近年来,生物活性肽因具有抑制高血压、抗凝血、抗肿瘤等多种生物活性而被广泛关注[1]。其中,海洋蛋白源活性肽因具有结构复杂、种类多、活性强和低副作用等优点[2],在健康食品、药品、化妆品等领域具有广阔的应用前景[3]。多肽的生物活性主要由分子大小、氨基酸种类和排序决定的[4],不同来源、不同酶解方法制备得到的多肽功效不同。鲭鱼又名鲐鱼,主要分布在西太平洋及大西洋的海岸附近,是我国重要的经济鱼种[5]。鲭鱼作为一种高蛋白的经济鱼类,主要用于直接食用,资源利用率低,其经济价值未被充分挖掘。鲭鱼含有相当大比例的肌肉蛋白[6],这部分肌肉蛋白营养价值高,氨基酸组成均衡,同时还含有多种生理功能的生物活性肽等物质。鲭鱼多肽的生物学功能的探索是实现鲭鱼的高值化利用和深度开发的一个方向。
随着生活水平的提高,我国高血压人群日趋增多。血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)通过将血管紧张素I转化成血管紧张素Ⅱ,从而使得高血压升高。目前大多数降血压药都是通过降低该酶的活性达到降低高血压的目的。高血压患者一般通过服用卡托普利等药物抑制ACE活性进而达到控制血压的目的,这类药物普遍具有一定的毒副作用。因此,寻找更为安全无副作用的降血压方式是每一位高血压患者的迫切需求。食物来源的抑制ACE活性的多肽可有效降低血压,无毒副作用,可作为抑制高血压的功能性食品以替代降压药[7]。近年来,许多研究发现海洋来源的多肽对ACE具有一定的抑制效果。SUN等[8]从海洋大球藻Ulva intestinalis中提取的多肽,经分离纯化后,得到2条新型ACE抑制多肽,半抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)分别为0.183、0.179 mg/mL。JIANG等[9]利用碱性蛋白酶提取的琵琶鱼多肽具有较好的ACE抑制活性。
吐司面包口味丰富多样,食用方便快捷,并且易于消化和吸收,在快节奏的生活中深受人们喜爱。然而市面上的面包产品对功能性方面的关注较少。随着生活水平逐步提高,消费者对食品的追求不再局限于口感风味,而是更关注其营养价值和保健功能。
本研究以鲭鱼肌肉为原料酶解制备了鲭鱼多肽,对其抗氧化活性和ACE抑制活性进行评价,然后将所得的鲭鱼活性肽应用到吐司面包中,探讨鲭鱼活性肽对面包的比容、含水量、色泽及质构特性的影响,并对面包水提取物的抗氧化活性与ACE抑制活性进行评价,以期为今后开发功能性的烘焙食品提供参考。将鲭鱼降血压活性肽加入到面包中,不仅可以提升面包的营养价值,还能让高血压患者通过食疗控制血压,减少药物的摄入,为今后开发适合高血压人群的营养休闲食品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲭鱼活性肽,实验室自制。新良原味面包粉、太古一级糖霜、安琪高活性干酵母、安佳无盐黄油、盐(闽盐·精选自然盐)、伊利纯牛奶,市售。DPPH,上海阿拉丁;30% H2O2 ,广东西陇科学股份有限公司;FeSO4·7H2O、水杨酸、无水乙醇(均为分析纯),上海国药集团;ACE Kit-WST A502,日本同仁化学;四硼酸钠、DL-丝氨酸、DL-二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)(均为分析纯),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)(分析纯), 邻苯二甲醛( O-phthalaldehyde, OPA)(97%),上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BM1352B-3C面包机,广东东菱电器有限公司;Hauswirt F50电烤箱,宁波宜德电器有限公司;TA-XTPlus质构分析仪、P/36R 圆柱形平底探头,英国Stable Micro Systems 公司; ADCI-60-W全自动色差计,北京辰泰克仪器技术有限公司;DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱,上海森信实验仪器有限公司;Infinite M200 Pro酶标仪,瑞士帝肯;FD-2型冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 鲭鱼活性肽的制备
鲭鱼活性肽制备采用碱性蛋白酶酶解[10]。取鲭鱼鱼肉80 g,使用高速分散器粉碎后,按料液比1∶3(g∶mL)加入去离子水,搅拌均匀后,置于沸水浴中15 min,使鱼肉中的酶失活。自然冷却至室温。水浴锅温度设置为50 ℃,调pH 8.5,蛋白酶添加量为3 000 U/g,酶解时间2 h。酶解结束立即置于100 ℃ 沸水浴10 min灭酶。冷却后离心,4 ℃,8 000 r/min,20 min,上清液冷冻干燥,放置在-80 ℃保存备用。
