奶业是健康中国、强壮民族不可或缺的产业，牛奶中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质，营养全面且易于人体吸收[1]。乳制品的风味是影响其质量的重要因素[2-3]，乳脂肪对奶制品的风味形成具有重大作用[4]，但随着消费者对健康意识的提高，更倾向于购买低脂或脱脂乳制品，降低摄入过多乳脂肪带来的健康风险[5]。但脱脂乳存在口感不浓厚，风味不突出等缺点。因此，迫切需求采取新的加工技术来强化乳香风味的形成，获得风味浓郁、可用于调配使用的天然风味乳脂基料，既满足消费者的感官享受，又满足了其对健康的需求。
利用酶解法酶解奶油获得风味成分增强的奶香基底是目前的研究热点，酶可将乳脂肪分解成为脂肪酸、甲基酮及内酯类物质[6]，将其调配到不同的乳制品中，可提升乳制品的独特风味。目前的研究集中于利用脂肪酶对黄油、淡奶油等底物进行酶解，但酶解过后产物具有令人不适的酸味，需要后期进行调配。
脂肪氧合酶 (lipoxygenase，LOX)是一种含非血红素铁的加氧酶，专一催化具有顺，顺-1，4戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其相应的脂，形成具有共轭双键的脂氢过氧化物，再经过进一步的反应生成各种挥发性的脂类物质。LOX的活性部位含有铁离子，酶促反应时，首先氢原子从底物上离开，同时铁离子被还原。第二步为分子氧与底物自由基反应，形成过氧化自由基；最后，过氧化自由基被LOX的铁所还原，生成氢过氧化合物，而LOX的铁转变为Fe3+。含有顺，顺-1，4戊二烯结构的不饱和脂肪酸、脂肪酸酯都可以作为LOX的底物。植物中其天然底物主要是亚油酸和亚麻酸，动物体内其天然底物主要是花生四烯酸。LOX的来源不同或者底物不同，都会导致其加氧的位置不同，形成的底物也就有所差异。目前已研究发现2种大豆脂肪氧合酶同工酶LOX-1和LOX-2。LOX-1的底物为不饱和脂肪酸，生成13-氢过氧化物；LOX-2的底物为酯化底物，生成9-氢过氧化物或3-氢过氧化物[7]。
张婵等[8]利用LOX处理香菇，1-辛烯-3-醇、3-辛酮等特征风味物质含量显著增加，得到了香菇风味增强的浓缩液。LOX也可与过氧化氢酶等协同作用，增强水果和蔬菜的自然香气，例如黄瓜风味中的风味化合物2-反式己烯醛和2-反式-6-顺式壬二烯醛，就是亚麻酸的酶促氧化分解产物[9]。KERLER 等[10]利用LOX催化水解后的红花油和亚麻籽油合成氢过氧化物，氢过氧化物经氢过氧化物裂解酶裂解产生己醛，总产率为50%。LOX催化生成的氢过氧化物分解后会产生六碳醇与醛，其具有青草芬芳的自然风味，会给人带来一种食品新鲜的感觉[11]。
本实验采用LOX粗酶对底物黄油进行酶解，探究LOX对强化乳香风味成分效果的影响，获得风味浓郁的天然、安全乳脂基料，同时进一步拓宽大豆LOX的应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
安佳原味黄油，恒天然商贸有限公司；黄大豆，上海裕田农业科技有限公司；吐温-20、硼酸、NaOH、亚油酸、冰醋酸、甲醇、二甲基亚砜，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
磁力搅拌器，艾卡仪器设备有限公司；水浴锅，太仓市强乐实验设备有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；GC-MS-QP 2010 Ultra，日本岛津；紫外分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大豆LOX粗提取
大豆经搅拌器打碎，用40目标准筛去皮。称取10 g豆粉，分别加入50、100、150 mL冰水[料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15，(g∶mL)]搅拌浸提0.5、1、2、3 h后，于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，上清液即为大豆LOX粗酶液。
1.3.2 酶活力的测定
将0.25 mL吐温-20分散于10 mL 0.2 mol/L pH 9.0硼酸盐缓冲液，摇动、逐滴加入0.27 mL亚油酸，充分混合，加入1.0 mL 1 mol/L NaOH溶液至澄清，调pH至9.0，缓冲液稀释至500 mL作为底物液。
取0.1 mL粗酶液移入0.2 mL底物和2.7 mL缓冲液中，混匀，25 ℃水浴3 min后，于100 ℃水浴5 min终止反应，于234 nm测吸光度；空白对照为0.1 mL灭活酶、0.2 mL底物和2.7 mL缓冲液于25 ℃水浴3 min。
