中国是世界蚕桑业的起源地，桑树栽培利用起源于我国的中北部地区，距今约6 000年历史。桑树(Morus alba L.)为特种经济树种，具有耐旱、耐瘠薄，适应土壤性能强等优点，在全国广泛栽培，我国是世界上最大的蚕桑生产国[1]。
桑叶为桑科植物桑树的叶片，是常用的中药药材，亦可食用，具有降血糖、降血压、降血脂、抗菌消炎、抗病毒、抗敏、防痉挛、凉血明目等多种功效，常用于治疗伤风感冒、咽喉肿痛等症[2]。桑叶中含有多糖、黄酮、生物碱、脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，1-DNJ)、多酚等功能成分[3-4]。桑叶、桑叶制品及桑叶提取物制品在食品、药品和保健品行业的应用前景广泛，随着加工工艺和技术的提升，桑叶作为药食两用加工原料的应用价值日益显现。
强桑1号是长江中下游以南地区种植比较广泛的桑树品种，树形直立、树冠紧凑、枝条粗长，具有产叶量高、较抗旱、秋叶硬化迟、叶形大适合采摘等优点[5]。为了防止桑叶老化，采摘后需迅速杀青。杀青处理能使鲜叶中的酶失活，防止多酚类的化合物氧化，保持鲜叶色泽；同时可以去除桑叶的生青味，有助于桑叶散发特有香气；另外去除了桑叶的部分水分。冷冻超微粉碎是一种先进的物料加工技术，冷冻粉碎不仅可以保持原料的色、香、味及功能成分活性，还可以使物料粒度达到超细微的程度，尤其适合加工成分较复杂的农产品及食品原料[6]。
本研究以强桑1号桑叶为原料，首先研究了桑叶的杀青工艺，其次研究了桑叶粉制备和冷冻超微粉碎处理对桑叶粉理化性质(粒径、持水力、持油力、膨胀率和功能成分)的影响，以期为桑叶的加工利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料：桑叶采自江西省，品种为强桑1号(叶用桑)。
试剂：1-DNJ、芦丁、苦参碱、没食子酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、叶绿素a、叶绿素b，上海源叶生物；H2SO4、石油醚、KOH、丙酮(以上为分析纯)、乙酸、K2HPO4、乙腈(以上为色谱纯)，国药集团化学试剂有限公司；乙醇(分析纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
U3000高效液相色谱仪、BR4I离心机，美国Thermo Fisher公司；mastersizer 2000激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；FA-1004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；8453紫外可见分光光度计，安捷伦科技有限公司；HE53水份测定仪，梅特勒托利多科技(中国)有限公司；WZJ-12B振动式药物冷冻超微粉碎机，济南天方机械有限公司；DF-70水冷双级高速齿轮传动粉碎机，温岭市林大机械有限公司；热泵干燥房，南昌永淦节能科技有限公司；YN-10kW微波干燥柜，广州越能工业微波设备有限公司；KQ-800DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 杀青方法
采摘新鲜桑叶，清洗晾干后杀青处理。
微波杀青：使用微波干燥柜处理原料，工作功率10 kW，处理时间2和5 min，获得样品1和样品2；
沸水漂烫杀青：使用夹层锅进行沸水漂烫，漂烫温度100 ℃，漂烫时间2和5 min，获得样品3和样品4。
杀青后的桑叶摆盘，移入自动控温热泵房中干燥。采用梯度升温法进行干燥，升温范围为40～55 ℃，干燥时间24 h。
1.3.1.1 杀青桑叶感官评价
10位具有农产品加工专业背景的科技人员进行感官评价，男女比例为1∶1。对4种杀青后干燥桑叶样品的色泽、气味、质地做出评价，评分细则如表1所示。
