糖尿病通常被分为4种类型，Ⅰ型和Ⅱ型最为常见，其中Ⅱ型糖尿病患病人数最多[1]。尽管Ⅱ型糖尿病发病原因不明确，但是，其与遗传[2]、年龄[3]、代谢[4]、肥胖[5]、生活方式[6]、机体免疫力[7]、心情状态[8]等因素密切相关。最新研究发现，慢性炎症反应和代谢紊乱会造成机体免疫能力下降，导致Ⅱ型糖尿病以及相关并发症发生[9]，暗示着改善炎症反应和调节代谢紊乱，可能是逆转Ⅱ型糖尿病的有效途径。
三叶木通[Akebia trifoliata(Thunb.) Koidz.]是药食同源植物，广泛分布于安徽、福建等地，是《本草纲目》和《中国药典》的记载品种[10]，具有抗炎、抗氧化、调节肠道微生物菌群等作用[11-12]。三叶木通藤茎和果皮的天然产物不同，藤茎具有58种有效化学成分，果皮具有高级脂肪酸、酚酸、黄酮、常春藤皂苷和其他生物活性糖苷等43种化学成分。藤茎的常春藤皂苷具有抗肿瘤活性[13-14]，果肉萃取物具有显著的体外抗氧化作用和抑制α葡萄糖苷酶活性，其ABTS阳离子自由基清除能力接近商业抗氧化剂[15]。本研究以三叶木通藤茎为原料，制备三叶木通乙酸乙酯提取物，研究其与模型动物炎症反应和糖尿病的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6种小鼠60只，SPF级，健康雄性，鼠龄4～5周，体重(18±4) g，购于GemPharmatech公司[生产许可证：SCXK(苏)2018-0008]，饲养在上海海洋大学动物实验室，保持环境温度(23±2) ℃，相对湿度45%～65%，自然昼夜。本研究经上海海洋大学动物伦理委员会审核批准(批准编号：SHOU-DW-2020-054)并严格按照动物使用管理条例进行。
1.2 材料与试剂
三叶木通乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract，EAE)，自制；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ),美国Sigma公司；盐酸二甲双胍，上海源叶生物科技有限公司；高脂高糖饲料、基础饲料，江苏省协同医药生物工程有限责任公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素6(interleukin-6, IL-6)试剂盒，南京建成生物工程研究所。
1.3 主要仪器
免调码型血糖仪，三诺生物传感股份有限公司；Spectra MAX M2 型酶标仪，美谷分子仪器有限公司；iChem-340 型全自动生化分析仪，深圳市库贝尔生物科技有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 EAE的制备
三叶木通藤茎由温州市农业科学研究院赠送，经上海海洋大学何培民教授鉴定。将三叶木通藤茎清洗、干燥、粉碎后得到藤茎粉末，粉末用体积分数95%乙醇提取3 h，此过程重复6次，提取后抽滤，合并所有滤液，滤液经真空浓缩得到浸膏，按体积比1∶1溶解在去离子水中，经乙酸乙酯萃取，重复3次后收集上清液，通过真空干燥得到乙酸乙酯提取物。
1.4.2 小鼠糖尿病模型的构建
高脂高糖饲养联合STZ注射，建立糖尿病动物模型。高脂高糖饲料喂养致小鼠发生代谢紊乱，胰岛素敏感度降低导致出现胰岛素抵抗，STZ对动物胰岛β细胞有破坏作用[16]。保持环境温度(23±2) ℃，相对湿度45%～65%，进行适应性饲养1周后，随机分笼出10只小鼠，投喂基础饲料，其余小鼠投喂高脂高糖饲料。观察所有小鼠精神状态，每周在固定时间对所有小鼠进行体重称量。饲养4周后，体重达标小鼠禁食12 h后进行STZ注射操作。取STZ粉末溶于浓度为0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中，并在避光条件下进行滤膜除菌。一次性腹腔注射STZ，剂量为120 mg/kg，基础饲料喂养小鼠相同位置注射生理盐水。观察3周，根据体重、血糖指标和观察结果进行判定，选取出现精神萎靡症状且空腹血糖值(fasting blood glucose，FBG)>11.1 mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型。
1.4.3 实验设计与处理
