发酵香肠也称生香肠，是指将一定比例和大小的猪肉或牛肉等的瘦肉丁及其脂肪颗粒，与适量的蔗糖、食盐、香辛料等辅料充分混合均匀后，灌进肠衣，经自然或强化微生物发酵后，制成的具有稳定微生物学特性与典型发酵香味的肉制品[1]。在漫长的发展过程中，世界各地都诞生了具有本地特色的发酵香肠，大体上可分为中式和西式发酵香肠两大类[2]。其中，中式发酵香肠一般在食用前需要蒸煮熟化，而西式的香肠，通常无需蒸煮就可直接食用[3]。意大利的萨拉米香肠是西式发酵香肠中的典型代表之一，因独特的口感，在欧洲等地拥有很好的知名度，深受消费者欢迎[4]。随着我国开放程度的日益增加和消费水平的不断提高，萨拉米发酵香肠等西式发酵肉制品正迅速抢占我国发酵肉制品的高端市场，给我国发酵肉制品产业带来很大的压力。
萨拉米发酵香肠的生产过程一般可分为高温发酵(22～24 ℃)和低温成熟(10～14 ℃)2个阶段，高温发酵时间通常为7 d，而低温成熟时间大约为30～40 d[5]。根据发酵过程中是否强化微生物，萨拉米香肠可分为不强化微生物的自然发酵产品，以及强化微生物的强化发酵产品。通常前者的风味特色鲜明，但存在发酵时间长，批次间差异性较大，若发酵条件控制不当，还有可能被有害微生物污染等问题[6]；而后者通过针对性地强化一些有益微生物，不仅可缩短发酵周期，改良香肠的风味，同时还可很好地控制有害微生物生长，降低亚硝酸盐等有害成分的含量，保证香肠的品质，并保持不同批次产品的一致性[7]。
李超等[8]通过将乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)混合发酵制得营养丰富、口味独特、风味良好的鸭肉香肠。李静雯等[9]在山羊肉中添加乳酸片球菌和米根霉(Rhizopus oryzae)混合发酵得到酸度适宜、感官评分高、羊膻味低、风味优良的羊肉香肠。PEDONESE等[10]将清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)接种到香肠中，发现它们可抑制单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和革兰氏阴性腐败微生物等食源性病原菌的生长。
娄地青霉(Penicillum roqueforti)因其对蛋白质和脂肪的分解能力，一直被广泛用作蓝纹奶酪的发酵剂[11-12]。GUO等[13]将娄地青霉接种至鸡胸肉中，发现发酵成熟后的鸡胸肉由条状变为颗粒状，硬度和弹性降低，黏性和持水能力提高，风味化合物尤其是醛类物质的种类和含量都有明显增加。但将乳酸片球菌和娄地青霉混合强化发酵香肠还未见相关研究报道。本研究拟分别或同时强化乳酸片球菌和娄地青霉，以探究它们对萨拉米香肠发酵过程中理化指标和挥发性风味物质及感官的影响。
1 材料与方法
1.1 实验原料、菌种与培养基
猪肉、天然猪肠衣、食盐、糖、黑胡椒、大蒜粉、肉豆蔻等原辅料，市售。
乳酸片球菌、娄地青霉分别分离自美国Columbus Secchi的萨拉米香肠和意大利的蓝纹奶酪。
PDA、MRS培养基，武汉市中南化学试剂三厂;环己酮，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。其他化学试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
PTDQ型绞肉机，丹徒区辛丰金汇缘食品机械厂；THMGF350A型灌肠机，佛山市顺德区腾辉电气有限公司；TQ8040型气质联用仪，日本岛津公司；SX811-BS型穿刺式pH计，上海三信仪表厂。
1.3 实验方法
1.3.1 萨拉米香肠的制作
1.3.1.1 强化微生物的制备
将乳酸片球菌接种到MRS液体培养基中，37 ℃静置培养16 h，转接3次后，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，菌体以无菌生理盐水洗涤3次后重悬得到菌悬液，备用。
将娄地青霉接种至PDA斜面上，25 ℃培养4 d后，以无菌水洗脱孢子，经3层无菌纱布过滤后，打散孢子，调整孢子浓度至105 个/mL，备用。
1.3.1.2 工艺流程
原料肉预处理→预斩→绞制→撒料→接种乳酸片球菌→搅拌→灌装→表面接种娄地青霉→高温发酵→低温成熟→成品
1.3.1.3 操作要点及微生物强化
(1)猪肉处理：将猪肉洗净并剔除筋膜和淤血后，将肥肉和瘦肉切成长×宽×厚为10 cm×3 cm×3 cm的条块，肥肉经2 mm孔板切丁，瘦肉以3 mm孔板绞制，按肥瘦比3∶7(g∶g)混匀，得到猪肉预混物。
(2)辅料添加：将辅料按食盐3%、糖0.5%、黑胡椒0.02%、蒜粉0.3%和肉豆蔻0.02%(占猪肉预混物比例)[14]加入猪肉预混物中，混合均匀。