酶活力定义为：25 ℃、pH 9.0，以亚油酸为底物的3 mL反应体系，于234 nm处每分钟增加0.001吸光度值定义为1个酶活力单位[12]。
1.3.3 粗酶酶学性质测定
1.3.3.1 温度对酶活力的影响
改变1.3.2中酶活力测定时的水浴温度，测定LOX粗酶在不同反应温度(20～60 ℃)下的酶活力。
1.3.3.2 pH对酶活力的影响
改变1.3.2中酶活力测定时反应体系的pH值，分别用醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3～5)、硼酸-硼酸钠(pH 6～11)缓冲液，测定LOX粗酶在不同pH下的酶活力。
1.3.3.3 金属离子对酶活力的影响
在底物中分别添加终浓度为0.1和1 mol/L的一价金属离子(Na+、K+)、二价金属离子(Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)，测定添加金属离子后LOX粗酶的酶活力，以未添加金属离子的酶活力为100%。
1.3.3.4 底物促溶剂对酶活力的影响
在缓冲液中分别添加体积分数为2%和6%的甲醇、二甲基亚砜促进底物在缓冲液内分散，测定添加底物促溶剂后LOX粗酶的酶活力，以未添加促溶剂的酶活力为100%。
1.3.4 LOX酶解对风味的影响
取50 mL黄油加入LOX粗酶5 mL，磁力搅拌混匀，40 ℃反应1 h后，90 ℃水浴10 min灭酶，于室温下6 000 r/min离心10 min，取上层油相为产物进行挥发性成分分析和感官评价。
1.3.5 酶解温度对风味的影响
取50 mL黄油加入LOX粗酶5 mL，磁力搅拌混匀，分别于35、40、45和50 ℃反应1 h后，90 ℃水浴10 min灭酶，于室温下6 000 r/min离心10 min，取上层油相为产物进行挥发性成分分析和感官评价。
1.3.6 酶解时间对风味的影响
取50 mL黄油加入LOX粗酶5 mL，磁力搅拌混匀，分别于40 ℃反应1、2、3 h后，90 ℃水浴10 min灭酶，于室温下6 000 r/min离心10 min，取上层油相为产物进行挥发性成分分析和感官评价。
1.3.7 挥发性成分分析
采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法，取5 mL样品，加入10 μL 50 mg/L 4-甲基-2-戊酮作为内标，置于20 mL顶空瓶中，将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。
GC-MS的分析条件：采用DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为He，流速1.6 mL/min。色谱柱起始柱温50 ℃(保持1 min)，以8 ℃/min升到230 ℃保持5 min。进样口温度250 ℃。
质谱条件为电子轰击离子源，离子源温度200 ℃，检测电压1 000 V，界面温度250 ℃，发射电流100 mA，电子能量70 eV。
1.3.8 感官评价
由10名人员组成感官评价小组，根据各自的喜好对酶解产物的香气进行奶香味、持续感、醇厚味、异味、整体接受性5个方面进行评价，满分10分，具体的评分标准见表1。
表1 香气评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
内容评价评分奶香味奶香味增强明显8～10奶香味比原料风味强4～7停留在原料风味1～3持续感放置20 min后,奶香味没变淡8～10放置20 min后,奶香味明显变淡4～7放置20 min后,奶香气味微弱1～3醇厚味香气强烈8～10香气较弱4～7香气微弱1～3异味没有臭味和刺激性气味8～10出现酸败味4～7有明显的酸败味和呛鼻味1～3整体接受性风味比较协调8～10风味协调性一般4～7风味协调性差1～3
2 结果与分析
2.1 LOX粗酶提取条件的优化
料液比对LOX粗酶酶活力的影响如图1-a所示，料液比增加，酶活力呈现先上升后降低的趋势，最佳料液比为1∶10(g∶mL)。提取时间对LOX粗酶酶活力的影响如图1-b所示，随着提取时间增加，酶活力呈现先升高后降低的趋势，最佳提取时间为1 h，可能是由于在提取前期，提取时间越长，酶的溶出量越多，但随着时间不断增加，细胞内其他杂质混入提取液，影响了酶的溶出以及活力[13]。
a-料液比；b-提取时间
图1 料液比和提取时间对酶活力的影响
Fig.1 Effects of liquid ratio and extraction time on enzyme activity