将糖尿病小鼠模型随机分为5组，即空白组(DC)、阳性对照组(PC)和三叶木通乙酸乙酯提取物高(EAE-H)、中(EAE-M)、低剂量(EAE-L)处理组，每组8只小鼠。随机从基础饲料喂养小鼠中选取8只，作为对照组(NC)分笼饲养，投喂基础饲料，每日灌胃生理盐水。DC组投喂高脂高糖饲料，每日灌胃生理盐水。PC组投喂高脂高糖饲料，每日灌胃250 mg/kg二甲双胍生理盐水溶液。EAE-H组、EAE-M组、EAE-L组投喂高脂高糖饲料，每日分别灌胃含500、250、100 mg/kg EAE的生理盐水溶液，所有小鼠保持饮水自由。
1.4.3.1 血清采集
EAE处理3周后，用酒精棉棒擦拭小鼠眼周，擦拭后立即摘除小鼠眼球取血，柠檬酸钠抗凝后室温静置30 min，静置后3 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液并分装、标记，-80 ℃冻存。
1.4.3.2 炎症指标测定
将冻存血清解冻后，稀释100倍，根据试剂盒依次加入样品、标准品、生物素抗原、亲和素、显色液和终止液，10 min内测定波长450 nm处的吸光度(OD值)，做标准曲线后计算小鼠血清内炎症因子水平。
1.4.3.3 小鼠肝脏苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)
眼球取血后立即准确摘取小鼠肝脏，经福尔马林溶液固定后修剪、脱水、包埋、制切片，切片经HE染色后进行中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。
1.4.3.4 生化指标测定方法
将冻存血清解冻后，将样本用涡旋仪涡旋15 s，根据GPO-PAP法测定小鼠血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)含量，双试剂直接法测定小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量，用全自动生化分析仪进行测定，上机检测后读取原始数据。
1.4.3.5 FBG和口服葡萄糖糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT)指标测定
小鼠腹腔注射灭菌STZ后，每周固定时间禁食12 h，饮水自由，尾静脉取血，血糖仪测定小鼠血糖水平，记录结果。EAE处理3周，小鼠在同一时间禁食12 h，灌胃葡萄糖溶液，剂量为2 g/kg。尾静脉取血，在0、30、60、120 min时测定小鼠血糖水平。
1.4.3.6 一般药理与体重测定
每日定时观察小鼠皮毛状态、外形变化、进食、饮水、排尿、呼吸、自主活动、呼吸、心率等情况，每周称量记录小鼠体重。
1.5 统计学处理与分析
用GraphPad 8.0软件进行数据处理与分析，实验数据以平均数±标准差表示，采用Tukey多重检验法来分析组间差异，P<0.05时代表差异显著，具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 糖尿病小鼠模型的特征
高脂高糖饲养结合STZ注射，处理小鼠3周，构建糖尿病小鼠模型，糖尿病小鼠模型特征(表1)显示，模型组血糖16.9 mmol/L，对照组血糖6.0 mmol/L，2组血糖水平差异显著(P<0.05),说明糖尿病小鼠模型构建成功。模型组小鼠精神状况萎靡不振，皮毛粗糙毛躁，失去光泽，进食量增加，排尿增多，体重减少。
表1 小鼠糖尿病模型的特征指标表
Table 1 Characteristic index of diabetic mice model
组别饲料量/(g·d·只)体重/(g·只)血糖/(mmol·L-1)皮毛外观模型组7.83±0.1225.45±1.3516.9±1.00暗淡对照组3.11±0.2828.16±1.616.0±0.77光泽
2.2 EAE减轻糖尿病小鼠模型的炎症反应
EAE处理前后小鼠血清的TNF-α水平和IL-6水平如图1。与NC组相比，DC组小鼠血清中TNF-α从170.46 pg/mg升高至265.96 pg/mg，极显著升高56%(P<0.01)；IL-6从104.25 pg/mg升高至179.70 pg/mg，极显著升高72%(P<0.01)，说明与NC组相比，DC组出现炎性特征。
a-TNF-α；b-IL-6
图1 EAE对糖尿病小鼠模型炎症反应的影响
Fig.1 Effect of EAE on inflammatory response in diabetic mice model
注：*表示DC与处理组的统计分析，P<0.05；**表示DC与处理组各组的统计分析，P<0.01；##表示DC组与NC组的统计分析，P<0.001(下同)
