.164亿人[2]。
饮食治疗是糖尿病治疗的基础，近来研究表明，过多摄入蔗糖容易成为肥胖、糖尿病和冠状动脉血栓病的病因；蔗糖在体内的代谢必须由胰岛素来完成，这对糖尿病病人更是严重的负担；蔗糖还容易引起龋齿；过多摄入蔗糖对心血管病人、肥胖者不适宜[3]。近年来无蔗糖或者低蔗糖食品越来越受到消费者的青睐，“低蔗糖”则指每100 g或100 mL食品的蔗糖含量不能超过5 g；“无蔗糖”则指每100 g或100 mL食品中蔗糖含量不能超过0.5 g。市场上低蔗糖或无蔗糖食品参差不齐，有些食品虽没有添加蔗糖等精制糖，但可能添加了由果糖和葡萄糖加工而成的果葡糖浆、淀粉糖浆、麦芽糖浆、麦芽糖等，这些也可能导致糖尿病和肥胖的发生。
乳酸菌口服液是市场上比较受欢迎的一类功能性食品，补充乳酸菌能够改善肠道环境，解决由于肠道紊乱引起的肥胖等一系列亚健康问题[4]。目前市场上的乳酸菌口服液中蔗糖添加量一般为50～100 g/L，不适合糖尿病病人和减肥人士食用，因此低蔗糖或无蔗糖益生菌口服液的开发是符合市场需求的。本文优化了培养基配方，选用一种既能够快速促进微生物生长，又能够保证最终产品中无蔗糖要求的低聚果糖作为发酵碳源，同时选用牛骨胶原蛋白作为氮源，开发了一款无蔗糖乳酸菌口服液，以期该口服液能够调节肠道菌群和提高人免疫力。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 菌种
菌株：副干酪乳杆菌IMC-4、嗜酸乳杆菌SS、植物乳杆菌EM2和干酪乳杆菌EM1，中国典型培养物保藏中心。
1.1.2 主要仪器
恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；超净台，青岛海尔生物医疗股份有限公司；高压灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Thermo Multiskan FC(带孵育器)酶标仪、超高效液相色谱，赛默飞世尔中国；冷冻干燥机，上海博登生物科技有限公司；e2695 Waters高压液相色谱仪，沃特世公司。
1.1.3 培养基
基础培养基[5](碳源筛选使用)(g/L)：酪蛋白胨15，酵母提取物6，吐温-80 1，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.14，调pH 6.6，121 ℃灭菌20 min。
碳源(低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、菊糖和葡萄糖)：分别用蒸馏水配制成质量浓度10 g/mL，然后无菌滤膜过滤除菌。
基础发酵培养基(g/L)：酵母抽提物2，聚葡萄糖10,(NH4)2HPO4 3。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株活化及新鲜菌液制备
将甘油保存的菌株取出，用接种针划线接种MRS平板，厌氧培养24～48 h，然后挑单菌落到MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养24～48 h，重新转接到MRS肉汤中37 ℃厌氧培养22～48 h，制备得到新鲜菌液。
1.2.2 碳源的筛选
参照碳源代谢试验[5-6]。取新鲜菌液若干，5 000 r/min离心5 min，用生理盐水洗1次，再用同体积生理盐水重悬，用生理盐水稀释50倍，作为接种液。在96孔板中加入170 μL灭菌后的基础培养基，然后分别加入20 μL各种糖液(过滤除菌)，再加入10 μL接种液，不接菌孔作为对照。每孔加入50 μL石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。
把96孔板放入酶标仪，设置37 ℃温孵培养24～48 h，期间每隔1 h检测一次菌体浓度OD600,并根据实验数据做生长曲线，确定菌株生长比较好的碳源作下一步实验。