1.3.2 鲭鱼活性肽水解度、肽分子质量测定
活性肽水解度的测量采用OPA法[11],具体如下:准确称取3.810 g 十水合四硼酸钠和0.100 g SDS,溶解在75 mL的去离子水中,充分溶解;称取0.080 g OPA,溶解在2 mL乙醇中,将该OPA溶液转移到上述“四硼酸钠-SDS”溶液中,用少量去离子水洗涤容器2～3次以确保OPA全部转移;称取0.088 g DTT加入到上述溶液中,搅拌至充分溶解后,定容到100 mL。以丝氨酸为标准品作标准曲线。量取3 mL OPA,加入400 μL丝氨酸标准溶液,混合5 s,利用紫外分光光度计在340 nm处测量吸光度,空白用去离子水代替丝氨酸溶液,样品测定时用样品代替丝氨酸溶液,静置2 min后测定吸光度。水解度(degree of hydrolysis,DH)计算如公式(1)～公式(3)所示:
(1)
(2)
(3)
式中:c丝氨酸-NH2,丝氨酸-NH2浓度，mmol/L,W丝氨酸-NH2,每克蛋白质中含丝氨酸-NH2的量,mmol/g;m:样品质量,g;ω,样品中蛋白质质量分数,%;V,样品水解液体积,L;N:水解液稀释倍数;h,水解过程中,每克蛋白被断裂的肽键数,mmol/g,对于鱼产品而言,htot=8.6,α=1,β=0.4。
分子质量测定采用液相色谱测定。具体条件如下:色谱柱TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm;流动相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;检测UV220 nm;流速0.5 mL/min;柱温30 ℃ 。以细胞色素C(MW12400)、杆菌酶(MW1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189) 作为分子质量标尺。称取样品100 mg于10 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,用0.45 μm 微孔过滤膜过滤后供进样。
1.3.3 面包的初始配方
本研究采用表1所示配方作为面包的基础配方,探究鲭鱼活性肽添加量为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(质量分数)时对面包品质的影响。
表1 吐司面包基础配方
Table 1 Basic formula of toast bread
原料质量/g添加量1/%高筋面粉250100糖粉 4016盐 31.2黄油 208酵母 52鸡蛋 5020
注:1以高筋面粉的质量分数计算
1.3.4 工艺流程
本研究的面包制作采用二次发酵法,生产工艺流程如图1所示。
图1 面包制作工艺
Fig.1 Bread making process
1.3.5 面包比容的测定
面包比容的测定参考王宝贝等[12]的测定方法。
1.3.6 面包含水量的测定
参照GB/T 5009.3—2016 《食品中水分的测定》,采用直接干燥法测定面包中的水分。
1.3.7 面包色泽的测定
面包芯色泽采用ADCI-60-C全自动测色差计测定。面包冷却至室温后进行切片处理(切片厚度为10 mm),用色差仪测定面包芯的亮度(L)、红绿度(a)和黄蓝度(b)值。
1.3.8 面包质构的测定
采用英国SMS公司的TA.XT Plus质构仪测定面包的硬度、弹性、回复性等质构参数。选用P/36R的圆柱形平底探头,质构参数:触发力5 g,测前速度1 mm/s,测试速度3 mm/s,测后速度3 mm/s;压缩至样品原高度的50%,2次压缩间隔的时间为5 s[13] 。
1.3.9 生物活性的测定
面包水提物的提取、DPPH自由基和羟自由基(·OH)的清除率参考王宝贝等[12]的方法,ACE抑制率的测定采用酶试剂盒检测(日本同仁化学,ACE it-WST A502)[14]。
2 结果与分析
2.1 鲭鱼多肽的生物活性及分子质量
上述酶解制备的鲭鱼多肽水解度为10.3%,平均分子质量为727 Da。其中,分子质量<2 000 Da的多肽占94.50%,表明该酶法制备的鲭鱼多肽主要为小分子多肽,容易被人体吸收[15]。将鲭鱼多肽配制成不同浓度的多肽溶液,分析其生物活性。由表2和图2可知,本研究制备的鲭鱼多肽对DPPH自由基和·OH均有较高的清除能力,其对DPPH自由基和·OH的IC50分别为(1.90±0.19)、(1.99±0.09) mg/mL,比BEN SLAMA-BEN SALEM等[16]酶解的章鱼多肽和NASRI等[17]报道的虾虎鱼多肽的IC50低,说明其抗氧化活性更佳。本研究还发现鲭鱼多肽对ACE具有很好的抑制功效,其IC50为(28.53±0.57) μg/mL,低于海洋大球藻多肽[8]和琵琶鱼多肽[9]等的IC50,表明鲭鱼多肽对ACE具有更好的抑制功效。