2.2 LOX粗酶的酶学特性
对不同温度下LOX的酶活力进行分析，测得酶活力如图2-a所示，低温下LOX粗酶的酶活能保持较高水平，温度在30～40 ℃时酶活较为稳定，温度达到40 ℃时，酶活力达到最大，温度继续升高，酶活力下降明显，可能是由于温度高导致LOX部分失活。
考察pH对酶活力的影响，测定不同pH下LOX的酶活力如图2-b所示。酶活力呈现出先升高再降低的趋势，当pH达到7时酶活力达到最大。大豆LOX具有较宽的pH稳定范围，在本实验中，pH<6时酶活力出现下降，但仍具有活力，部分原因是其底物亚油酸在pH<7时溶解性较差，导致酶活力降低[14]。
研究金属离子对酶活力的影响，结果如图2-c所示。0.1 mol/L的Na+、K+、Mg2+对酶活力有激活作用，1.0 mol/L的K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+对酶活力有明显的抑制作用。有些金属离子会在酶与底物之间形成一种酶-金属离子-底物的三元复合物，有利于底物与酶的活性中心结合[15]，从而对酶活力有提高的作用。
底物的溶解度可以影响酶和底物结合，研究促溶剂对酶活力的影响，结果如图2-d所示。添加体积分数为2%的甲醇、二甲基亚砜对酶活力有提升作用，原因可能是促进了底物的溶解[16]。体积分数为6%时，酶活力受到了抑制，可能是高浓度的有机溶剂使部分酶失活所致。
2.3 LOX酶解对风味的影响
实验前期对黄油的风味进行了分析，共检测出40种主要挥发性成分(表2)，其中对风味贡献最大的是酸类物质，如己酸、辛酸、正癸酸等这些饱和脂肪酸[17]，它们是构成乳香的重要成分。醛类化合物的含量虽然不高，但风味阈值较低，因而在奶香味形成中起着重要的作用[18]，如2, 4-壬二烯醛、壬醛等，具有加热奶油的风味。
a-温度；b-pH；c-离子种类；d-促溶剂种类
图2 不同条件对酶活力的影响
Fig.2 Effects of temperature, pH, metal ions and additive agents on enzyme activity
利用LOX粗酶酶解黄油后，主要挥发性成分增加到48种，饱和脂肪酸含量增加，尤其是己酸、辛酸、丁酸含量明显增加；醛类物质含量略有降低；酮类物质含量显著增加，如2-壬酮，并且产生了2-庚酮，这些酮类物质的前体来源于乳脂肪中的脂肪酸，在LOX的作用下经过一系列的氧化分解而形成。酮类物质尤其是甲基酮类多被描述为清新的奶油香气，并且具有较高的香气强度，是形成乳制品风味的重要组成成分[19]；另外，酶解后δ-癸内酯、丁位己内酯等酯类化合物含量显著增加，酯类虽然含量不高，但对乳中奶香的形成贡献也很大[20]。其中内酯类物质多被描述为奶香柔软、绵长的感觉；一些脂肪酸乙酯类具有水果的甜香味，可以缓和酸类所带来的刺激性味道，使奶香更加协调、柔和。
表2 黄油酶解前后主要挥发性成分及含量
Table 2 Compositions and contents of main volatile components of butter before and after enzymatic hydrolysis
化合物名称黄油/(mg·mL-1)酶解后/(mg·mL-1)风味描述化合物名称黄油/(mg·mL-1)酶解后/(mg·mL-1)风味描述乙酸1.11 18.15 刺激气味丙酸0.16 3.28 有刺激气味正戊酸1.97 9.62 有令人不愉快的气味己酸270.88 1 079.30 类似羊的气味庚酸19.65 23.89 脂肪味辛酸397.96 630.26 略有不舒适的气味,稀释后呈水果香气2,4-己二烯酸—4.36 无明显风味壬酸5.05 8.91 呈淡的脂肪和椰子香气正癸酸301.56 357.39 令人不愉快的气味9-癸酸20.38 15.09 肥皂味月桂酸54.30 65.44 椰香风味肉豆蔻酸11.67 67.42 无明显风味丁酸87.20 731.73 黄油味,浓度高时有腐臭味总酸类 1 171.90 3 014.84 苯甲醛2.78 0.88 杏仁气味正辛醛1.23 2.06 橙子香气壬醛1.83 5.15 玫瑰、柑橘等香气,有强的油脂气味反式-2-癸烯醛3.51 —甜橙香气,带脂蜡样气息2-十一烯醛2.22 1.41 新鲜醛气味正己醛3.30 1.60 刺激气味正庚醛2.31 4.67 果子香气味2-庚烯醛7.95 8.91 具青草香气及刺激臭2,4-壬二烯醛0.97 0.75 奶油气味戊醛0.94 —刺激气味2-己烯醛4.40 —叶片气味总醛类31.43 25.43 丙酮0.20 5.84 微香气味2-戊酮—33.63 具酒和丙酮气味2-庚酮—364.80 奶酪味2-壬酮8.69 71.45 清新、脂肪味2-十一酮4.23 21.77 具有柑橘类油脂和芸香油似香气2-十三烷酮1.68 5.91 清新、水果味2-十五烷酮——脂肪味2-辛酮6.05 10.46 呈苹果似香气3-戊酮 1.28 5.56 丙酮气味