表1 干燥桑叶感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standard of dehydrated mulberry leaf samples
评分项目8～10分4～7分0～3分色泽(10分)色泽暗绿,叶面有光泽色泽黄绿,叶面略有光泽,有些许褐变色泽较差,褐变明显,叶片边缘焦枯气味(10分)桑叶香气浓郁,无异味桑叶香气较浓郁,有青草味或其他气味桑叶香气淡,青草味或者其他气味浓质地(10分)叶片柔软,有柔韧感叶片硬,柔韧感差叶片硬实,易碎,无柔韧感
1.3.1.2 桑叶功能成分检测
(1)高效液相色谱法
1-DNJ检测条件：C18柱；流速1 mL/min；洗脱时间30 min；柱温箱25 ℃；进样量10 μL；流动相：V(乙腈)∶V(0.1%乙酸水溶液)=50∶50；检测波长265 nm。
甘露糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖检测条件：C18柱；流速1 mL/min；洗脱时间60 min；柱温箱25 ℃；进样量10 μL；流动相：V[0.1 mol/L KH2PO4(pH 6.8)]∶V(乙腈)=82∶18；检测波长245 nm。
(2)分光光度法
检测粗多糖、总生物碱、总黄酮、多酚、叶绿素(a、b)，方法如下：
粗多糖：苯酚硫酸法。于490 nm波长测吸光度。标准曲线标样为葡萄糖。
总生物碱：溴麝香草酚蓝法。于414 nm波长测吸光度。标准曲线标样为苦参碱。
总黄酮：称取1.0 g样品于三角瓶中，加无水乙醇30 mL，超声波提取1 h，过滤至50 mL容量瓶中，无水乙醇定容。吸取1 mL待测液于50 mL容量瓶，加无水乙醇至15 mL，加入100 g/L的Al(NO3)3 1 mL，98 g/L的乙酸钾1 mL，定容，室温下放置30 min，于420 nm波长测吸光度。标准曲线标样为芦丁。
多酚：称取0.200 0 g样品，加5 mL 70%甲醇水溶液提取，定容至100 mL。如有浑浊或沉淀，过滤后待用。取10 mL定容至100 mL为测试液，吸取1 mL测试液于刻度试管中，在试管内分别加入5.0 mL体积分数10%福林酚试剂，摇匀，反应3～8 min内，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，摇匀。室温下放置60 min，于765 nm波长测吸光度。标准曲线标样为没食子酸。
叶绿素：取样品0.5 g左右，加入50 mL 1∶1(体积比)无水乙醇和丙酮混合溶液提取5 h，过滤，取滤液待测。分别测定645和663 nm波长的吸光度。标准曲线标样为叶绿素a和叶绿素b。
1.3.2 桑叶粉制备和理化性质研究
1.3.2.1 桑叶粉制备方法
根据1.3.1的试验结果选择适宜的杀青方法处理桑叶，烘干。进一步处理获得桑叶粗粉、细粉和超微粉样品。
粗粉处理设备为普通台式粉碎机，常温下粉碎，每次1 min，重复3次；细粉处理设备为水冷双级高速齿轮传动粉碎机，常温下连续处理；超微粉处理设备为冷冻超微粉碎机，处理温度-15 ℃，处理时间10 min。
1.3.2.2 粒度分析
称取适量的桑叶粉，配制悬浮溶液(1 g/100 mL)，超声波均质处理10 min，上激光粒度仪进行检测。
1.3.2.3 桑叶粉持水力、持油力和膨胀率[7-8]
持水力：准确称量1.0 g的桑叶粉于50 mL离心管中，加入纯水25 mL，超声波均质20 min，然后，3 600 r/min离心20 min，弃上清液，尽量吸干离心管壁上的剩余水珠，称质量。持水力按公式(1)计算。
持水力
(1)
持油力：准确称量1.0 g的桑叶粉于50 mL离心管中，加入食用油25 mL，超声波均质20 min，3 600 r/min离心20 min，弃上层油脂，尽量吸干离心管壁上的剩余油脂，称质量。持油力按公式(2)计算。
持油力
(2)
膨胀率：准确称取5.0 g的桑叶粉样品，置于50 mL量筒中，记录体积，加入45 mL纯水，搅拌均匀并且超声波均质20 min，静置24 h，记录粉体的体积。膨胀率按公式(3)计算。