与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组的TNF-α从265.96 pg/mg分别降低至198.46、217.17、225.52、239.20 pg/mg，极显著降低25%(P<0.01)、18%(P<0.01)、15%(P<0.01) ，显著降低10%(P<0.05)；PC组、高、中剂量处理组的IL-6从179.70 pg/mg分别降低至133.08、142.08、151.14 pg/mg，极显著降低26%(P<0.01)、21%(P<0.01)、16%(P<0.01),低剂量处理组降低11%，但与DC组无显著差异。
EAE处理前后小鼠肝脏HE染色结果显示(图2)，NC组中小鼠肝小叶、肝窦清楚可见，未出现炎细胞浸润情况，纤维组织未出现增生。与NC组相比，DC组小鼠肝脏肝小叶轮廓界限模糊，肝细胞发生明显的脂肪变性，肝细胞胞质被大脂肪滴挤压。说明与NC组相比，DC组小鼠肝脏出现炎症损伤，DC组小鼠体内出现炎症反应，符合预期。
与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组的小鼠肝脏肝细胞脂肪变性发生不同程度缓解，高剂量处理组的缓解效果好于低剂量处理组，说明EAE能够有效缓解糖尿病小鼠模型肝脏的炎症损伤。
a-NC；b-DC；c-PC；d-EAE-H；e-EAE-M；f-EAE-L
图2 EAE对糖尿病小鼠模型肝脏炎症反应的影响(400倍)
Fig.2 Effect of EAE on liver inflammation in diabetic mice model (400 ×)
2.3 EAE对糖尿病小鼠模型血脂代谢的影响
取适量样本，通过全自动生化分析仪测定小鼠血清中血脂代谢指标(表2)。表2显示，与NC组相比，DC组小鼠血清中TC水平从2.58 mmol/L升高至5.83 mmol/L，显著升高126%(P<0.01)；TG水平从0.78 mmol/L升高至1.63 mmol/L，显著升高108%(P<0.01)；LDL-C水平从0.83 mmol/L升高至1.90 mmol/L，显著升高128%(P<0.01)；HDL-C水平从1.48 mmol/L降低至0.61 mmol/L，显著降低58%(P<0.01)，说明与NC组相比，DC组小鼠机体内发生血脂代谢紊乱。
表2 EAE对糖尿病小鼠模型血脂代谢的影响
Table 2 Effect of EAE on blood lipid metabolism in diabetic mice model
组别血脂水平/(mmol·L-1)TCTGLDL-CHDL-CNC2.58±0.260.78±0.090.83±0.131.48±0.20DC5.83±0.55###1.63±0.17###1.90±0.16###0.61±0.15###PC3.09±0.26∗∗0.88±0.15∗∗1.28±0.13∗∗1.27±0.14∗EAE-H3.29±0.26∗∗1.00±0.12∗∗1.34±0.15∗1.16±0.19∗EAE-M3.46±0.28∗∗1.25±0.14∗1.42±0.11∗1.08 ±0.16∗EAE-L3.77±0.33∗1.43±0.161.55±0.14∗0.86±0.10
注：*表示DC与处理组的统计分析，P<0.05；**表示DC与处理组各组的统计分析，P<0.01；##表示DC组与NC组的统计分析，P<0.01(下同)
与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组TC水平从5.83 mmol/L分别降低至3.09、3.29、3.46、3.77 mmol/L，极显著降低47%(P<0.01)、43%(P<0.01)、40%(P<0.01)，显著降低35%(P<0.05)；LDL-C水平从1.90 mmol/L分别降低至1.28、1.34、1.42、1.55 mmol/L，显著降低32%、29%、25%、18%(P<0.01、P<0.05，P<0.05，P<0.05)；PC组、高、中剂量处理组的TG水平从1.63 mmol/L分别降低至0.88、1.00、1.25 mmol/L，显著降低46%、38%、23%(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；HDL-C水平从0.61 mmol/L分别升高至1.27、1.16、1.08 mmol/L，显著升高108%(P<0.05)、90%(P<0.05)、77%(P<0.05)，说明处理组血脂代谢紊乱有不同程度的改善。
