作为传统的发酵蔬菜制品,泡菜常以卷心菜、白菜、辣椒和萝卜等为主要原料,添加少量食盐和花椒等佐料腌渍而成,因具有酸脆爽口的独特风味而深受消费者的喜爱[1]。我国多数地区都有制作和食用泡菜的习俗,但因地域、原材料和制作方式存在差异,导致各地的泡菜种类不尽相同[2],总体可分为泡渍泡菜和盐渍泡菜两大类[3]。泡菜中乳酸菌的多样性和丰度均较高,CAO等[4]采用纯培养方法从重庆地区采集的126份传统四川泡菜老盐水样品中分离鉴定出240株乳酸菌,分属于4个菌属的16个菌种。XIAO等[5]通过基因测序、预测功能和相关性分析发现,乳酸杆菌(Lactobacillus)在江西腌菜、四川泡菜和东北酸菜中均占有高达77.6%的比例,并发现3种传统泡菜中乳酸菌与超过20种风味化合物紧密相关,碳水化合物、氨基酸和核苷酸代谢为其主要的代谢特征。由此可见,积极开展泡菜制品微生物类群和产品品质的关联性分析,对提升泡菜的风味品质具有重要作用。
电子舌[6]和电子鼻[7]仿生学技术具有灵敏度高和稳定性好等特点,可全方位并多角度地实现食品滋味和风味品质的数字化评价,被广泛用于调味品[8]、乳制品[9]和肉制品[10]等相关研究领域。郭壮等[11]使用电子舌和电子鼻技术对安康地区泡菜水品质进行评价,并对泡菜水品质和细菌多样性的关联性进行了研究,发现泡菜水的菌群结构和品质结构呈现显著相关,其中Lactobacillus对泡菜品质的形成具有重要作用。五峰土家族自治县地处鄂西南边界,境内沟壑纵横、峰峦重叠、垂直气候带谱明显,是一个以土家族和汉族为主的多民族自治县,当地居民亦具有制作和食用泡渍泡菜的风俗习惯。然而,目前有关五峰土家族自治县泡菜品质特征与乳酸菌种类之间是否存在联系的研究尚少。
本研究立足区域特色,使用电子舌和电子鼻联用技术对采自湖北省宜昌市五峰土家族自治县的17个泡菜水滋味和风味品质进行评价,并采用纯培养技术对其蕴含的乳酸菌进行分离和鉴定,以期使关于我国泡菜品质和微生物类群研究的数据更为丰富,同时为后续泡菜的相关研究提供菌株支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
泡菜水购于五峰新县城菜市场、大房坪农贸市场、古潭农贸综合市场和五峰镇菜市场,共购买17个样品,样品均为使用五峰土家族自治县(E111°15′～111°25′,N29°56′～30°25′)自产的辣椒为主要原料制作。
1.1.2 试剂
电子舌测试配套溶液,日本Insent公司;MRS和LB培养基,青岛海博生物技术有限公司;十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)、乙酸钠、乙醇、酚、氯仿和异戊醇,国药集团化学试剂有限公司;PCR buffer、dNTP mix、r Taq酶、Solution I、pMD18-T载体和Loading buffer,宝生物工程(大连)有限公司;DL 2000 Marker,宝日医生物技术(北京)有限公司;引物27F/1495R和M13F(-47)/M13R(-48),武汉天一辉远生物科技有限公司;Axygen PCR清洁试剂盒,康宁生命科学吴江有限公司;Escherichia coli top10,湖北省食品配料工程技术研究中心制备。
1.2 仪器与设备
5810R台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;SA402B型电子舌(5个传感器),日本Insent公司;PEN3型电子鼻(10个传感器),德国Airsense公司;DG250型厌氧工作站,英国Don Whitley公司;Veriti FAST梯度PCR仪,美国ABI公司;164-5050基础电泳仪,美国Bio-Rad公司;UVPCDS8000凝胶成像分析系统,美国Protein Simple公司。
1.3 实验方法
1.3.1 泡菜水样品的滋味评价
采集的泡菜水以300 r/min离心10 min去除残留杂质,取40 mL上清液与80 mL的超纯水混合均匀后以8 000 r/min离心5 min,最后取上清液待测。研究使用王玉荣等[12]的方法并稍作修改,对上清液中5个基本味和3个基本味的回味进行测定,每个样品测试4次,选用后3次的平均值作为原始数据,进行后续分析。因SA402B电子舌每次可对10个样品滋味品质进行测定,故而纳入本研究的17个样品共需2批次完成测试,为减少系统误差对数据结果的影响,在每轮次测试过程中1号位均放置实验室自己制作的泡菜水作为对照组,即第1轮次测试对照组和A1～A9号样品,第2轮次测试对照组和A10～A17样品。每轮次测试完成后所得各样品的各滋味指标强度减去本轮次对照组样品各滋味指标的强度即可得该样品各指标的相对强度值,因2批次所得数据矩阵中对照组样品各指标数据均为0,故而可以将2批次测试数据进行合并,并在此数据矩阵基础上开展后续多元统计学分析。