(3)乳酸片球菌强化：将乳酸片球菌菌悬液接种至(2)的物料中，调整乳酸片球菌的浓度至107 CFU/g物料，混匀，得肉馅。
(4)灌肠：将肉馅灌入肠衣(Φ=3 cm)内，1 cm3肠衣内灌肉馅1.5 g，每隔15～20 cm用棉绳结扎，分节。
(5)娄地青霉强化：将(4)中制备的新鲜香肠浸泡于娄地青霉孢子液中5 min，然后沥干至香肠表面无游离水。
(6)发酵：将新鲜香肠置于恒温培养箱内发酵。在相对湿度80%，温度20～22 ℃发酵7 d后，再在相对湿度70%，温度12 ℃继续发酵31 d，总共发酵时间为38 d。
香肠发酵分为自然发酵组(CK)，以及分别强化乳酸片球菌(PL)、娄地青霉(PR)及其复合物(PLR)，共4组萨拉米香肠。
CK：由(1)、(2)、(4)和(6)制得，并加入与(3)中菌悬液同等体积的无菌水；PL：由(1)、(2)、(3)、(4)和(6)制得；PR：由(1)、(2)、(4)、(5)和(6)制得，并加入与(3)中菌悬液同等体积的无菌水；PLR：按(1)～(6)制得。
1.3.2 萨拉米香肠主要理化指标的分析
对香肠整个发酵过程中的第0、2、4、6、8、13、18、23、28、33、38 天的pH值、水分含量、亚硝酸盐含量、酸价进行测定。
1.3.2.1 pH值测定
使用校准后的肉类专用穿刺式pH计插入香肠的两端及中间3个部位，控制pH计插入深度为4～5 cm，使pH计的电极探头充分接触到香肠，待pH计稳定后读数，取3次结果的平均值。
1.3.2.2 水分含量测定
取适量香肠样品置烘干箱中，105 ℃干燥至质量恒定，按公式(1)计算水分含量:
水分含量
(1)
式中：m1，干燥前样品与称量瓶质量，g；m2，干燥后样品与称量瓶质量，g；m3，称量瓶质量，g。
1.3.2.3 亚硝酸盐含量和酸价测定
亚硝酸盐含量测定参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法；酸价测定参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》中的冷溶剂指示剂滴定法。
1.3.3 挥发性风味物质测定
参照王德宝[15]的方法并稍作修改。称取剪碎后的香肠样品2～3 g，置于15 mL顶空瓶中，将老化好的萃取针插入样品瓶并于60 ℃恒温水浴锅中加热平衡30 min后，推出纤维头，使纤维头暴露于样品上部空间，顶空吸附30 min后拔出，萃取头在GC-MS进样口(250 ℃)下解吸附5 min。
GC条件：DB-5石英毛细柱(30 m×320 μm，0.25 μm)，载气He，流速1 mL/min，进样时间1 min；升温程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升温到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升温到200 ℃，最后以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。
MS条件：离子源温度250 ℃，进样口温度250 ℃，质量扫描范围m/z 30-400。
定性定量分析：以Wiley、Nistdemo质谱库进行定性分析，匹配度≥800为鉴定依据，结合解析谱图，确定风味物质。采用内标法进行定量，内标物为环己酮。按公式(2)计算：
挥发性风味物质含量/[μg·(100 g)-1]=
(2)
1.3.4 感官评价
参照SIDIRA等[16]的感官评价方法并稍作修改。将发酵38 d成熟的萨拉米香肠切成3 mm左右的薄片，观察香肠切片的外观、组织状态，品尝香肠的滋味与风味和口感，并进行总体可接受程度评价。评价小组由15名食品专业的学生组成且进行感官评价前未食用刺激性食物。具体评价标准如表1所示。
表1 萨拉米香肠感官评价标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of salami
评价指标评价标准感官评分/分外观与色泽(10分)肠体饱满,色泽均匀,脂肪呈白色,瘦肉呈红色9～10肠体较为饱满,色泽均匀,部分脂肪发黄,瘦肉呈红色6～8肠体松散,色泽不均匀,部分脂肪发黄,瘦肉发暗3～5肠体松散,色泽不均匀,脂肪发黄,瘦肉色灰暗0～2组织状态(10分)切面整齐无裂痕,脂肪分布均匀,组织紧密,坚实有弹性9～10切面较不整齐无裂痕,脂肪分布不均,组织紧密,弹性较好6～8切面整齐无裂痕,脂肪颗粒状明显,组织略有松散,无弹性,边缘松软3～5切面整齐无裂痕,脂肪颗粒堆积,组织松散,无弹性,中心松软0～2风味与滋味(10分)具有明显发酵香味,咸度适宜,无酸味、哈味等不良风味9～10发酵香味较明显,咸味略淡(略浓),不良风味不明显6～8无发酵香味,咸味较淡(较浓),不良风味较明显3～5无发酵香味,很淡(很咸),不良风味很明显0～2
