中国白酒最初有浓香、酱香、清香、米香等4种基本香型，为了使酿造的基础酒口感更加绵柔细腻、层级丰满[1-2]，白酒酿造工艺逐渐在四大香型白酒的基础上复合发展到如今的12种香型。目前复合香型白酒的研究主要集中在浓香与酱香的融合。基于浓香型白酒酿造工艺，结合酱香型、清香型白酒工艺的复合香型白酒研究，行业内一直在探索前进。
现阶段浓香型白酒的产量占比高、市场需求大，占我国白酒市场份额70%以上，且生产区域广泛，具有芳香浓郁、绵柔甘冽、香味协调、入口甜、落口绵、尾净余长等风格[3]。为满足市场需求，通过融合多香型工艺生产复合香型白酒，迎合消费者的口感喜好，提升白酒风味口感是未来中国白酒发展的方向之一[4-6]。白酒生产的工艺、原料、糖化发酵剂、环境是决定白酒质量和风格特征的关键因素[7-8]。不同香型的白酒具有其独特的生产工艺，而糖化发酵剂是白酒发酵的动力，其质量和种类直接关系到基础酒的口感风味和产量。本文结合浓香型和酱香型白酒生产工艺，进行复合香型白酒工艺研究，通过监测堆积发酵和入窖发酵后糟醅的温度及理化指标的变化，探究不同糖化发酵剂对白酒质量和风味的影响。利用第二代高通量测序技术检测堆积和发酵前后糟醅微生物种类及丰度变化，探究不同糖化发酵剂对糟醅微生物的影响。采用顶空-固相微萃取-气质联用技术分析基础酒中的风味物质，并由专业的尝评员进行感官品评，综合评定使用不同糖化发酵剂添加方案对复合香型白酒产量和质量的影响并选出较优方案，以期在传统中国白酒酿造工艺技术基础上，形成复合香型白酒生产工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
川南糯红高粱、糠壳，泸州首龙粮油贸易有限公司；高温大曲，贵州省仁怀市酒之骨大曲制造有限公司；河内白曲，山东梁山徐坊大曲有限公司；糖化曲，安琪酵母股份有限公司。
NaOH、邻苯二甲酸氢钾、盐酸、无水碳酸钠、无水乙醇；乙醇、叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸、乙醛等，均为色谱纯，上海聚合化工有限公司。
1.2 仪器与设备
电子分析天平，德国赛多利斯公司；酒精计，北京百万电子科技有限公司；SP-756P紫外可见分光光度计，上海屹谱仪器有限公司；MLS-375L全自动灭菌锅，日本日立公司；DHG-9245A烘箱，上海一恒科学仪器有限公司；DL-1电炉，北京中兴伟业仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机，德国艾本德公司；GC/MS-QP2020气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；TL2010S中通量组织研磨仪，北京鼎昊源科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复合香型白酒生产工艺流程及操作要点
以粉碎高粱为原料，以泸州某酒厂浓香酿酒车间粮糟为母糟，进行续糟配料、混蒸混烧、分层蒸酒、摊晾下曲、高温堆积、糖化发酵剂分别采用高温大曲+河内白曲和高温大曲+糖化曲2种实验方案(以下简称F1和F2)，入泥底石窖发酵30 d，发酵结束后掐头去尾摘取中段酒进行理化分析及口感尝评。具体工艺流程如图1所示。
图1 工艺流程图
Fig.1 Process flow chart
1.3.2 分析方法
理化指标测定方法参考《泸型酒技艺大全》[9]。
取样：同时跟踪相邻2口大小(3.2 m×2.4 m×1.8 m)一样的窖池，按五点取样法分别取糟醅堆积前后以及发酵结束后的糟样500 g，将所取糟醅混合均匀后分成2份，一份用作常规理化分析，另一份-80 ℃冰箱保存，用于提取总DNA。
基础酒主体风味成分分析、酒精度、总酸以及总酯的含量测定参考国标GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求 第一部分：浓香型白酒》。
白酒感官品评方法参考国标GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》、GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》。