膨胀率
(3)
1.3.2.4 桑叶粉功能成分检测
对桑叶细粉、超微粉的主要功能成分进行检测。检测方法同1.3.1.2。
1.4 数据处理
使用SPSS 24进行数据处理，平行实验的结果表示为“平均值±标准差”，使用Excel 2019制表。
2 结果与分析
2.1 桑叶杀青方法研究
2.1.1 感官评价分析
即使采用较大型的微波加热设备，在微波杀青的过程中，处于设备托盘边缘的桑叶仍然出现了焦枯的现象，分析出现这种现象的原因是微波加热不均，处于外围的桑叶局部剧烈脱水而导致的。漂烫杀青法是将原料置于沸水中进行漂烫处理，漂烫过程中不断搅拌，原料受热均匀，因此不易发生原料受热不均的现象。
表2为桑叶杀青后干燥的感官评价结果。微波杀青样品得分低于沸水漂烫杀青样品，样品4的色泽、气味、质地分数均为最高，且与其他样品具有显著性差异。
表2 干燥桑叶感官评价得分
Table 2 Sensory evaluation scores of 4 dehydrated mulberry leaves
样品色泽气味质地总分15.6±1.14b6.6±1.14ab3.8±0.84b16.0±1.87b24.2±0.84a5.6±0.89a2.6±0.55a12.4±1.34a37.8±0.83c7.6±1.14b6.0±1.00c21.4±1.14c48.8±0.84c9.4±0.89c8.2±0.45d26.4±1.81d
注：同列不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)(下同)
2.1.2 桑叶功能成分分析
1-DNJ存在于桑科植物中的根、枝、叶中，它可竞争性地抑制小肠黏膜上的α-糖苷酶的活性，减缓葡萄糖的吸收速率，有效降低餐后血糖浓度，且无胃肠道副作用[9-11]。1-DNJ标样的色谱响应图见图1。液相色谱的试验条件下，1-DNJ的出峰时间为3.02 min前后。
图1 1-DNJ标样液相色谱图
Fig.1 LC of 1-DNJ standard sample
粗多糖、4种单糖(甘露糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖)、总生物碱、总黄酮、多酚、叶绿素(a、b)和1-DNJ的检测结果见表3。样品4的粗多糖、4种单糖、总生物碱、总黄酮和叶绿素b含量最高，样品2多酚和叶绿素a的含量最高，样品3的1-DNJ含量最高。结果表明漂烫杀青提高了桑叶样品中粗多糖、总生物碱、1-DNJ和总黄酮的含量，大幅提高了4种功能单糖含量。由于多酚易溶于水，沸水漂烫杀青的样品3、样品4多酚损耗比较大。同微波杀青相比，漂烫杀青的样品叶绿素a含量有所下降，叶绿素b含量升高。漂烫杀青提高了多种功能成分的含量，有助于这些成分的保持和溶出，因此漂烫杀青是适宜的处理方式。
表3 四种桑叶样品中的功能成分含量 单位：mg/kg
Table 3 Content of functional components in different samples
样品1234粗多糖2.00×1041.80×1041.86×1042.56×104∗甘露糖2 465.572 396.212 645.883 132.90∗木糖10 699.59 10 586.36 14 098.89 16 807.36∗阿拉伯糖16 206.97 16 058.71 20 844.99 23 008.23∗ 岩藻糖1 956.15 1 854.55 2 244.99 2 784.85∗总生物碱2.31×1042.17×1042.92×1043.65×104∗总黄酮4.11×1044.22×1044.06×1044.59×104∗多酚1.45×1041.74×104∗1.04×1040.6×104叶绿素a1.54×1031.59×103∗1.41×1031.48×103叶绿素b0.478×1031.27×1030.962×1031.49×103∗1-DNJ486.66 524.84 602.59∗ 406.25