续表1
评价指标评价标准感官评分/分口感(10分)口感细腻,咀嚼性好;干燥度较高、柔软度适中,无颗粒感、油腻感9～10口感细腻,咀嚼性较好;干燥度略高、柔软度适中,无颗粒和油腻感6～8口感细腻和咀嚼性差;干燥度一般、柔软度较好,略有颗粒和油腻感3～5口感粗糙,有颗粒感;干燥度低、柔软度好,略有颗粒感、油腻感0～2总体可接受度(10分)非常喜欢9～10可以接受6～8勉强接受3～5不可接受0～2
1.3.5 数据处理
实验均重复3次，结果表示为平均值±标准差。所有数据均采用 Excel 2010和 SPSS 26.0 软件进行数据统计处理和显著性分析(P<0.05)；采用 Origin 2018 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 萨拉米香肠发酵过程中主要理化指标的变化
2.1.1 pH随发酵时间的变化
pH值对萨拉米香肠的发酵与品质都非常重要，较低的pH值可抑制有害微生物，特别是食源性病原微生物的生长，而且pH值也可影响肉中蛋白质的变性、调节酶的活性，影响产品的黏度、硬度、感官等。由图1可知，在高温发酵阶段(前7 d)，随着发酵时间的延长，萨拉米香肠的pH值均呈现迅速下降趋势。pH值的下降速度PL≥PLR>PR>CK，发酵至第6天时，它们的pH值分别为：(4.75±0.01)、(4.80±0.03)、(4.92±0.03)、(5.23±0.01)；而在低温成熟阶段(7～38 d)，pH值均缓慢上升，发酵结束时(38 d)，pH值分别为：(5.20±0.01)、(5.32±0.03)、(5.39±0.02)、(5.39±0.03)。在高温干燥阶段，微生物尤其是乳酸菌迅速繁殖产生乳酸等有机酸使香肠pH 快速下降，强化微生物的香肠因可产生更多有机酸而使pH值下降速度更快[17]。在强化PR和PLR的香肠中，pH值的下降(高温发酵阶段)和上升(低温成熟阶段)均较强化PL的慢，可能是因为PR在产生有机酸的同时也可分解蛋白质，产生对pH具有缓冲能力的氨基酸[18]。
在整个发酵阶段，强化微生物萨拉米香肠的pH值始终低于CK，较低的pH可以抑制有害微生物的生长，更好地保证萨拉米香肠的品质。
图1 萨拉米香肠发酵过程中pH值变化
Fig.1 Changes in pH values of salami sausage during fermentation
2.1.2 水分含量随发酵时间的变化
香肠中水分的含量对其安全性与贮藏均有重要影响。由图2可知，在整个发酵过程中，4组萨拉米香肠的水分含量均呈现下降，在第0～18天，强化微生物的萨拉米香肠的水分含量均略高于CK，这与李权威[19]的研究结果一致。可能因为强化微生物后，产生更多水溶性物质，从而将水分“锁住”，但在第23～38天，4组萨拉米香肠水分含量逐渐稳定并趋于一致，发酵结束时(38 d)水分含量均约为9%，符合世贸组织对萨拉米香肠产品水分含量的要求[G/TBT/N/KEN/1018 Fermented sausages (salami)—Specification]。
图2 萨拉米香肠发酵过程中水分含量变化
Fig.2 Changes in water contents of salami sausage during fermentation
2.1.3 亚硝酸盐含量随发酵时间的变化
发酵过程中肉类物料中的硝酸盐可还原为亚硝酸盐，可改善香肠的色泽，提高香肠的感官品质，但过量的亚硝酸盐会给人体健康带来危害。由图3可知，在发酵过程中，亚硝酸盐含量呈现先上升后下降的趋势，其中发酵的前2 d，亚硝酸盐的含量快速上升，随后缓慢上升或下降。CK的亚硝酸盐含量在0～6 d逐渐上升，之后缓慢下降，而微生物强化组从第2天后亚硝酸盐含量均开始下降，发酵结束时其亚硝酸盐含量远低于CK(P<0.05)。可能是在较低pH条件下(图1)，亚硝酸盐更容易进一步转化为亚硝基，并与香肠中的其他物质结合，或PL和PR产生的相关酶使亚硝酸盐转化为N2，从而使产品中的最终亚硝酸盐含量降低[20]。尽管发酵结束时CK中亚硝酸盐含量(8.74 mg/kg)远大于强化组，但各组亚硝酸盐含量都低于国家标准30 mg/kg(GB 2760—2014 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》)。
图3 萨拉米香肠发酵过程中亚硝酸盐含量变化