2.4 EAE对糖尿病小鼠模型血糖的影响
如表3所示，STZ注射3周后，与NC组相比，DC组、PC组、高、中、低剂量处理组小鼠血糖从6.0 mmol/L显著升高至16.9、17.3、17.5、17.6、17.8 mmol/L(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，说明各模型组糖尿病小鼠模型形成。
表3 EAE对糖尿病小鼠模型空腹血糖的影响
Table 3 Effect of EAE on fasting blood glucose in diabetic mice model
组别FBG/(mmol·L-1)第1周第2周第3周第4周第5周第6周NC6.2±0.536.3±0.506.0±0.77 6.1±0.576.0±0.796.5±0.45DC6.8±1.1710.6±1.0916.9±1.00###20.6±0.9122.3±1.1924.0±1.22###PC6.3±1.9510.4±1.9917.3±1.76###16.8±1.9715.4±2.3614.2±2.48∗∗EAE-H6.1±1.3610.1±1.7817.5±1.91###17.1±1.7716.7±1.6215.5±1.93∗∗EAE-M6.3±1.7811.0±1.9217.6±1.78###17.6±1.9417.2±1.9916.9±1.21∗∗EAE-L6.9±1.8811.5±1.6217.8±1.11###17.8±1.2517.6±1.4717.3±1.04∗∗
EAE处理6周后，与NC组相比，DC组小鼠血糖从6.5 mmol/L升高至24.0 mmol/L，显著升高270%(P<0.01)。与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组血糖从24.0 mmol/L分别降低至14.2、15.5、16.9、17.3 mmol/L，显著降低40%、35%、29%、27%(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，说明处理组血糖含量有不同程度的减少。
通过尾静脉取血法测定0、30、60、120 min时小鼠空腹血糖水平，EAE处理前后小鼠OGTT水平和血糖线下面积(area under curve,AUC)显示(图3)，灌胃葡萄糖30 min内，NC组小鼠血糖由6.53 mmol/L升高至13.47 mmol/L，显著升高106%(P<0.01)，DC组小鼠血糖由24.05 mmol/L升高至28.67 mmol/L，显著升高19%(P<0.01)，PC组、高、中、低剂量处理组血糖分别从17.26、19.90、21.47、22.55 mmol/L升高至25.55、26.63、25.73、27.12 mmol/L，极显著升高48%(P<0.01)、33%(P<0.01)、19%(P<0.01)、20%(P<0.01)。第120 min时，NC组小鼠血糖下降至8.67 mmol/L，DC组小鼠血糖下降至25.83 mmol/L，PC组、高、中、低剂量处理组血糖分别降低至18.27、20.91、23.06、24.32 mmol/L。
a-OGTT；b-AUC
图3 EAE对糖尿病小鼠模型口服糖耐量和
血糖曲线下面积的影响
Fig.3 Effect of EAE on oral glucose tolerance and area under the glucose curve in diabetic mice models
与NC组相比，DC组AUC值从1 282.10 mmol/L显著升高至3 113.81 mmol/L(P<0.01)。与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组AUC值从3 113.81 mmol/L分别显著降低至2 581.76、2 775.43、2 819.63、2 918.77 mmol/L(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.05)，说明EAE可缓解餐后血糖含量升高。
2.5 EAE对糖尿病小鼠模型体重的影响
每周称量记录小鼠体重，EAE处理前后小鼠体重水平如图4所示，经过3周干预，与NC组相比，DC组小鼠体重从28.16 g降低至25.45 g，显著降低9%(P<0.01)。第6 周时，与NC组相比，DC组小鼠体重从29.08 g降低至24.91 g，显著降低14%(P<0.01)，说明Ⅱ型糖尿病导致DC组小鼠体重下降。