在基础发酵培养基中加入3 g/mL的脱脂奶粉作为氮源，然后再加入96孔板试验中选定的碳源，添加量分别是5、10、20、30、40 g/L，加入蒸馏水，115 ℃，高压灭菌30 min。分别把4株菌的新鲜菌液按照0.2%(体积分数)的接种量接种于发酵培养基中，37 ℃混合发酵22 h后停止发酵。用高压液相色谱测定发酵后的蔗糖、葡萄糖、乳糖和果糖的含量[7]，按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》标准测定菌量。
1.2.3 氮源的筛选
分别称取基础发酵培养基，加入碳源，再分别加入30 g/L的脱脂乳粉、浓缩乳清蛋白和牛骨胶原蛋白肽，然后加入蒸馏水，115 ℃，高压灭菌30 min。乳酸菌口服液的制备和菌量的测定同1.2.2。
配制基础发酵培养基，加入适量碳源，然后加入氮源，氮源的添加量分别为8、15和30 g/L，加入蒸馏水，115 ℃，高压灭菌30 min。乳酸菌口服液的制备和菌量的测定同1.2.2。
1.2.4 甜味剂的筛选
称取基础发酵培养基，加入碳源和氮源，分别加入木糖醇(30和50 g/L)、山梨糖醇(30和50 g/L)、罗汉果苷(0.1和0.2 g/L)和甜菊糖苷(0.1和0.2 g/L)4种甜味剂，加入蒸馏水，115 ℃，高压灭菌30 min。分别把4株菌的新鲜菌液按照0.2%(体积分数)的接种量接种于发酵培养基中，37 ℃混合发酵22 h后停止发酵。探索这几种甜味剂的适口性。
1.2.5 加速稳定性试验
由于口服液的保质期比较长，所以在37 ℃极端条件下测定口服液的稳定性[8]。
称取基础发酵培养基，加入碳源、氮源和甜味剂，115 ℃，高压灭菌30 min。分别把4株菌的新鲜菌液按照0.2%(体积分数)的接种量接种于发酵培养基中，37 ℃混合发酵22 h后停止发酵，制备得到无蔗糖乳酸菌口服液。同时购买市场上新鲜日期的益生菌口服液作为对照。将无蔗糖乳酸菌口服液和市场上购买的口服液放置于37 ℃培养箱中，每隔一段时间取样测定菌量，观察2种口服液的稳定性趋势。
1.2.6 无蔗糖乳酸菌口服液的非靶向代谢组学分析
1.2.6.1 口服液的制备及预处理
称取基础发酵培养基，加入碳源和氮源，115 ℃，高压灭菌30 min。分别把4株菌的新鲜菌液按照0.2%(体积分数)的接种量接种于发酵培养基中，37 ℃混合发酵22 h后停止发酵，制备得到无蔗糖乳酸菌口服液。首先将其用超声波破碎仪破碎20 min，然后75 ℃水浴锅中灭活15 min，灭活后的口服液以10 000 r/min离心10 min，收集上清液，上清液用冷冻干燥机冷冻干燥，收集样品。每份样品3个平行。
1.2.6.2 非靶向代谢组学分析
制备好的样品送到上海美吉生物进行非靶向代谢组学测定，样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。
数据采用代谢组学软件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)进行峰提取、对齐、鉴定等，最终得到含保留时间、峰面积、质荷比以及鉴定信息的数据矩阵，用于后期处理及生物信息学分析。
2 结果与分析
2.1 碳源的筛选
益生元是一类寡糖能够特异性增殖乳酸菌和双歧杆菌，糖尿病病人可以食用，并且不会引起血糖增高[9]，所以本文探索益生元代替蔗糖作为碳源来发酵口服液。
不同的菌株对寡糖的利用效果是不一样的，本文选用了低聚果糖，低聚木糖，低聚半乳糖和菊糖4种寡糖来评价4株乳酸菌的生长情况，并同时以葡萄糖为对照(图1)。通过生长曲线对比发现，4个菌种利用低聚果糖作为碳源时生长速率最快，接近于葡萄糖作为碳源的生长速率；低聚半乳糖作为碳源时，副干酪乳杆菌生长状态不好；菊糖作为碳源时，副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌生长状态不好；低聚木糖作为碳源时，4株菌的生长状态都不好。当把4种菌混合培养接种于不同的碳源培养基时，发现低聚果糖和低聚半乳糖作为碳源时的菌量接近于葡萄糖作为碳源的菌量。由于以低聚半乳糖作为碳源时，存在部分菌生长状态不好的情况，所以最终选定低聚果糖作为无蔗糖口服液的碳源。
