葡萄酒是新鲜葡萄或葡萄汁经发酵后获得的酒精饮料。发酵过程中，酵母菌可以将葡萄浆果中的糖分解为乙醇、CO2和其他副产物。商业酿酒酵母由于发酵过程易于控制，产品同质性好，在葡萄酒生产中得到了广泛的应用，但同时导致葡萄酒缺乏典型特征和复杂多样的风格[1]。而一些天然存在于葡萄中的非酿酒酵母,如伊萨酵母属、毕赤酵母属、葡萄汁有孢汉逊酵母属和德巴利酵母属等，与酿酒酵母同时参与到葡萄酒的酒精发酵过程中，能够促进葡萄酒中酯类、醇类等挥发性香气成分的生成[2-3]，对葡萄酒的色、香、味及产品风格的形成起到至关重要的作用[4]。PRIOR等[5]将Pichia kluyveri和Saccharomyces cerevisiae混合接种发酵，葡萄酒中高级醇和乙基酯的含量显著提高；LIU[6]等将Torulaspora delbrueckii和Schizosaccharomyces pombe与S. cerevisiae混合发酵所得葡萄酒品质得以改善。不同酵母株对葡萄酒香气影响存在差异，在酿酒时需要根据原料和产地选择合适的酿酒酵母和非酿酒酵母组合[7]。且研究发现，接种比例对于混合酿造工艺的优化起到重要作用[1,8-9]。
河北昌黎是中国干红葡萄酒的摇篮，是“中国干红葡萄酒之乡” “中国酿酒葡萄之乡”和“中国干红葡萄酒城”。但近年来，昌黎产区葡萄酒产业缺乏本土特色，产品趋于大众化，急需研究与原料相匹配的酿造工艺，开发出具有特色的新产品，以满足广大消费者对于葡萄酒的不同需求。本研究以河北昌黎产区“赤霞珠”葡萄为原料，利用东方伊萨酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母等2种非酿酒酵母与国产安琪酿酒酵母分别按照不同比例进行混菌发酵试验，研究葡萄酒品质差异，探究适合的混菌发酵工艺，为国产酵母的应用开辟新的思路，充分发掘昌黎产区“赤霞珠”葡萄酒所特有的产品特色。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葡萄原料：赤霞珠，于2021年10月27日采自河北昌黎产区，总糖含量(以还原糖计)为 195 g/L，可滴定酸含量(以酒石酸计)为6.86 g/L， pH为3.62，卫生状况良好。
酵母菌株：东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)为河北科技大学饮料酒酿造研究室于 2008年、2009年和2010年分别从河北省昌黎和沙城2个葡萄酒产区的葡萄园土壤、葡萄果表，以及赤霞珠葡萄和龙眼葡萄的自然发酵过程中分离、纯化，并保藏的自选酵母菌。安琪酵母(Angel Saccharomyces cerevisiae)购于安琪酵母股份有限公司。
试剂：葡萄糖、NaOH、NaCl、重亚硫酸钾(分析纯)，天津市永大化学试剂有限公司；3-辛醇、乙醇、苯乙酮、苯甲醇、乙酸异戊酯(均为色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；果胶酶，烟台帝伯仕自酿机有限公司；斐林试剂、次甲基蓝指示剂、酚酞指示剂等按照GB/T 603—2002进行配制。
1.2 仪器与设备
7820-5975型GC-MS联用仪，美国安捷伦公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、萃取手柄，美国Supelco公司；T09-1S恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；DHP-520电热恒温培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；UV5100型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；雷磁pHS-3C型pH计，上海仪电仪器股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 实验处理
对照组：只接种单一安琪酿酒酵母(A)；只接种单一东方伊萨酵母(I)；只接种单一葡萄汁有孢汉逊酵母(H)。
东方伊萨酵母与安琪酿酒酵母混菌发酵组：东方伊萨酵母与安琪酿酒酵母3∶1(体积比，下同)同时接种发酵(IA1)；东方伊萨酵母与安琪酿酒酵母1∶1同时接种发酵(IA2)；东方伊萨酵母与安琪酿酒酵母1∶3同时接种发酵(IA3)。
葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酿酒酵母混菌发酵组：葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酿酒酵母3∶1同时接种发酵(HA1)；葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酿酒酵母1∶1同时接种发酵(HA2)；葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酿酒酵母1∶3同时接种发酵(HA3)。