注：“*”表示同比最大
2.2 超微粉碎处理对桑叶粉理化性质的影响
2.2.1 桑叶粉粒径及分布
D50通常用来表示样品的平均粒径，由表4可知，粗粉、细粉和超微粉的D50分别为282.508 0、200.000 0和28.251 0 μm。-15 ℃，超微粉碎10 min，对样品的粒径影响显著。
粒径分布跨度值(Span值)说明样品颗粒分布的范围，值越小，分布范围区间越小。根据表4，冷冻超微粉碎10 min，超微粉的Span值为4.33，大于粗粉和细粉。分析是因为冷冻超微粉碎处理时间较短，样品颗粒的粒径大幅下降的同时粒径分布范围扩大了。进一步延长冷冻超微粉碎的处理时间(>30 min)，可获得分布范围小的冷冻超微粉颗粒(Span<2)。综合考虑时间、经济成本以及产品的实际使用效果，-15 ℃粉碎10 min是比较适宜的操作参数。
表4 桑叶粉的粒径检测结果
Table 4 Particle size of mulberry leaf powder
样品粒径/μmD10D50D90Span粗粉22.440 0282.508 0632.456 02.16细粉11.247 0200.000 0502.377 02.46超微粉3.991 028.251 0126.191 04.33
注：D10、D50、D90分别指样品的累计粒度分布百分数达到10%、50%、90%时所对应的粒径，Span=(D90-D10)/D50
2.2.2 桑叶粉的持水力、持油力和膨胀率
根据中国营养协会的定义，膳食纤维一般是指不易被消化酶消化的多糖类食物。高纤维含量的样品一般都具有比较高的持水力、持油力和膨胀率，食用膳食纤维能够保持人体消化系统健康，起到预防高血压、高血糖、心脑血管疾病的作用[12-13]。
表5为样品的持水力、持油力和膨胀率。粗粉的持水力为0.26 g/g，细粉的持水力为0.31 g/g，超微粉的持水力为0.21 g/g。超微粉的持水力最低，这和何运等[8]的研究结果相同。分析认为随着粉碎处理程度的提升，桑叶粉样品的颗粒比表面积增大，暴露了更多的纤维素和半纤维素的亲水基团，因此样品的持水力有所上升，随着粒径进一步降低，更多的疏水基团暴露，持水力转而下降。3种样品的持油力基本持平，样品的持油力主要有亲油物质决定，说明粉碎方式对亲油物质的影响较小。粗粉、细粉和超微粉的膨胀率分别为241.67%、357.87%、376.67%。分析可能是因为粉碎后产生更多的纤维颗粒，溶于水后颗粒伸展从而产生更大的体积，冷冻超微粉碎有可能使桑叶的纤维结构进一步蓬松，增大孔隙率，因此膨胀率增大。
表5 桑叶粉的持水力、持油力和膨胀率
Table 5 Water holding capacity, oil holding capacity and expansibility of mulberry leaf powder
样品持水力/(g·g-1)持油力/(g·g-1)膨胀率/%粗粉0.26±0.003 3 b0.11±0.005 4 a241.67±56.365 6 a细粉0.31±0.009 1 c0.11±0.003 4 a357.87±22.583 8 b超微粉0.21±0.012 7 a0.11±0.000 8 a376.67±20.816 7 b
2.2.3 桑叶粉功能成分分析
细粉和冷冻超微粉单糖含量结果如表6所示，冷冻超微粉碎后，核糖、木糖、阿拉伯糖的含量略有上升，甘露糖、鼠李糖、葡糖糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、岩藻糖的含量略有下降，葡糖糖含量下降明显。因此，冷冻超微粉碎对样品的单糖含量综合影响较小。
表6 冷冻超微粉碎前后桑叶颗粒样品的单糖含量 单位：mg/kg
Table 6 Content of monosaccharide of samples before and after freezing superfine grinding