Fig.3 Changes in nitrite content of salami sausage during fermentation
2.1.4 酸价随发酵时间的变化
酸价显示了香肠中游离脂肪酸的含量，其高低是衡量脂肪氧化程度的重要指标之一，脂肪过度氧化产生的“哈”味会影响香肠等肉类发酵产品的可接受度。由图4可知，萨拉米香肠的酸价在整过发酵过程中均呈现不断上升的趋势，但强化微生物组的酸价始终低于CK组，且成熟时的酸价显著低于CK(P<0.05)。这一方面可能是PL和PR产生的过氧化氢酶，阻碍了O2向香肠内部的渗透，从而减缓了脂肪氧化；另一方面，也可能是PL和PR产生的水溶性物质包裹了脂肪粒，更好地阻止了O2与脂肪接触，从而减缓了香肠中脂肪的氧化[21]。
图4 萨拉米香肠发酵过程中酸价变化
Fig.4 Changes in acid values of salami sausage during fermentation
2.2 挥发性风味成分比较分析
挥发性风味化合物对发酵香肠的发酵香味有着重要贡献。采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用分析了发酵结束时萨拉米香肠中挥发性成分，相应分析结果见电子版增强出版附件(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031260)。
附件表中的结果显示，强化微生物后对萨拉米香肠的挥发性风味成分有明显影响。相比于CK，强化微生物后，萨拉米香肠中的醛类、酸类、醇类、酯类与烃类挥发性风味成分的种类和含量均有所增加。尤其是己醛、庚醛、D-柠檬烯、3-蒈烯等对风味产生积极作用的物质含量增加；但2, 6-二叔丁基对甲酚、4, 6-二甲基-十二烷、3, 7-二甲基癸烷、十七烷等产生刺激性不愉快气味或对风味贡献较小的成分[22]，在微生物强化的萨拉米香肠中的含量减少甚至消失。
进一步对附件表中的数据分析可知，烃类化合物是萨拉米香肠的主要挥发性风味物质，在强化微生物的萨拉米香肠中，庚烷、2, 4-二甲基-庚烷、十四烷、邻异丙基甲苯、水芹烯、3-蒈烯、D-柠檬烯、石竹烯等烃类化合物的含量显著高于CK(P<0.05)；而在酮类风味成分中，具有非常低的感官阈值，也是干腌肉制品中的典型风味的乙偶姻的含量也显著高于CK(P<0.05)。强化微生物后，还产生了CK中没有的乙酸异戊酯、己酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、己酸乙烯酯等酯类成分，它们可掩盖发酵香肠中的腐臭味，与香肠的发酵风味紧密相关[23]。另外，强化微生物后，2, 3-丁二醇、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇等发酵香肠中常见的醇类物质的含量均有所上升；己醛，作为肉制品中的典型香气，被认为是发酵腌制产品中必不可少是一种脂肪醛[24]，强化PL、PR、PLR后，其含量也有明显上升(P<0.05)。此外，微生物强化发酵后，萨拉米香肠中还含有较高的3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、L-乳酸、辛酸等具有特殊风味的酸类物质。总之，强化PL、PR或PLR后，萨拉米的挥发性风味成分得到了极大的改良和提高。
2.3 成熟萨拉米香肠的感官评价
感官评价是根据香肠的外观色泽、质构及风味和滋味等特征直观地对香肠进行评价，从而判断其品质的一项重要指标。发酵结束时，萨拉米香肠的感官雷达图如图5所示，4组香肠在外观和组织状态方面无显著差异(P>0.05)，相较于CK，强化微生物后萨拉米香肠的滋味与风味、口感和总体可接受度提升较为明显，这与前述风味成分的分析结果相吻合。可能的原因是强化的微生物促进了萨拉米香肠发酵过程中，蛋白质、脂肪等的分解，增加了香肠中挥发性风味物质的含量，从而使香肠具有更加明显的特征与口感。
图5 萨拉米香肠感官分析
Fig.5 Sensory analysis of salami sausage
3 结论
本研究的实验结果表明，分别或同时强化PL和PR制得的萨拉米香肠，在感官与风味等方面均优于自然发酵萨拉米香肠(CK)，且同时强化PL和PR的效果最佳。强化微生物后，香肠的亚硝酸盐含量、酸价均显著低于CK组(P<0.05)，产生的乙酸异戊酯、己酸异戊酯、乙酸己酯等风味物质更多，香肠发酵香味更好，香肠的安全性和可食用性得到了提高。研究结果对我国发酵香肠等肉制品的研发提供了参考。
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