1979年ENDO等[1]在红曲霉发酵液中发现了一种能特异性地抑制胆固醇合成的物质，该物质与土曲霉(Aspergillus terreus)产的洛伐他汀(Lovastatin) 为同一物质，将其命名为莫纳可林K(Monacolin K，MK)，是目前临床上被广泛应用的降胆固醇药物之一[2-3]。目前，功能红曲MK的生产均采用传统的三角瓶固态发酵，鉴于固态发酵存在诸多弊端，现阶段主要进行液态发酵的研究。由于红曲菌产MK的代谢机制尚未明晰，故只能借鉴土曲霉中MK合成的途径及酶系的鉴定和表征[4]。
甘油作为常用碳源之一，对红曲菌生长和代谢起着重要作用，且不会产生碳代谢物的阻遏效应[5]。目前采用甘油作碳源的液态发酵产MK，在摇瓶和15 L小型发酵罐中进行的试验已取得成功[6]，但甘油作为发酵原料，既不符合GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，也不符合QB/T 2847—2007《功能性红曲米(粉)》，无法量产，而采用纯谷物淀粉为碳源的液态发酵，MK产量不足100 mg/L，产量低，成本高，亦无法量产。目前将表面活性剂作为发酵促进剂的研究越来越多，主要应用在以发酵法生产酶制剂[7]、氨基酸[8]、新材料[9-10]等工业领域，但上述研究均以传统的表面活性剂为主，新型的表面活性剂的应用研究不多[11]。近年来的研究表明，在液态发酵过程中加入非离子表面活性剂，通过萃取发酵的模式可以提高次级代谢产物的产量，并且不同的非离子型表面活性剂对细胞的生长与代谢机制不同[12-15]。然而， CHEN等[16]发现，聚乙二醇PEG-4000作为萃取剂，在发酵过程中并没有明显的效果。为此本文拟研究聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)对紫色红曲菌TY02发酵过程中MK产量的影响，探讨PEG对紫色红曲菌TY02的代谢调控机理，以期对符合标准且可利用谷物淀粉作为碳源的原料进行发酵，能大幅提高红曲菌代谢的MK产量，降低成本，从而为实现功能红曲液态发酵的量产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌株
紫色红曲菌(Monascus purpureus)TY02，广东天益生物科技有限公司保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2018586。
1.1.2 实验仪器
HWY-2112型双层恒温培养摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；LC-20AD高效液相色谱仪、SPD-20A紫外分光检测器，日本岛津仪器有限公司；SW-CJ-1FD型超净化工作台，苏州净化器设备有限公司；LS-B50L型立式蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂；LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂；DHG-9140A型鼓风干燥箱、HWS-28型电热恒温水浴锅、LRH-150型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；B2200S型超声波清洗器，必能信超声(上海)有限公司；MP502B型电子天平，上海精密实验器材有限公司。
1.2 培养基
斜面培养基：12°Bx麦芽汁培养基。
种子培养基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨25，玉米浆10，NaNO3 2，MgSO4·7H2O 1，K2HPO4·3H2O 1.5，pH值自然。
发酵培养基(g/L)：黏米粉80，大豆水解液45，玉米浆5，NaNO3 5，MgSO4·7H2O 1.25，K2HPO4·3H2O 2.5，pH 4.5。
上述培养基均121 ℃灭菌30 min。
1.3 培养条件及方法
斜面培养：挑取1环菌种接种于斜面培养基中，在30 ℃培养箱中培养至菌丝长满斜面。
种子液培养：用10 mL无菌水洗涤试管斜面孢子，接种至100 mL种子液培养基的500 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min的旋转摇床上培养48 h。
液体摇瓶发酵培养：将种子液按10%(体积分数)接种量接种于装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min的旋转摇床上培养3 d，然后于25 ℃发酵至第22天。
1.4 主因素效应实验设计
选取对MK代谢影响较大的黏米粉、PEG-2000、大豆水解液、玉米浆、MgSO4·7H2O、NaNO3、K2HPO4·3H2O作为Plackett-Burman设计的7个因素，每个因素取2个水平，高水平为低水平的1.5倍，实验设计见表1。
表1 Plackett-Burman设计试验各因素及其水平取值
Table 1 Levels of factors for Plackett-Burman design