微生物总DNA提取方法参考文献[10]。
2 结果与分析
2.1 理化及感官指标变化分析
因方案F1和F2的母糟是经过统一混匀后再添加糖化剂和麸皮，然后进入酿造过程，故从图2可见，在堆积前糟醅的理化特性虽存在显著性差异，但从堆积开始至发酵结束2种方案变化趋势一致。其中酸度、淀粉含量以及水分含量都出现一定程度的下降；酸度下降的原因可能是堆积过程中，微生物新陈代谢消耗了部分有机酸，或者易挥发性酸在堆积高温条件下挥发。虽然淀粉水解会产生一定水分，但由于堆积温度的增加，使得部分水分不断挥发，同时微生物大量生长繁殖，需要摄取糟醅中的水分[11]，所以水分含量在该过程变化不明显。淀粉含量减少是因为一部分被堆积糟醅中大量的霉菌生长代谢产生的淀粉酶水解，一部分被微生物的生长繁殖所消耗；此外，在发酵结束后，淀粉不断被微生物代谢，使得在淀粉含量继续降低的同时糟醅酸度和水分出现增长。同时，对比2个方案可以发现，在发酵阶段，F1比F2产酸更多，而淀粉利用率却更小，这与后文中F1相较于F2的原酒中总酸更高、出酒率更低相一致。
a-酸度；b-淀粉含量；c-水分含量
图2 糟醅理化性质对比分析
Fig.2 Physical and chemical properties of different fermented grains
注：D、R、C分别表示堆积前、堆积后、发酵后；1、2分别表示F1、F2方案(下同)
在堆积过程中，2个方案的糟醅上堆温度28.4～29.2 ℃，堆积时间72 h，堆积顶温48.5～51.2 ℃。如图3所示，不同堆积时间，糟醅表面呈现的状态有明显差异；当糟醅堆积顶温达50 ℃左右，表层长满白色菌丝，将手插入其中，能明显感受到其热度，此时需要进行破堆入窖，入窖糟醅颜色为深褐色，且带有果香气味。根据2个方案糟醅堆积升温情况(至48～52 ℃)和堆积糟醅菌丝生长情况(2～3 cm)来判断，2个方案组的糟醅堆积升温情况都较为理想，其中F2组糟醅堆积反应较F1组糟醅堆积效果更好，堆积前后的酸度都有所下降，其中F2组糟醅酸度下降幅度高于F1组，说明添加糖化曲的糟醅在堆积过程中有机酸类物质利用率更高。
高温堆积工艺使糟醅能够网罗富集周围环境中的微生物，促进其糖化、酯化等一系列化学反应的进行，达到二次制曲的目的，并产生酱香型白酒风味，堆积后的糟醅除感官上有着较大的变化外，其所含的营养物质、微量成分以及微生物等同样有所改变。在堆积发酵期间嗜热芽胞杆菌等有益于糟醅生香的嗜热、嗜温微生物会大量繁殖，为后续的入窖发酵提供充足的微生物[6,12-13]。
a-堆积0 h；b-堆积36 h；c-堆积48 h
图3 糟醅发酵过程中糟醅变化情况
Fig.3 Appearances of fermented grains during stacking fermentation
2.2 糟醅发酵过程中温度变化趋势
如图4所示，入窖温度控制在28～30 ℃，升温幅度在10 ℃左右，发酵温度整体符合“前缓-中挺-后缓落”的趋势，其中前2轮发酵温度升高较快，推测是由于第1～2轮发酵在热季进行，环境温度较高引起；其次，因该复合香白酒酿造过程中还加有高温大曲，故发酵温度主要以高温大曲为主，从而2种方案温度变化差异并不显著。入窖发酵3～4 d，微生物利用糟醅中带入的O2快速繁殖产生热量，使窖内发酵温度在15～20 d一直保持在30～36 ℃，在此期间，糖化所产生的葡萄糖与酵母菌维持生命所需的葡萄糖基本平衡，发酵基本停止，酵母菌逐渐衰老死亡，而细菌和其他微生物生长占优势[14]，此时酒精含量、酸度、淀粉变化不大。入窖第20～30天，酒精发酵基本完成，随着发酵时间的延长，有机酸增加，从入窖第20～30天至开窖，窖内处于温度缓慢下降的产酯期，也是香味物质逐渐生成的时期[15]。此时酵母菌已失去活力，主要是细菌作用产酸，发酵糟中醇类与有机酸发生酯化反应，酒精含量稍有下降，酸度逐渐上升，微生物细胞中所含酯化酶促使酯类物质生成，能促进糟醅产生较多的风味物质[16-17]。
a-第1轮发酵；b-第2轮发酵；c-第3轮发酵
图4 糟醅发酵过程中发酵温度的变化
Fig.4 Changes in fermentation temperature during the fermentation process of fermented grains