酵母的总接种量为 1×106 CFU/mL；同时接种指同时加入非酿酒酵母与酿酒酵母进行酒精发酵。
1.3.2 葡萄酒酿造工艺
葡萄采收后经除梗、破碎、混匀后转入彻底灭菌的10 L玻璃发酵罐，酒样中加入偏重亚硫酸钾50 mg/L、果胶酶 30 mg/L，静置过夜，分别接种1.3.1中所述混合酵母，发酵温度为25～27 ℃。酒精发酵结束后(残糖<4 g/L)浸渍24 h，分离得到发酵原酒。之后，采用控温启动自然发酵的方式进行苹果酸-乳酸发酵，结束后加入 50 mg/L SO2终止发酵并满罐密封贮存，静置 1 个月，分离沉淀并装瓶于恒温地下酒窖瓶储，陈酿 3 个月后对各发酵组取样进行理化指标分析、挥发性香气成分测定、香气感官评价。
1.3.3 理化指标检测
葡萄和葡萄酒中总糖、酒精度等理化指标的测定参考 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
1.3.4 挥发性成分测定萃取
使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对葡萄酒香气成分进行检测，参考毛建利等[10]的方法，略作改动。
前处理：称取2 g NaCl，准确移取5 mL酒样，0.5 mL质量浓度为0.3 g/L的内标物3-辛醇，依次放入20 mL顶空瓶中；磁力搅拌器转速1 000 r/min，50 ℃水浴平衡15 min，萃取吸附30 min，进样口250 ℃解吸3 min。
色谱条件：Agilent J&W HP-INNOWAX 色谱柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm)；载气He(99.999%)，流速1.0 mL/min；升温程序：40 ℃保持12 min，以10 ℃/min的速率升至120 ℃保持12 min，再以3 ℃/min升至250 ℃保持5 min；进样口温度250 ℃。MS条件：离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子电离源，电子能量70 eV；质量扫描范围45～550 u。
挥发性物质的定性：提取挥发性成分质谱图，通过NIST质谱数据库进行，并根据C8-C20烷烃混合标准品的保留时间，用保留指数(retention index，RI)法对挥发性物质进行定性。
挥发性物质的定量[11]：选用内标半定量法，通过内标物的峰面积与样品中各组分的峰面积比值，计算各化合物的相对浓度，按照公式(1)计算：
(1)
式中：c1，待测化合物的质量浓度，μg/mL；f，相对校正因子，f=1；A1，待测化合物的峰面积；A0，内标物(3-辛醇)的峰面积；c0，加入内标(3-辛醇)的质量浓度，μg/mL；V0，加入内标(3-辛醇)的体积，mL；V1，萃取的5 mL稀释酒样的体积，mL。
1.3.5 香气活性值计算及气味特征分类
香气活性值(odour activity value，OAV)由物质含量除以其嗅觉阈值得到。葡萄酒中香气物质按照其气味特征可分为9组，分别为：果香、花香、植物味、坚果香、焦糖味、土腥味、化学味、脂肪味、烘烤味[1]，对所有OAV>0.1的香气物质进行分组，各组物质OAV的总和表示葡萄酒中该类香气的轮廓特征。
1.3.6 葡萄酒感官评价
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》。由经过葡萄酒专业品评培训的10名工作者组成评定小组，对产品的外观、香气、滋味、典型性进行综合评分，其中，外观满分20分，香气满分30分，滋味满分40分，典型性10分，总分100分。去掉1个最高分和1个最低分，然后取平均值即为产品感官品评得分。
1.3.7 数据统计分析
所有样品均分别平行测定3次取平均值。实验数据通过Excel 2019、SPSS 17.0、Origin 2018进行汇总与统计分析。
2 结果与分析
2.1 发酵过程分析
在葡萄酒发酵过程中，发酵体系中的糖一部分转化为酵母菌自身代谢所需的能量，另一部分转化为酒精和CO2。通过监测发酵过程中糖分、酒精和CO2排放量可验证酵母发酵能力[12]。
由图1可知，9组样品在接种120 h后完成发酵。发酵反应趋势基本一致，但反应速率存在一定差异。样品A在反应初期反应速率逐步提高，在48～72 h时达到最大值。与之相比，I、IA1、IA2、IA3在24～48 h内糖分下降最快，同时迅速生成乙醇和CO2，CO2生成速度在48～72 h达到最大值；H、HA1、HA2、HA3在0～24 h内糖分下降最快，却在24～72 h迅速生成酒精和CO2。与安琪酿酒酵母相比，东方伊萨酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母在发酵早期迅速生长繁殖，使得发酵过程提前启动，但葡萄汁有孢汉逊酵母适应期较长，需要消耗大量的还原糖提供代谢所需能量，东方伊萨酵母能够更迅速地将还原糖转化为酒精和CO2。