续表2
化合物名称黄油/(mg·mL-1)酶解后/(mg·mL-1)风味描述化合物名称黄油/(mg·mL-1)酶解后/(mg·mL-1)风味描述3-辛酮1.04 4.53 果实香味3-羟基-2-丁酮0.84 3.64 乙偶姻,奶油香味1-辛烯-3-酮1.44 6.24 壤香、蘑菇香气2,3-辛二酮0.26 1.12 咖啡、奶油气味总酮类25.70 534.96 丁酸乙酯0.19 34.83 脂肪臭明显,有似菠萝果香味己酸乙酯0.22 0.61 有菠萝果香气味辛酸乙酯1.20 7.77 酒香味癸酸乙酯2.03 13.28 果香和酒香香气δ-癸内酯0.53 34.31 奶油香味、椰子及桃子香气丁位己内酯—31.90 椰子油和乳脂似香气己酸甲酯17.54 —菠萝香气辛酸甲酯4.81 —苹果、梨气味δ-十二内酯—10.79 奶油香味、果香香气δ-辛内酯—13.67 椰子、可可香气乙酸乙酯—4.93 香蕉或苹果水果香γ-十一烷内酯—2.28 桃子气味总酯类26.52 154.36
注：“—”表示该物质未检出
2.4 酶解温度对风味的影响
酶解产物中的挥发性成分随着酶解温度的升高而发生改变。不同酶解温度下酸类、醛类、酮类、酯类物质含量如图3-a和图4所示。在35～50 ℃时，随着酶解温度的升高，酸类化合物含量明显增加；醛类、酮类、酯类物质的变化范围相对不明显。在高温下，可能会发生如乳脂的氧化、乳蛋白的变性以及乳糖和氨基酸之间的美拉德反应等一系列副反应[21]。另外温度过高可能会导致一些成分挥发，并且酸类物质含量过高会产生酸败气味。不同酶解温度下产物的感官评分如图5所示，酶解温度为40 ℃时感官评价较好，因此认为40 ℃是LOX酶解黄油强化风味的适宜温度。
2.5 酶解时间对风味的影响
不同酶解时间下挥发性成分的含量如图3-b和图4所示，感官评分如图5所示。酶解产物中的挥发性成分的总量在1～3 h不断增加，其中酸类物质含量增加明显，醛类、酮类、酯类物质的变化范围相对不明显。酶解时间过长也会导致酶解体系酸含量过高，产生酸败风味，1 h时感官评价较好，因此认为1 h是LOX酶解黄油强化风味的适宜温度。
a-酶解温度；b-酶解时间
图3 酶解温度和时间对风味的影响
Fig.3 Effects of temperature and reaction time on flavor
图4 不同酶解产物中挥发性成分热图
Fig.4 Heat map of volatile components of different enzymatic hydrolysis products
GC-MS数据的主成分分析(principal component analysis，PCA)结果如图6所示，第一主成分(PC1)的贡献率为59.7%，第二主成分(PC2)的贡献率为15.1%，LOX酶解黄油前后样品分离明显。将灭活后的LOX粗酶与黄油在40 ℃反应1 h，其结果与黄油、酶解后、LOX粗酶样品均具有明显差异，基本可以排除大豆LOX粗酶本身带来的风味影响。
图5 不同酶解产物的感官评分
Fig.5 Sensory evaluation scores of different enzymatic hydrolysis products
图6 不同酶解产物的挥发性成分主成分分析
Fig.6 Principal component analysis of volatile components of different enzymatic hydrolysis products
3 结论
从市售大豆中提取LOX粗酶并研究其酶学性质，发现LOX粗酶的最适反应温度为40 ℃，最适反应pH为7.0。采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用方法，对LOX粗酶酶解黄油后产物中的挥发性成分进行检测分析，挥发性成分达到48种，己酸、辛酸、丁酸、2-壬酮、2-庚酮、δ-癸内酯、丁位己内酯等成分含量显著增加，这些是形成乳制品风味的重要组成成分。酶解的温度、时间等因素条件对LOX酶解后的挥发性成分有一定影响，结合GC-MS数据及感官评价结果，最终确定增强乳香的酶解工艺条件为温度40 ℃，酶解时间1 h。酶解后的产物奶香浓郁柔和、香气协调性好、整体接受性高，可作为天然的奶味香精在乳制品中应用。
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