代码因素高水平(+1)低水平(-1)X1黏米粉/(g·L-1)9060X2PEG-2000/(g·L-1)128X3大豆水解液/(g·L-1)52.535X4玉米浆/(g·L-1)64X5MgSO4·7H2O/(g·L-1)1.51X6NaNO3/(g·L-1)64X7K2HPO4·3H2O/(g·L-1)32
1.5 发酵液的预处理
固液分离：发酵液经抽真空过滤，分离得菌体和滤液，菌体再经蒸馏水洗涤2～3次，再过滤得菌体，并收集滤液。首次分离得到的滤液与洗涤所得的滤液汇总，用于后续实验，并统计加入的蒸馏水数量，以便确定体积的换算系数。菌体经低温干燥及粉碎得固态产品。
PEG的去除：在固液分离得到的滤液中，分别加入0.005 mol/L K4[Fe(CN)6]溶液使终质量浓度为0.01 g/L(此为初始培养基中PEG为5 g/L时的用量，其余浓度PEG的溶液添加量可依此类推)，0.01 mol/L NaCl 0.4 g/L，搅拌均匀，静置沉淀10 min，抽真空过滤，分离后取滤液、弃渣。
过量K4[Fe(CN)6]的去除：在上述滤液中，加入0.005 mol/L ZnSO4溶液使终质量浓度为0.05 g/L(此为初始培养基中PEG为5 g/L时的用量，其余浓度PEG的溶液添加量可依此类推)，搅拌均匀，静置沉淀10 min，抽真空过滤，分离后取滤液、弃渣，备用。
1.6 分析方法
菌体量的测定：菌体量采用干重法测定，用3层纱布过滤发酵液，蒸馏水洗涤2～3次，拧干，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，生物量按公式(1)计算[17]：
生物量
(1)
发酵液的预处理：称取发酵液5 g，加入35 mL 75%分析纯乙醇，超声波萃取50 min，然后再加入适量的75%分析纯乙醇，再超声波萃取10 min，冷却后定容至50 mL，3 500 r/min离心10 min，然后用0.45 μm的有机微孔滤膜过滤，滤液用于测定MK，测定的MK为总MK。胞外MK的测定以发酵醪液经过滤后的滤液为样品，样品预处理方法和测定方法与总MK测定相同。
色谱条件：色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm)；柱温：20～25 ℃；紫外检测器SPD-20A：检测波长238 nm；流动相：V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=385∶115∶0.14；流速1.0 mL/min；进料量20 μL。
MK参照QB/T 2847—2007《功能性红曲米(粉)》中的方法测定；PEG参照文献[18]的方法测定；K4[Fe(CN)6]参照GB/T 13025.10—2003中的方法测定。
2 结果与分析
2.1 PEG分子质量对紫色红曲菌TY02生长和 MK代谢的影响
在发酵初始时(0 d)分别添加0.5 g/L PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000进行培养，菌体生物量、MK的质量浓度与PEG分子质量的关系如图1所示。
图1 PEG的分子质量对紫色红曲菌TY02生长和 MK代谢的影响
Fig.1 Effect of molecular weight of PEG on the growth and MK metabolism of Monascus purpureus TY02
由图1可知，随着添加PEG分子质量的增加，紫色红曲菌TY02的生长与代谢均呈递增趋势，体现在菌体生物量与产MK均呈正增长，至分子质量达到2 kDa时，菌体生物量与产MK均达极值，此时生物量为46.70 g/L，MK产量为469 mg/L，分别为对照生物量(32.28 g/L)的1.45倍和MK产量(63 mg/L)的7.44倍，此后，随着分子质量的进一步提高，生物量与MK会逐步下降，说明分子质量过大会抑制菌体的生长和MK的分泌。
2.2 PEG-2000浓度对TY02的MK代谢影响
在发酵初始时(0 d)分别添加0、0.5、1、5、10、15、20 g/L的PEG-2000进行培养，MK的产量与发酵时间的关系如图2所示。
图2 PEG-2000含量对紫色红曲菌TY02的MK代谢影响
Fig.2 Effect of PEG-2000 concentration on the MK metabolism of M.purpureus TY02
由图2可知，在发酵初始时(0 d)加入不同含量的PEG-2000，紫色红曲菌TY02的MK产量均呈正增长，对产MK的影响顺序为10>15>5>20>1>0.5>0 g/L，其中添加10 g/L PEG-2000时MK产量最高达845 mg/L，为对照(81 mg/L)的10.43倍，在发酵8～16 d，MK产率最高，18 d为拐点，此后，产MK趋向平稳，发酵周期为20～22 d。
2.3 PEG-2000添加时间节点对TY02生长和MK代谢的影响
在发酵0、2、4、6、8、10、12 d分别添加PEG-2000 10 g/L进行培养，菌体生物量、MK产量与PEG-2000添加时间的关系如图3所示。