表2 鲭鱼多肽的生物活性
Table 2 Bioactivity of mackerel peptides
生物活性IC50/(mg·mL-1)DPPH自由基清除能力1.90±0.19·OH清除能力1.99±0.09ACE抑制活性28.53±0.57
A-DPPH自由基清除率;B-·OH清除率;C-ACE抑制率
图2 鲭鱼多肽生物活性
Fig.2 Bioactive of mackerel peptides
注:X为多肽浓度,mg/mL
2.2 鲭鱼活性肽对吐司面包品质的影响
将上述制备的鲭鱼活性肽按面粉质量的0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%制作吐司面包,成品如图3所示,探究不同添加量鲭鱼活性肽对吐司面包比容、含水量、色泽及质构特性的影响。
图3 不同鲭鱼多肽添加量的面包
Fig.3 Bread with different contents of mackerel peptides
2.2.1 鲭鱼活性肽对面包比容的影响
面包的比容是面团体积膨发和气体容纳能力的直观体现,在很大程度上影响了成品面包的外观、食用口感和组织结构。鲭鱼活性肽添加量对面包比容的影响如图4所示,当添加量为0.0%时,吐司面包比容为(4.28±0.04) mL/g;当添加量分别0.5%、1.0%、1.5%和2.0%时,面包比容分别为(4.41±0.01)、(4.46±0.04)、(4.56±0.04)和(4.65±0.04) mL/g。随着鲭鱼活性肽添加量的增加,面包比容显著增大。靳凤芳等[18] 也发现添加大豆肽和鱼皮肽能有效改善面包比容。这可能是由于活性肽提高了面团的蛋白含量,改善了面团的空气保持能力,进而使面包比容增大。另外,小分子肽更易于被酵母吸收利用,为酵母提供氨基酸等营养成分,促进酵母繁殖、提高其产气能力增强,从而使面包的比容增加。
图4 鲭鱼多肽对面包比容的影响
Fig.4 Effect of mackerel peptide on bread specific volume
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2.2 鲭鱼活性肽对吐司面包含水量的影响
如图5所示,随着鲭鱼活性肽添加量的增加,面包含水量略有增加。当活性肽添加量提高至2.0%时,面包含水量为(66.89±0.18)%。多肽对面包含水量的影响主要与其氨基酸序列有关,含极性基团较多的多肽与水分子的结合能力较强,吸水性和保水性较好,有利于提高面包的含水量[19]。本研究结果发现鲭鱼活性肽对面包含水量影响甚微,这可能与其氨基酸序列有关。此外,本研究的多肽添加量比较少,也是造成影响不显著的原因之一。
图5 鲭鱼多肽对面包含水量的影响
Fig.5 Effect of mackerel peptide on bread moisture
2.2.3 鲭鱼活性肽对面包色泽的影响
面包色泽的变化主要是由原料本身色泽、糖类物质和游离氨基酸发生美拉德反应及酚类物质在焙烤过程中氧化所造成[20]。如表3和图6所示,面包芯的L值保持在73.46±1.64～71.23±1.15,变化不大,说明鲭鱼活性肽的添加对整体亮度影响很小。随着活性肽添加量的增加,面包芯的a值大幅下降,b值上升,分别从5.28±0.52降至0.47±0.35,从13.77±2.16上升至19.88±0.95。这表明鲭鱼活性肽的添加使得面包的红色度降低,黄色度增加。由图7可见面包芯的颜色确实随着多肽粉添加量的增加而越来越黄,这可能是由于烘焙过程中鲭鱼活性肽与面包原料发生美拉德反应[21],从而影响了面包的色泽。
表3 鲭鱼活性肽添加量对面包色泽的影响
Table 3 Effect of mackerel peptide on the color of bread
指标鲭鱼活性肽添加量0%0.5%1.0%1.5%2.0%L73.46±1.64a73.14±1.59a72.86±0.39ab72.17±0.28ab71.23±1.15ba5.28±0.52a4.37±1.15ab2.61±0.63bc1.08±0.39cd0.47±0.35db13.77±2.16b14.09±0.46b17.98±1.03a18.29±3.61a19.88±0.95a