a-还原糖含量;b-每24 h样品中还原糖含量的减少量;c-酒精度;d-每24 h样品中酒精度的增加; e-CO2排放量;f-每24 h样品中CO2排放量的增加量
图1 发酵过程曲线
Fig.1 Fermentation process curve
2.2 香气成分分析
葡萄酒香气由品种香气、发酵香气和陈酿香气组成[13]。所使用的酵母类型和接种比例不同，使得葡萄酒产生的挥发性化合物在组成和含量上产生很大差异[14-15]。
对赤霞珠葡萄汁(SC)组及实验组样品进行香气成分分析，结果详见电子增强出版附表(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032629)，并结合图2进行分析。酒样中共检测出挥发性香气成分117种，其中品种香气成分9种，包括萜烯类4种、降异戊二烯衍生物类3种、挥发性酚类1种、C6化合物1种。发酵香气成分中，含酯类 36种、高级醇18种、酸类8种、醛类8种、酮类8种、酚类和烯炔类4种、其它化合物24种。如图2所示，酒样中高级醇含量较为突出，其次是酯类和酸类，使得产品呈现复杂的香气。在样品A中检出32种挥发性化合物，总含量为39.44 mg/L，IA3中检出种类最多为55种，总含量为48.87 mg/L，IA1检出48种，总含量为66.48 mg/L，为最高值，比A增加了40.67%。东方伊萨酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母参与发酵过程，使得样品中挥发性香气成分种类和含量得到不同程度的提高，并且非酿酒酵母比例越高，提高越显著。
2.2.1 品种香气成分组分比较
混合发酵体系的高糖苷酶活性有利于增加葡萄酒的品种香气组分和香气复杂度。其中，葡萄汁有孢汉逊酵母在发酵环境中具有最高的β-葡萄糖苷酶活性，促使糖苷结合态香气物质(如单萜烯、降异戊二烯和芳香族化合物)在糖苷酶作用下被释放，具有了挥发性。由附表可知， HA1样品中品种香气成分为5种，含量为1.58 mg/L，证明了葡萄汁有孢汉逊酵母具有增加品种香的优势。IA3样品中品种香气成分种类达6种，含量为1.52 mg/L，仅次于HA1，说明东方伊萨酵母同样具有增加品种香的性能。
2.2.2 酯类组分比较
酯类化合物是葡萄酒乙醇发酵的典型副产物，主要形成于发酵和陈酿过程，大多数酯类物质具有鲜花或水果的香气[16]。本研究中的发酵酒样酯类成分最高为19种，相比酿酒酵母单独发酵，非酿酒酵母参与发酵可显著促进酯类成分的复杂性[17]。发酵酒样HA2中含量最多，为10.54 mg/L，比A样品增加了30.77%，占其全部香气成分的20.65%。证明葡萄汁有孢汉逊酵母可以显著增加葡萄酒内酯类物质的含量。另外，根据实验结果发现，东方伊萨酵母参与发酵同样能够提高酯类的含量和种类。
酒样中共有且含量较高的酯类成分是乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯。与样品A相比，IA3的乙酸乙酯含量增加27.51%，IA2的辛酸乙酯含量增加34.93%，IA2的癸酸乙酯含量增加200.83%。在酒样中还有乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯等共有的酯类。乙酸异戊酯具有较强的新鲜果香，可赋予葡萄酒香蕉、梨、苹果的酸甜味。乙酸苯乙酯是一种特殊的芳香化合物，当含量超过 0.25 mg/L 时，能够给葡萄酒增添玫瑰等花香[16]。由附表可知葡萄汁有孢汉逊酵母能够显著增加葡萄酒中的乙酸异戊酯与乙酸苯乙酯的含量，与前人研究结果一致[18-19]。
2.2.3 高级醇组分比较
醇类物质主要是酵母酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物，是葡萄酒发酵香气的重要成分。含量低于 300 mg/L 时，醇类能使葡萄酒的香气更为复杂、浓郁；但当其总含量超过 400 mg/L 时，就会给人带来强烈的刺鼻味和不悦感[16]。由实验结果可知，发酵酒样醇类总含量为16.05～47.54 mg/L，低于300 mg/L，能够赋予酒样丰富的香味。样品IA1中醇类种类与含量均为最高值，含量与A样品相比增加了93.96%，占其全部香气成分的71.51%。