图3 PEG-2000添加时间节点对紫色红曲菌TY02生长和MK代谢的影响
Fig.3 Effect of PEG-2000 addition time on the growth and MK metabolism of M. purpureus TY02
由图3可知，在不同发酵节点添加PEG-2000，紫色红曲菌TY02的细胞生长与MK代谢受到不同程度的影响。与对照相比，分别在0、2、4、6、8、10、12 d添加，菌体生物量均增加，MK的产量均得到提高，在0 d时添加PEG-2000时，生物量和MK产量达到最大值，此时生物量为60.62 g/L，MK产量为845 mg/L，分别比对照增加了81.44%和943.21%，故得到PEG-2000最佳的添加时间节点为发酵初始时(0 d)。
2.4 PEG-2000对紫色红曲菌TY02总MK、胞外MK产量以及胞外MK占比的影响
在发酵初始时(0 d)添加10 g/L PEG-2000进行培养，MK的质量浓度、胞外MK占比与发酵时间的关系如图4所示。
由图4可知，紫色红曲菌TY02在发酵初始时(0 d)添加0、10 g/L的PEG-2000，其MK代谢的总MK与胞外MK的变化趋势基本一致，发酵22 d，其产总MK、胞外MK分别为81、34、845、682 mg/L，后者产总MK、胞外MK分别为前者的10.43、20.06倍；胞外MK占比的代谢趋势，前者与后者亦基本上一致，发酵22 d，分别为41.98%、80.71%，后者为前者的1.92倍。可见发酵初始时(0 d)添加10 g/L PEG-2000能大幅提高紫色红曲菌TY02的MK产量和胞外MK的占比，这与谭海玲[19]研究的红曲霉产黄色素的发酵类似。
图4 PEG-2000对紫色红曲菌TY02总MK、胞外MK产量以及胞外MK占比的影响
Fig.4 Effect of PEG-2000 on the concentration of total MK, extracellular MK and the proportion of extracellular MK in MK metabolism of M.purpureus TY02
2.5 紫色红曲菌TY02发酵过程
在发酵开始时(0 d)添加10 g/L PEG-2000进行培养，MK的质量浓度、pH值、菌丝体生物量与发酵时间的关系如图5所示，整个发酵过程，pH先上升，最高至6.91，然后略有下降，至6.6左右时渐趋平稳；当pH<6.0时紫色红曲菌TY02主要处于生长期，pH>6.0时则处于MK合成代谢期；当发酵至8 d，菌体合成MK开始加速，10～16 d为MK合成代谢的高峰期，18 d为合成MK的拐点，此后渐趋平稳，第22天时MK达最高值(845 mg/L)。
图5 MK的质量浓度、pH值、菌体生物量与发酵时间的关系
Fig.5 Relationship between MK mass concentration, pH,cell biomass and fermentation time
由图5可知，发酵至第6天，菌体生物量达最大值(54.49 g/L)，此后生物量逐渐下降，下降至52.17 g/L时，即发酵8 d，MK合成开始加速；生物量处于49.09～45.23 g/L(发酵10～16 d)，为MK合成的旺盛期；当生物量降至42.24 g/L(发酵18 d)，MK合成出现拐点；当生物量降至38.52 g/L(发酵22 d)，紫色红曲菌TY02产MK达最大值(845 mg/L)，从生物量与MK合成的关系可知，功能红曲液态发酵为典型的次级代谢，这与童振宇等[20]的研究结果相符合。
2.6 影响MK代谢重要因素的确定[21]
按Plackett-Burman实验设计共进行12个实验，用Minitab17软件对所得到的实验数据进行分析，实验设计结果及因素效应分析见表2和表3。
表2 Plackett-Burman实验设计及结果
Table 2 The Plackett-Burman design matrix and experimental results
试验序号X1X2X3X4X5X6X7MK/(mg·L-1)1-1-1-1+1+1+1-15362+1+1-1+1-1-1-16013+1-1-1-1+1+1+15234+1-1+1+1-1+1-14575-1-1+1+1+1-1+13986+1+1-1+1+1-1+17267+1-1+1-1-1-1+12858+1+1+1-1+1+1-17819-1-1-1-1-1-1-135210-1+1-1-1-1+1+166411-1+1+1-1+1-1-153912-1+1+1+1-1+1+1640
表3 因素主效应分析
Table 3 Analysis sheet of major factor
来源自由度调整平方和调整均方F值P值显著性回归模型7241 78834 54118.000.007∗∗黏米粉14 9614 9612.590.183PEG-20001163 333163 33385.140.001∗∗大豆水解液17 6007 6003.960.117玉米浆13 8163 8161.990.231MgSO4·7H2O121 16821 16811.030.029∗NaNO3140 83340 83321.280.010∗K2HPO4·3H2O175750.040.853误差47 6741 919合计11249 462