从第3周开始，与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组体重从24.91 g分别升高至27.43、27.11、26.46、25.94 g，显著升高10%、8%、6%、4%(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)。第3 周与第6 周相比，DC组小鼠体重从25.45 g降低至24.91 g，极显著降低2%(P<0.01)，PC组、高、中、低剂量处理组体重分别从26.04、26.01、25.11、24.92 g显著升高至27.43、27.11、26.46、25.94 g(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，说明EAE可以缓解Ⅱ型糖尿病模型小鼠体重下降情况。
图4 EAE对糖尿病小鼠模型体重的影响
Fig.4 Effect of EAE on the body weight of diabetic mice models
注：第1～3周为建立糖尿病小鼠模型，第4～6周为EAE处理
3 结论与讨论
糖尿病通常会导致机体出现饮食量和排尿量增加，体重不正常降低等症状[17]。高脂高糖喂养结合STZ注射构建糖尿病小鼠模型，EAE处理3周后，与NC组相比，DC组小鼠饮食量增加，排尿增多，体重下降，说明高脂高糖喂养结合STZ注射导致DC组小鼠出现糖尿病相关症状。
TNF-α和IL-6是由炎症类细胞分泌的炎症因子[18]，糖尿病患者机体内会产生慢性炎症。EAE处理3周，与DC组相比，PC组、高、中剂量处理组的TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.01)，低剂量处理组的TNF-α水平显著降低(P<0.05)，IL-6水平有所下降，但无显著性差异，肝脏损伤有不同程度的缓解，结果显示EAE能降低糖尿病小鼠模型血清的TNF-α、IL-6水平，减轻炎症反应，说明三叶木通所含成分具有抗炎作用，与前人研究结果一致[19]。
TC、TG、LDL-C、HDL-C含量异常说明机体出现血脂代谢紊乱情况[20-23]。与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组经相应处理后，TC、LDL-C含量显著减少(P<0.05)，PC组、高、中剂量处理组TG含量显著减少(P<0.05)，HDL-C水平显著升高(P<0.05)，结果表明EAE能降低模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，缓解DC组小鼠体内的代谢紊乱。
机体血糖水平是判定糖尿病指标之一[24]。在高脂高糖饮食联合STZ注射作用下，第3周时DC组、PC组、高、中、低剂量处理组小鼠血糖值均>11.1 mmol/L，与NC组相比均显著升高(P<0.01)，说明糖尿病动物模型构建成功。EAE处理3周后，与DC组相比PC组、高、中、低剂量处理组血糖水平均显著降低(P<0.05)，降低效果PC组>EAE-H组>EAE-M组>EAE-L组。
OGTT与AUC可以表明机体的糖负荷能力，AUC与机体胰岛素敏感度呈负相关[25]。根据图3，各糖尿病小鼠模型的血糖-时间曲线均在NC组之上，在30 min时达到最高值，在120 min时趋于平稳。DC组AUC显著高于NC组(P<0.01)，说明糖尿病小鼠模型体内的胰岛素敏感度低于正常组。与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组AUC显著降低，说明EAE可以调节餐后血糖。
不明原因的体重降低是糖尿病患者最明显的体征变化[26]，经饮食和STZ注射联合作用后，与NC组相比，模型组小鼠体重显著降低(P<0.01)，EAE处理3周后，与DC组相比，PC组、高、中、低剂量处理组体重显著升高(P<0.01)，说明EAE可以改善糖尿病小鼠模型体重减少的现象。EAE可减轻机体炎症反应，缓解肝脏炎症损伤，调节血脂代谢，抑制糖尿病血糖升高，改善机体体重减少现象。
糖尿病患者往往伴随着机体免疫力的下降。减轻炎症反应、调节血脂代谢紊乱可提升抗氧化能力，而抗氧化能力与机体的免疫力有关[27]。EAE可降低TNF-α、IL-6水平，提升抗氧化能力，进而帮助机体有效调节血脂代谢途径，改善紊乱，最终表现为血糖值下降，体重下降速度减缓。
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