在酒样中共有的含量最为突出的醇类物质为苯乙醇，含量达15.65～42.55 mg/L，是各酒样中最为典型的醇类成分。苯乙醇赋予葡萄酒蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人香味，样品A中苯乙醇含量为23.98 mg/L，低于大部分酒样，说明混合发酵可促进苯乙醇的生成。样品IA1中含量为33.51 mg/L，仅次于样品H，比样品A增加了34.15%。
图2 样品中各类香气物质的比例
Fig.2 The proportions of various classes of aroma substances in samples
2.2.4 酸类组分比较
葡萄酒中的有机酸能够保持酒体平衡和口感清爽特性，适宜的含酸量能使葡萄酒带有新鲜的水果香，修饰葡萄酒的滋味和口感，并且有利于形成瓶贮酒香。酸类物质主要来源于发酵副产物和葡萄浆果。发酵样品中共检测出8种酸类物质，样品IA1中含有7种，A中仅含4种。酸类物质总含量为2.92～5.43 mg/L，IA1中含量最高，比样品A增加了85.96%，占其全部香气成分的8.17%。样品中共有的酸类组分有己酸、辛酸、癸酸，HA1中己酸为0.66 mg/L，IA1中癸酸含量为1.28 mg/L，均为最高值。
为了更好地区别不同酒样中挥发性香气成分的差异，对所有OAV>0.1的36种挥发性香气成分及9组酒样进行主成分分析，结果如图3所示。前3个主成分分别占数据总体方差的35.9%、16.9%和13.9%，总贡献率为66.7%。由于接种菌株及接种比例的不同，各试验组有着不同的分布，葡萄汁样品CS组位于PC1、PC2的正方向上，主要含有香叶基丙酮、3-丙酮、己二酸二异丁酯、β-紫罗兰酮等香气成分；样品A主要位于PC1和PC2的正方向上，与H、HA1、HA2、HA3及IA3较为接近，酒样中乙酸乙酯、丁酸乙酯、正辛醇、乙酸异戊酯等香气成分含量丰富；IA1位于PC1和PC3的正方向和PC2的负方向上，与其它组别相距较远，正庚醇、异戊醇等香气成分含量较为突出；I和IA2位于PC2和PC3的负方向上，癸酸乙酯、1-癸醇等含量较为丰富。由此可见，东方伊萨酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母与安琪酵母混合发酵，对发酵酒样中香气成分影响较大。
a-得分图;b-载荷图
图3 发酵结束后酒样中OAV>0.1的香气化合物主成分分析
Fig.3 Principal component analysis for aroma compounds (OAV>0.1) in wines after alcoholic fermentation
对酒样中OAV>0.1的物质进行香气分组，选取∑OAV>0.5的7 种香气类型绘制得到葡萄酒的香气轮廓图。如图4所示，所有发酵酒样的香气均以果香和花香为主，其次为植物味、坚果香、焦糖味、化学味、脂肪味。相较于样品A，IA1、IA2、HA2中果香和花香显著提高[20]。这与混合发酵显著提高了样品中酯类、醇类等物质含量有关。植物味、脂肪味及化学味在低浓度条件有利于提升香气复杂度，所有处理无显著差别。
a-样品I、IA1、IA2、IA3和A;b-样品H、HA1、HA2、HA3和A
图4 赤霞珠干红葡萄酒感官香气轮廓图
Fig.4 Sensory aroma profile of Cabernet Sauvignon dry red wine
2.3 感官品评结果
由感官品评结果可知，样品IA1综合评分最高，为89.5，该酒样澄清度较好，呈新酒所具有的紫红色；酒体香气优雅细腻，具有赤霞珠葡萄品种的香气特性，具有浓郁的发酵香气，但协调性略差，还需要在后续陈酿过程中增加陈酿香气，形成更加协调丰富的香气；酒体丰满浓郁，平衡协调性较好，随着陈酿过程的进行，还需逐渐增加葡萄酒的质感。与A样品相比，其他样品在香气和滋味浓郁度、复杂性等均有所改善。
3 结论
东方伊萨酵母与安琪酵母混合发酵能够更迅速地将还原糖转化为乙醇和CO2，并显著促进挥发性香气成分的形成。二者以3∶1的比例混合发酵时，挥发性香气成分多达48种，含量比安琪酵母单独发酵酒样增加68.56%；其中品种香气成分4种，发酵香气成分酯类15种、高级醇10种、酸类7种，发酵香气成分含量与安琪酵母单独发酵酒样相比分别增加了18.98%、93.96%和85.96%，占其全部香气成分的14.43%、71.51%和8.17%；酒样中苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等香气成分的含量得到不同程度的增加，增强了葡萄酒中的花香和果香；经感官评定，该样品评分最高，为89.5。因此，可将东方伊萨酵母与安琪酵母以3∶1的比例混合发酵作为昌黎产区赤霞珠葡萄酒理想的混菌发酵方案。混菌发酵可改善葡萄酒发酵过程，提高葡萄酒风味的复杂性，研究结果为生产昌黎产区独特风味的葡萄酒产品提供了参考。
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