注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)
通过Minitab17对实验结果进行统计分析，拟合一次回归方程为：
Y=-596+1.356X1+58.33X2-2.88X3+17.8X4+168X5+58.33X6-5.0X7
(2)
其中响应值Y为MK的质量浓度，模型汇总R-sq为96.92%，这表明，通过一次模型方程得到的响应值的可信度达到96.92%，同时模型也极显著(P=0.007<0.01)，说明响应值与变量之间存在极显著的线性关系。从表3可知，MgSO4·7H2O、NaNO3、PEG-2000的P值分别为0.029、0.010、0.001，影响程度分别为显著、显著、极显著。在本文的研究范围内，上述3个因子对MK代谢影响最大，为主效因子，其中PEG-2000的影响达到极显著。
2.7 发酵液的预处理效果
在发酵初始时(0 d)分别添加0.5、1、5、10、15、20 g/L的PEG-2000进行培养，然后按照1.5的方法进行发酵液的预处理，发酵液中PEG残留浓度及预处理检测结果见表4。
表4 发酵液预处理后的检测结果
Table 4 Detection results after pretreatment of fermentation broth
培养基PEG/(g·L-1)发酵液滤液PEG/(g·L-1)发酵液滤液PEG残留率/%预处理后滤液PEG/(mg·L-1)发酵液滤液MK/(mg·L-1)预处理后滤液MK/(mg·L-1)预处理后滤液K4[Fe(CN)6]/(mg·L-1)0.50.44±0.0187.33±0.498.14±1.60286.01±3.18298.04±4.792.54±0.0410.89±0.0288.67±0.5510.35±0.83391.30±1.67413.99±3.621.91±0.0354.53±0.0290.53±0.4115.12±1.19497.92±2.45520.74±3.342.42±0.09109.26±0.0392.57±0.3314.04±1.75678.96±1.55712.20±2.774.03±0.101513.99±0.0993.26±0.7111.30±1.49575.10±4.20604.85±5.653.73±0.212019.04±0.1895.25±0.9313.32±1.97452.94±2.96475.70±4.002.83±0.23
从表4可知，非离子表面活性剂PEG在发酵结束后的发酵液中的残留率为87.33%～95.25%，并随着PEG添加量的增加而逐步上升。添加K4[Fe(CN)6]沉淀PEG，分离后得滤液，滤液中过量的K4[Fe(CN)6]再添加ZnSO4进行沉淀，再次分离得滤液，测定滤液中PEG的残留量为8.14～15.12 mg/L，符合GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，测定预处理后的滤液中K4[Fe(CN)6]的残留量为1.91～4.03 mg/L，也符合上述标准的要求。同时预处理后的滤液中的MK较处理前提高了4.21%～5.80%，说明预处理过程没有对MK造成损失，反而提高了滤液的纯度。
3 结论
实验结果表明，PEG对紫色红曲菌TY02液态发酵产MK有重要的影响。分子质量为2 000 Da、浓度为10 g/L的聚乙二醇对紫色红曲菌TY02的MK代谢影响最大。在发酵初始时(0 d)分别添加0、10 g/L的PEG-2000，紫色红曲菌TY02产MK、胞外MK占比分别为81 mg/L、41.98%和845 mg/L、80.71%，添加10 g/L PEG-2000组的产MK、胞外MK占比为对照组的10.43倍、1.92倍。在Plackett-Burman实验设计筛选重要影响因子的实验中，筛选出的主效因子分别为MgSO4·7H2O、NaNO3、PEG-2000，其P值分别为0.029、0.010、0.001，为重要的影响因子，且均为正效应，其中PEG-2000对紫色红曲菌TY02的MK代谢影响极显著。采用Minitab17拟合的一次模型方程得到的响应值可信度达到96.92%。PEG-2000作发酵原料虽符合标准，但因红曲菌利用PEG较难，且产品中残留过高含量的PEG亦不利于保健食品的生产。为此，对发酵液进行了预处理，预处理后滤液的相关指标检测结果符合标准。综上，PEG可大幅提高紫色红曲菌TY02胞外MK的代谢占比，部分解除了胞内代谢物的反馈抑制，从而大幅提高MK代谢能力，突破了无甘油液态发酵功能红曲低产MK而无法量产的技术瓶颈。研究结果可为非甘油原料的液态发酵功能红曲的量产提供技术参考，鉴于PEG能够明显促进红曲菌MK的代谢合成，因此，从基因表达和代谢调控途径上研究PEG促进MK代谢的机理具有现实意义。
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