1.3.2 泡菜水样品的气味评价
取15 mL泡菜水于50 mL样品瓶中,先放于50 ℃ 水浴锅加热30 min,再放于室温平衡15 min后待测。研究使用杨淑花等[13]的方法并稍作修改,最终在60 s的测试时间中选用第49、50、51 s时各传感器响应值的平均值作为原始数据,进行后续分析。
1.3.3 泡菜水中乳酸菌的分离与纯化
使用倍比稀释法将各泡菜水样品从10-1稀释至10-6梯度,选取10-4、10-5和10-6梯度的稀释液涂布于添加1.0%(质量分数)碳酸钙的MRS固体平板中,在30 ℃厌氧条件(85%N2,10%H2和5%CO2)下倒置培养48 h,挑取形态、大小和颜色等各不相同且具有透明圈的单菌落[14]连续划线3次后转接于 5 mL MRS液体试管中30 ℃培养24 h,最后收集过氧化氢酶实验阴性且革兰氏染色阳性菌株的菌体,添加1 mL 30%(体积分数)的甘油,冻存于-80 ℃冰箱备用。
1.3.4 泡菜水中乳酸菌的鉴定及登录号的申请
CTAB法提取乳酸菌分离株的DNA[15],进而以DNA为模板并参考蔡宏宇等[16]的扩增体系与程序进行PCR扩增。待扩增结束后,取2.5 μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,选用条带清晰且无明显拖尾现象的扩增产物进行清洁,再将清洁产物连接至pMD18-T载体,转化到Escherichia coli top10中,挑取鉴定结果为阳性的克隆子寄往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序,拼接返回的测序结果于美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnolo- gy Information,NCBI)进行比对分析,从而确定乳酸菌分离株的种属关系。最后将分离菌株的序列上传至GeneBank数据库,获得MT211319-MT211376的登录号。
1.3.5 统计分析
使用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)和主成分分析法(principal component analysis,PCA)进行泡菜水滋味与风味品质分析,使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验进行不同聚类间的差异性分析。
使用R软件(v3.6.2)的vioplot、ggpubr和ggplot2软件包绘制小提琴图,pheatmap软件包绘制乳酸菌分离株的热图,使用Origin 2017软件绘制其他图。
2 结果与分析
2.1 泡菜水的滋味品质评价
使用电子舌对采自五峰土家族自治县的17个泡菜水的滋味品质进行分析评价,绘制各滋味指标相对强度值的小提琴图,如图1所示。
图1 泡菜水各滋味指标的相对强度值
Fig.1 Relative intensity values of each taste index of Paocai brine samples
由图1可知,泡菜水在酸味指标上的差异最大,极差值为25.71;在咸味、涩味和鲜味上次之,极差值分别为17.1、16.21和10.4,但在苦味、后味B(苦味的回味)、后味A(涩味的回味)和丰度(鲜味的回味)指标上的差异相对较少,极差值分别为7.27、5.61、2.03和1.11。KOBAYASHI等[17]的研究表明,若样品中某一滋味指标的相对强度值之差大于1,则其差异通过感官可以评鉴出。由此可见,泡菜水在酸味指标上的差异最大,造成此现象的原因可能是不同样品中乳酸菌的构成与含量存在差异。CAO等[4]比较了3个酸度梯度泡菜水细菌类群的差异,结果发现不同分组泡菜水细菌类群存在显著差异(P<0.05),但乳酸菌仍是不同分组样品中的绝对优势菌群。
2.2 泡菜水的风味品质评价
侯爱香等[18]采用气相色谱-质谱联用和固相微萃取的方法对湖南发酵芥菜样品的挥发性风味组分进行研究,结果发现在泡菜的产香物质中酯类、醇类和萜类的含量较高,因此本研究选取了PEN3电子鼻中对芳香类、萜类和乙醇敏感的W1C、W3C、W5C、W1W和W2S传感器对泡菜水进行了检测,各传感器的响应值强度如表1所示。