a-葡萄糖；b-低聚半乳糖；c-低聚果糖；d-菊糖；e-低聚木糖；f-混合菌株
图1 菌株利用不同的碳源的生长曲线
Fig.1 The growth curves of different strains which use different carbon sources
注：EM1-干酪乳杆菌EM1；EM2-植物乳杆菌EM2；SS-嗜酸乳杆菌SS；IMC-4-副干酪乳杆菌IMC-4
低聚果糖作为碳源，其添加量的多少与口服液菌量相关，如表1所示，20 g/L以下的低聚果糖添加量会使菌量偏低，不能够满足乳酸菌生长需要，20 g/L以上的低聚果糖添加量不仅增加了生产成本，还会造成菌量下降，因此选用20 g/L的低聚果糖作为添加量。但是由于该实验中选择脱脂乳粉作为氮源，所以乳糖含量偏高。
表1 低聚果糖添加量对糖含量和菌量的影响
Table 1 Effects of oligosaccharides on sugar content and bacteria count
低聚果糖添加量/(g·L-1)蔗糖/(g·L-1)乳糖/(g·L-1)葡萄糖/g·L-1果糖/(g·L-1)菌量/(CFU·mL-1)5 0.5511.620.090.005.07×108101.0711.690.080.225.37×108201.3512.090.080.475.80×10830 1.9212.110.090.394.27×108402.3712.040.080.004.57×108
2.2 氮源的筛选
氮源是微生物生长的必需元素。本文探讨了3种有机氮源(脱脂奶粉，浓缩乳清蛋白和牛骨胶原蛋白)对微生物发酵的影响。3种氮源都能够满足菌量生长需要(表2)，浓缩乳清蛋白和牛骨胶原蛋白作为氮源时菌量偏高。浓缩乳清蛋白作为氮源时乳糖含量偏高，会影响血糖含量，牛骨胶原蛋白肽作为氮源时，发酵液中蔗糖，乳糖，葡萄糖和果糖的总含量最低，没有特殊的不良气味，菌量偏高，所以选择牛骨胶原蛋白肽作为发酵的氮源。
如表3所示，添加8和30 g/L的牛骨胶原蛋白肽对菌量的影响不大，蔗糖的含量都低于5 g/L，从生产成本上考虑选用8 g/L牛骨胶原蛋白肽。
表2 氮源对糖的含量和菌量的影响
Table 2 Effects of nitrogen source on sugar content and bacterial count
氮源蔗糖/(g·L-1)乳糖/(g·L-1)葡萄糖/(g·L-1)果糖/(g·L-1)菌量/(CFU·mL-1)脱脂奶粉1.3512.090.080.475.80×108浓缩乳清蛋白013.9423.7206.40×108牛骨胶原蛋白肽2.6400.171.716.42×108
表3 牛骨胶原蛋白肽添加量对糖含量和菌量的影响
Table 3 Effects of bovine ossein supplemental level on sugar content and bacterial count
牛骨胶原蛋白添加量/(g·L-1)蔗糖/(g·L-1)乳糖/(g·L-1)葡萄糖/(g·L-1)果糖/(g·L-1)菌量/(CFU·mL-1)82.8600.171.066.40×108152.2200.181.226.42×108302.6400.1706.42×108
2.3 甜味剂的筛选
口服液作为食品，味道是一个关键指标，由于发酵的口服液中含有大量的乳酸，味道偏酸，所以选用甜味产物来改善口味。目前市场上的乳酸菌口服液中蔗糖添加量一般为5%～10%，但是蔗糖会增加糖尿病人的血糖浓度，不适合本产品使用。阿斯巴甜的摄入与单链脂肪酸丙酸升高有关[10]，人工甜味剂(三氯蔗糖，安赛蜜等)的长期食用会引起小鼠葡萄糖耐受性的降低[11]。糖醇类产品和天然代糖相对来讲比较安全，是本产品的最佳选择。