2.3 堆积前、后和发酵结束糟醅微生物多样性的特征分析
糟醅原核微生物群落组成(<1%合并为Others)如图5-a所示，整体上来看，2种方案优势微生物都为醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)以及芽胞杆菌属(Bacillus)等；不同方案中共检出14种优势细菌，因河内白曲和糖化曲2种曲药都是以真核微生物为优势微生物，故2种方案在细菌种类组成上较为相似，但丰度存在差异。通过对比堆积前糟醅样D1和D2发现，细菌群落结构具有相似性，但D2中克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)丰度显著高于D1，可能是由糖化发酵剂引入所致；对比堆积后糟醅样R1和R2，两者原核微生物群落结构趋于一致，可能是由于堆积过程中两者都加麸皮，提高了糟醅疏松度和含氧量，好氧微生物的丰度显著增加[18]；该现象表明麸皮在调味酒酿造过程中影响显著。另外，在F2发酵结束糟醅样本C2中还存在一定量的Acetobacter，这可能是由于麸皮的增氧特性或者是糖化曲对该发酵体系产生的影响使得整体酸度下降(图2-a)，从而减轻了对Acetobacter的抑制，使其参与整个酿造过程；原核微生物多样性分析结果表明，在整个酿造过程中，2种方案的糟醅发酵过程中细菌群落结构受河内白曲和糖化曲的影响较小，受高温大曲影响较大。
糟醅真核微生物群落组成(<1%合并为Others)如图5-b所示，不同方案中共检出20种优势真菌，真菌种类和丰度都存在显著差异。在堆积前，方案F1的真菌优势微生物为嗜热真菌属(Thermomyces 89%)；方案F2为丝衣霉属(Byssochlamys 12%)、Thermomyces 31%、曲霉属(Aspergillus 16%)、嗜热子囊菌属(Thermoascus 30%)。堆积后，方案F1的优势微生物主要为酵母，包括伊萨酵母属(Issatchenkia 29%)、毕赤酵母属(Pichia 29%)以及哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania 25%)；而方案F2的优势微生物主要为霉菌，主要为Byssochlamys 87%。发酵结束后，不同方案糟醅中真菌微生物种类基本一致，但其丰度不同；方案F1优势微生物群落结构复杂，包括Byssochlamys 8.8%、Thermomyces 2.6%、Aspergillus 7.9%、Issatchenkia 27%、Pichia 15%、青霉属(Penicillium 4.2%)、节担菌属(Wallemia 7.4%)、Thermoascus 3.1%；方案F2优势微生物包括Byssochlamys 14%、Aspergillus 6%和Penicillium 52%。可见，不同糖化发酵剂对整个发酵过程真菌群落结构的影响不尽相同，F1中真菌主要集中在酵母属，F2中真菌主要集中在霉菌属[19]。
a-细菌；b-真菌
图5 堆积前、堆积后、发酵后糟醅微生物多样性
Fig.5 Microbial diversity of fermented grains before stacking,after stacking and after fermentation
2.4 基础酒产酒率及特征风味物质分析
对2个实验方案进行蒸馏取酒，分级储存。综合酒样色谱数据如表1所示。
表1 基础酒产酒率及色谱数据理化指标分析
Table 1 An analysis of yield, chromatographic data, and physical and chemical index of basic liquor
方案产酒率/%己酸乙酯/(g·L-1)乙酸乙酯/(g·L-1)丁酸乙酯/(g·L-1)乳酸乙酯/(g·L-1)己酸/(g·L-1)乙酸/(g·L-1)丁酸/(g·L-1)总酸/(g·L-1)总酯/(g·L-1)F1-127.91.148.660.242.950.271.800.143.8211.26F1-230.30.466.300.102.140.091.880.052.488.18F1-329.80.298.700.205.660.032.400.072.0712.56F2-128.32.216.680.492.860.341.680.162.7610.48F2-231.60.275.170.082.690.101.750.052.357.36F2-330.70.348.290.266.030.063.600.153.0412.58