注:同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2.4 鲭鱼活性肽对面包质构的影响
面包的质构参数很大程度上决定了感官指标中形态与口感得分,能够较为直观地反映面包内部的各项物理指标如组织结构、松软程度等。表4展示了不同鲭鱼活性肽添加量对面包芯质构指标的影响。随着鲭鱼活性肽添加量的增加,面包硬度逐渐减小,当添加量达到2.0%时,面包的硬度比对照组减小了46.40%,这可能是因为鲭鱼活性肽与淀粉分子结合改变了面团水分分布,控制了水分的迁移,使水分分布处于均匀状态,从而延缓了淀粉老化,降低了面包硬度,使面包品质得到改善[22]。除此之外,鲭鱼活性肽具有一定的吸水能力,随着鲭鱼活性肽添加量的增加,可能会降低面团的吸水率,从而抑制面筋网络的形成,最终导致面包的硬度显著降低[23]。鲭鱼活性肽的添加使面包的弹性和黏聚性略有降低,但并不明显。面包胶着性、咀嚼度和回复性等指标随鲭鱼活性肽添加量的增大而减小。
图6 不同鲭鱼多肽添加量的面包芯
Fig.6 Bread core with different contents of mackerel peptides
表4 鲭鱼活性肽对面包质构的影响
Table 4 Effect of mackerel bioactive peptides on bread texture
指标鲭鱼活性肽添加量0%0.50%1.0%1.50%2.0%硬度 351.02±24.44a326.43±16.87a268.29±18.43b230.67±22.11c188.13±14.35d弹性 1.00±0.03a0.94±0.02b0.95±0.05b0.94±0.02b0.95±0.02b黏聚性0.80±0.04a0.74±0.01ab0.76±0.05ab0.75±0.02b0.77±0.03b胶着性281.62±12.86a242.13±13.23b203.17±22.17c171.50±16.69d144.03±6.70e咀嚼性280.84±11.79a228.65±10.48b193.68±28.55c158.63±16.58d136.48±6.59d回复性0.33±0.01a0.28±0.03a0.28±0.05b0.25±0.01c0.22±0.02d
2.3 鲭鱼活性肽对面包生物活性的影响
鲭鱼活性肽具有较好的抗氧化和ACE抑制活性,且分子质量小,易于被吸收利用。将鲭鱼活性肽添加到吐司面包中后,面包仍然保持较好的抗氧化活性和ACE抑制活性(图7)。面包水提物对DPPH自由基与·OH的清除率均随着鲭鱼活性肽的添加量的增加而显著提高(P<0.05)。当鲭鱼活性肽添加量为2.0%时,其对DPPH自由基和·OH的清除率分别为(33.98±1.64)%(对照组的1.58倍)和(32.87±1.47)%(对照组的1.71倍)。由图7 可知,鲭鱼活性肽添加量为0.0%时,面包并不具有ACE抑制活性,当添加鲭鱼活性肽后,面包水提物对ACE却有明显的抑制效果。当鲭鱼活性肽添加量为2.0%后,其ACE抑制率提高到(82.39±0.12)%。该结果表明,经过高温焙烤后,鲭鱼活性肽仍然保持较好的抗氧化能力和对ACE的抑制活性。因此在吐司面包中添加适量鲭鱼活性肽能有效提高面包提取液的抗氧化能力并赋予其抗高血压的功能特性。
A-DPPH自由基清除率;B-·OH清除率;C-ACE抑制率
图7 鲭鱼活性肽面包水提物的生物活性
Fig.7 Bioactive of bread aqueous extract with mackerel peptides
3 结论
本研究用碱性蛋白酶水解鲭鱼鱼肉制备得到了具有较佳抗氧化活性和ACE抑制活性的鲭鱼活性肽。该多肽平均分子质量为727 Da,其对DPPH自由基和·OH的IC50分别为(1.90±0.19)、(1.99±0.09) mg/mL,抑制ACE的IC50为(28.53±0.57)μg/mL。将鲭鱼活性肽添加到吐司面包中可以显著提高面包的抗氧化活性,并赋予面包抑制ACE活性的功效。当添加量为2.0%(质量分数)时,DPPH自由基和·OH的清除率分别比未添加时增加了70.69%和55.87%,ACE抑制活性则从0增加至(82.40±0.12)%。鲭鱼活性肽的添加对面包含水量无显著影响,但是使面包的比容略有增大,硬度、胶着性、咀嚼性和回复性则显著减小。该研究结果表明鲭鱼活性肽用于吐司面包等烘焙产品,不仅能够提高面包的食用营养价值与烘焙品质,还可以作为抗高血压的功能性食品,为今后开发鲭鱼活性肽在烘焙食品中的应用提供一定的参考。
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