本文中选用的甜味剂有木糖醇、山梨糖醇、甜菊糖苷和罗汉果苷，发现木糖醇和山梨糖醇甜度偏低，30 g/L的添加量对口味没有改善，50 g/L的添加量甜度合适，但是会延长发酵时间，发酵液pH达到4.0的发酵时间从22 h延长到30 h；0.1 g/L和0.2 g/L的甜菊糖苷后味齁甜，有金属味，口感偏差；0.1 g/L的罗汉果苷甜度偏低，0.2 g/L的罗汉果甜度合适，接近于蔗糖的口味，所以选用0.2 g/L的罗汉果苷作为甜味剂。
2.4 加速稳定性试验
由于口服液在常温条件下保质期比较长，所以采用加速试验测定其稳定性，并和市场上某含蔗糖类的口服液做对比。益生菌加速试验是指在保证不改变益生菌产品失效机理的前提下，通过强化温度试验条件，使受试益生菌加速失效，以便在较短时间内获得必要益生菌稳定性，来评估益生菌在正常条件下的可靠性或寿命指标。根据文献报到[8]，37 ℃对益生菌是一个比较合适的加速温度，所以选用37 ℃作为加速温度考察无蔗糖乳酸菌口服液的稳定性。
如表4所示，无蔗糖乳酸菌口服液的稳定性比市场上某口服液的稳定性略好。无蔗糖乳酸菌口服液的菌量降为1.26×103CFU/mL的时间为19 d；而市场上某口服液降到同一数量级菌量(5×103CFU/mL)的时间为13 d。说明无蔗糖口服液的菌量下降速率较低，稳定性较好，推测是以低聚果糖为碳源，改变了菌株的生长和凋亡代谢途径，从而提高了产品的保质期。
表4 无蔗糖乳酸菌口服液和市场上某口服液在37 ℃条件下的菌量变化 单位：CFU/mL
Table 4 The bacteria quantity changes between the sucrose-free product and the other product at 37 ℃
口服液种类时间/d0.005.049.0213.0216.0019.10市场上某口服液9.70×1081.91×1082.64×1075.00×103241无蔗糖乳酸菌口服液6.25×1086.90×1071.66×1072.07×1062.00×1051.26×103
2.5 非靶向组学分析
2.5.1 口服液的色谱图
所有样本均在UPLC-MS平台上分析,对QC样本正、负离子质谱总离子流图(total ion current，TIC)进行谱图叠加比较[12]，见图2。结果表明，各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明仪器误差较小，数据可靠。
a-正离子模式色谱图;b-负离子模式色谱图
图2 QC样品正负离子模式总离子流色谱图
Fig.2 Total ion flow chromatogram of QC sample in positive and negative ion mode
2.5.2 口服液发酵前后的主成分分析[13]
样本通过降维分析后，在主成分1和2上有相对坐标点，各个坐标点的距离代表了样本间聚集和离散程度，距离越近表明样本间相似性越高，距离越远表明样本间差异性越大。从图3看，发酵前的3个样本主成分较紧密聚集，说明实验的重复性很好。发酵前的主要成分是培养基中的碳源和氮源，而发酵后的3个样品在主成分2上差异稍大，但在误差范围之内，说明实验结果可靠，发酵后的主要成分是氨基酸和有机酸。有机酸是乳酸菌发酵的主要代谢产物，氨基酸是乳酸代谢过程中产生的有机小分子。
图3 主成分分析
Fig.3 Principal component analysis
2.5.3 口服液中的代谢产物
韦恩图谱分析口服液中共有614种物质，发酵后的代谢产物有23类明显高于发酵前，分别是神经酰胺、三萜类皂苷SA4、二羟蚕豆酮酸、那拉霉素、香豆精类物质伞形酮、香酚内酯，奥沙西泮、葡萄糖醛酸、β-卟啉类衍生物、葡糖苷酸、香兰素、腺苷、一种脂类、乙烯愈创木酚、苯并吡喃酮、角吡喃香豆素类化合物、S-丙基1-丙烷亚硫酸脂、二氢黄酮酸、那拉霉素、烟嘧啶、对甲苯硫酸盐、9-磷酸-N-乙酰神经氨酸、芳基苯并呋喃黄酮类。其中神经酰胺有保持皮肤水分和抗衰老的作用[14-15]，三萜类皂苷有多重生物活性和药理作用[16-17]，奥沙西泮具有抗菌抑菌和助睡眠功效，β-卟啉类衍生物具有抗病毒、抗氧化和抗肿瘤功效[18]，葡萄糖醛酸有解毒功效。