注：F1-1、F1-2、F1-3，分别表示F1方案下的3轮次基础酒；F2-1、F2-2、F2-3，分别表示F2方案下的3轮次基础酒
2个实验方案3轮次发酵的平均出酒率分别为F1(29.33±1.27)%、F2(30.2±1.72)%。由表1可见，四大酯中，乙酸乙酯含量最高，其次是乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯；己酸乙酯赋予基础酒浓香型酒风格特点，乙酸乙酯赋予基础酒清香型风格特点，综合其他酸酯物质使得基础酒的口感复合绵甜，丰满协调[20-22]。方案F1中，随着发酵轮次的增加，总酸含量逐渐降低，总体维持在(2.79±0.92)g/L。方案F2酸度逐渐增加，总体维持在(2.72±0.35)g/L；另外，对于酯类物质而言，2种方案都呈现先减少后增加的趋势，分别维持在(10.27±2.25)、(10.14±2.63)g/L，推测与糖化发酵剂中真菌微生物的种类相关。
2.5 基础酒品评结果分析
公司尝评委员会就2个实验方案3个轮次共6个综合酒样进行感官品评，尝评委员会由2名国家级白酒评委，4名省级评委组成，白酒感官品评严格按照国家标准GB/T 33404—2016进行，评分细则主要包括色泽(5分)、香气(25分)、口感(60分)、风格(10分)4个方面。尝评委员会给出的综合平均结果如表2所示。
表2 基础酒综合样对比品评记录表
Table 2 Comparison and evaluation record of comprehensive samples of basic liquor
酒样特征色泽香气口感风格得分评语F1-14.521538 86.5略带焦香,后味酸F1-24.523558.591略带酱味,味短F1-352256992略甜净,带糊味F2-1522568.591.5较净,后味略酸F2-252455993甜净,带酱味F2-3524579.595.5略甜,干净
结合基础酒的品评结果，经过高温堆积后入窖发酵，结合了酱、浓香工艺的基础酒在香气、口味、口感、酒体、风格等方面融合了酱、浓两香型之长，特点突出。酒体皆表现为无色或微黄透明，特别是在贮存6个月及一年以后，F2的基础酒相较于F1酒体而言，颜色更显微黄，口味醇厚绵甜、丰满协调、回味悠长、还带有一定酱味，具有舒适优雅的复合香气。专家总体评价表明，F1方案基础酒在香气和风格比F2方案基础酒更为突出。
3 结果与讨论
不同糖化发酵剂酿造特殊风格白酒工艺，结合了浓香型白酒的续糟配料工艺、酱香型白酒的高温堆积等关键工艺特点，通过对复合香型白酒酿造过程中发酵温度的持续性监测，以及对糟醅堆积前、堆积后和发酵结束后糟醅进行高通量测序并分析微生物多样性，结果表明2种方案在酿造过程中，理化指标变化趋势一致，且方案F1酿造过程中理化指标变化差异更明显；糟醅发酵温度都呈现“前缓、中挺、后缓落”的趋势，区别在于不同轮次因季节差异，导致发酵前期升温速度不同，但总体升温幅度都在10 ℃左右；添加河内白曲(F1)和糖化曲(F2)的基础酒出酒率分别为(29.33±1.27)%、(30.2±1.72)%，总酸分别为(2.79±0.92)、(2.72±0.35)g/L，总酯分别为(10.27±2.25)、(10.14±2.63)g/L；感官评价表明2种方案所酿基础酒在香气、口味、口感等方面都较为突出，其中F2方案的基础酒优于F1方案。通过对第3轮堆积前、入窖和出窖糟醅进行微生物多样性分析发现，2种方案在整个酿造过程中细菌群落结构相似，真菌结构差异显著；最终结合专家组对于基础酒综合评分得出添加糖化曲的方案在香气和风格更为突出，总体评价更高。以上结果表明不同香型白酒酿酒工艺的相互借鉴融合，不同糖化发酵剂的配比使用，在提升基础酒质量和生产口感丰富的复合香型白酒方面具有一定效果。
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