样品甘露糖核糖鼠李糖葡萄糖醛酸半乳糖醛酸葡萄糖半乳糖木糖阿拉伯糖岩藻糖细粉3 132.90 833.7711 476.194 648.4826 766.2389 374.03 30 459.7416 807.3623 008.232 784.85超微粉2 937.95 847.7711 408.934 467.4125 020.9865 052.2329 242.8616 850.0023 336.612 597.77
粗多糖、总生物碱、1-DNJ、总黄酮、多酚和叶绿素的结果如表7所示，冷冻超微粉碎后，粗多糖、总生物碱、总黄酮和叶绿素a的含量上升，其中粗多糖和总黄酮含量明显上升；1-DNJ、多酚和叶绿素b含量略有下降。冷冻超微粉碎对样品的粗多糖、总黄酮的影响非常显著，分析可能是因为冷冻超微粉碎对大分子、长链结构的成分(纤维素等)具有破碎作用，纤维素分解成多糖，因此多糖含量增加。冷冻超微粉碎处理可以促进黄酮类物质溶出，因此黄酮含量增加。
表7 冷冻超微粉碎前后桑叶颗粒样品的其他功能成分 单位：mg/kg
Table 7 Content of functional components before and after freezing superfine grinding
样品粗多糖总生物碱1-DNJ总黄酮多酚叶绿素a叶绿素b细粉20 010.9936 514.54 406.25 45 892.126 0001 4801 490超微粉32 184.6236 994.07394.0366 615.125 8001 6501 250
3 讨论和结论
桑叶功能成分的变化可以反映杀青和超微粉碎对桑叶品质的影响效果。本研究有针对性地选取了具有代表性的功能成分作为分析对象。多糖类物质是生物体中维持细胞组织结构和提供能量来源的物质，生物碱是一类含氮的碱性化合物，黄酮类物质是一种天然植物成分，它们均广泛存在于植物中。这些物质具有多种生物活性和生理功能，包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗炎、控制血糖、代谢胆固醇、降血脂以及护肝等[14-16]。一些功能性单糖的含量往往被用来衡量此类产品的质量，其中，甘露糖具有促进伤口愈合、抗炎、调节免疫系统、避免细菌感染、抗癌等生物活性；木糖具有优异的促进人体肠道益生菌生长的作用，从而起到抗细菌、抗霉菌的作用；阿拉伯糖具有抑制蔗糖吸收的作用，可以控制血糖升高，预防便秘；岩藻糖具有神经传导，抑制癌症，预防和治疗呼吸道感染等作用，因此对植物多糖中的单糖组成分析非常有必要[17]。此外，黄酮和叶绿素还可以用作天然色素。
为了有效利用桑叶特别是不可直接食用的桑叶，拓展和延长桑叶在食品加工和保健品加工业中的用途和生产周期，开展本研究得到以下结论：
(1)漂烫杀青(100 ℃、5 min)处理的样品，感官评价总分为26.4分，漂烫杀青(100 ℃、2 min)处理的样品总分为21.4分，微波杀青(10 kW功率，5 min)处理的样品总分为12.4分，微波杀青(10 kW功率，2 min)处理的样品总分为16分。漂烫杀青样品具有更好的色泽、气味和质地，提高了产品的附加值。
(2)漂烫杀青提高了桑叶样品中粗多糖、总生物碱、1-DNJ和总黄酮的含量，大幅提高了4种单糖(甘露糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖)含量。
(3)冷冻超微粉碎能够在短时间内(10 min)降低样品颗粒的粒径(D50<30 μm)、提高样品的膨胀率、显著增加样品的粗多糖、总黄酮等成分的检出量。粗多糖检出量提高60.83%，总生物碱检出量提高1.31%，总黄酮检出量提高45.16%。研究结果可为桑叶资源的开发利用提供理论依据。
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