口服液中的614种物质，主要是有机酸，氨基酸，脂类及核苷类物质。有机酸是乳酸菌的主要代谢产物，能够加快肠道的蠕动，促进食物消化吸收，并具有杀菌和抑菌特性[19]。氨基酸是含氮化合物和蛋白质中关键的化学成分，它们的代谢是植物、微生物生长和发育的基础。氨基酸缺乏会导致低血糖[20]。脂类物质不仅是人体维持正常运行的必须物质，还具有较强的抗菌作用[21]。核苷酸具有抗氧化作用，食物中缺乏核苷酸可损害肝脏，心脏、肠道和免疫系统[22]。
2.5.4 口服液中物质的种类及参与KEGG代谢通路统计和通路富集
在HMDB 4.0(Human Metabolome Database)数据库中进行口服液中物质比对，其成分占有比例如下：有机酸及其衍生物(含氨基酸)占26.04%，脂质和类脂质分子占29.59%,其他物质占44.37%。有机酸，氨基酸和脂类物质是主要成分。
口服液中物质通过KEGG重要通路统计，有178种代谢物参与20种物质代谢通路KEGG(图4)，其中28.6%参与氨基酸代谢，10.6%参与膜运输，10.6%参与异生物质的生物降解和代谢，7.3%参与次级代谢产物的合成，剩余的参与脂类代谢和糖代谢等代谢通路。
图4 KEGG通路统计图
Fig.4 KEGG pathway diagram
进一步通路富集分析发现参与比较多的是谷氨酸和谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸代谢通路，氨酰转运核糖核苷酸的生物合成，嘌呤代谢等(图5)。谷氨酸和谷氨酰胺是人体的非必需氨基酸，谷氨酸-谷氨酰胺循环是神经元和胶质细胞之间进行信息传递的重要媒介,对维持神经递质的平衡以及正常的脑功能具有重要意义[23]。精氨酸为碱性氨基酸是人体内必需的1种氨基酸，能催化鸟氨酸循环的进行，促进尿素的形成而使人体内的氨变成无毒尿素。有研究发现，谷氨酰胺和精氨酸均能增强抗炎症和抗氧化能力，可改善脂质代谢，降低糖尿病人氧化损伤，对维持机体正常生理功能具有重要作用[24-25]。天冬氨酸能调节脑和神经的代谢功能，其左旋体L-天冬氨酸广泛用做氨解毒剂，肝机能促进剂，疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂[26]。丙氨酸能提高甜度、柔和甜味，减少人工合成甜味剂的使用，符合现代“低糖”的饮食习惯，可用于制作适合糖尿病病人食用的食品[27]。代谢物质参与这些代谢通路，能够促进机体新陈代谢，抵抗疲劳，提高机体免疫力，维持机体的健康。嘌呤代谢提供了大量重要生物合成所需的能量和辅助因子,嘌呤代谢异常能引发很多疾病如：痛风、免疫系统疾病、血液疾病、肾脏疾病等。
图5 KEGG通路富集分析图
Fig.5 KEGG enrichment analysis
注:*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001
3 结论
乳酸菌口服液的发酵一般使用蔗糖、葡萄糖浆和糖蜜等微生物容易利用的原料作为碳源，但是这些原料在微生物发酵后会有很多残留，使口服液中糖含量偏高。不同的菌株对益生元的利用效果不同，本文探讨了低聚木糖，低聚果糖，低聚半乳糖和菊糖对4株菌的增殖作用，发现低聚果糖的效果最好。低聚果糖具有促进双歧杆菌增殖、降血糖，改善血清脂质，促进微量元素吸收等优良生理功能，且低聚果糖不含蔗糖和葡萄糖。以低聚果糖为碳源改变了乳酸菌的代谢途径，提高了菌株的稳定性，从而使无蔗糖口服液稳定性要好于市场上含蔗糖的口服液。本研究还通过非靶向代谢组学分析发现以低聚果糖为碳源发酵制备得到的口服液中不仅含有较高的有机酸和氨基酸，还有很多特殊的有益成分如神经酰胺，三萜类皂苷SA4和β-卟啉类衍生物等。本研究为后期探讨其他无蔗糖类产品的制备和产物分析提供了方法支持。
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