由表1可知,W1W和W2S传感器对泡菜水的响应值较其余3个传感器明显偏高,说明样品中乙醇和萜类物质的含量相对较高。5个传感器响应值的变异系数均>28%,表明纳入本研究的泡菜水在芳香类、萜类和乙醇指标间的差异均较大,其中乙醇和萜类物质的差异最为显著。大量研究表明,泡菜中的香气物质主要来源于蔬菜等原料本身,同时还包括乳酸菌和酵母菌等其他微生物发酵产生的风味物质[19],因而乙醇含量相对较高可能是制作泡菜时为防止微生物污染添加的白酒、发酵中乳酸菌与蔬菜中葡萄糖产生的异型乳酸发酵[20]和酵母菌的酒精发酵所引起。
表1 电子鼻各传感器对泡菜水的响应值
Table 1 Response values of each electronic nose sensor to Paocai brine samples
传感器性能描述平均值中位数最小值最大值变异系数/%W1C对芳香类物质灵敏0.240.240.050.3330.78W3C对芳香类物质灵敏0.330.360.080.4428.00W5C对芳香类物质灵敏0.350.380.060.4833.07W1W对萜类物质灵敏 21.3614.958.6374.1679.28W2S对乙醇灵敏 7.875.734.2134.4190.49
2.3 泡菜水滋味与风味指标相对强度的多元统计学分析
在对滋味与气味评价的基础上,本研究使用非加权组平均法对各样品滋味与风味指标的相对强度进行多元统计学分析,聚类分析结果如图2所示。
图2 泡菜水滋味与风味指标相对强度的聚类分析
Fig.2 Cluster analysis of the relative intensity of taste and aroma indexes of Paocai brine samples
由图2可知,除样品A7和A11存在明显的聚类差异外,其余15个泡菜水样品亦呈现较明显的聚类关系,其中样品A2、A4、A10、A12、A14、A16和A17隶属于聚类Ⅰ,样品A1、A3、A5、A6、A8、A9、A13和A15隶属于聚类Ⅱ。
选取聚类Ⅰ和聚类Ⅱ的样品,采用主成分分析在空间上进行排布,结果发现,体现泡菜水整体滋味与风味品质的信息主要集中在前3个主成分(principal component,PC),累计贡献率为86.16%。第一主成分(PC1)由W1C、W3C、酸味、涩味和鲜味等4个指标构成,贡献率为53.43%;第二主成分(PC2)由W5C、W1W、W2S、苦味、咸味和后味B(苦的回味)6个指标构成,贡献率为23.69%;第三主成分(PC3)由后味A(涩的回味)和丰度(鲜的回味)2个指标构成,贡献率为9.04%。本研究选取第一主成分和第二主成分进行因子载荷图和因子得分图的绘制,用来比较2个聚类样品在滋味与气味上的品质差异,其结果如图3所示。
a-因子载荷图;b-因子得分图
图3 泡菜水滋味与风味指标相对强度的主成分分析
Fig.3 PCA of the relative intensity of taste and aroma indexes of Paocai brine samples
由图3可知,隶属于聚类Ⅰ的样品均位于X轴的正半轴,具有较好的酸味品质,但风味的挥发性较弱,而隶属于聚类Ⅱ的样品均位于X轴的负半轴,具有较好的风味品质。通过Moon-Median检验,发现归于PC1的4个指标在2个聚类样品间的差异极显著(P<0.001),而归于PC2的6个指标在2个聚类样品间无明显差异(P>0.05)。因而,隶属聚类Ⅰ的样品酸味和涩味偏高,而隶属于聚类Ⅱ的样品风味品质比较好。
2.4 泡菜水中乳酸菌的种群结构
本研究在对泡菜水品质进行评价的基础上,进一步采用传统微生物学方法,对其蕴含的乳酸菌菌株进行了分离、鉴定和保藏。在17个样品中共分离出57株乳酸菌,其中HBUAS56099等4株菌被鉴定为乳酸杆菌属(Lactobacillus)的戊糖乳杆菌(L.pentosus),HBUAS56098等4株菌被鉴定为植物乳杆菌(L.plan- tarum),HBUAS56111被鉴定为短乳杆菌(L.brevis),HBUAS56117被鉴定为酿酒乳杆菌(L.cerevisiae),HBUAS56104等2株菌被鉴定为类布氏乳杆菌(L.parabuchneri),HBUAS56091等4株菌被鉴定为发酵乳杆菌(L.fermentum),HBUAS56105等8株菌被鉴定为清酒乳杆菌(L.sakei),HBUAS56094等2株菌被鉴定为副干酪乳杆菌(L.paracasei),HBUAS56092等8株菌被鉴定为棒状乳杆菌(L.coryniformis),HBUAS56134被鉴定为肠球菌属(Enterococcus)的乳酸肠球菌(E.lactis),HBUAS56124等17株菌被鉴定为屎肠球菌(E.faecium),HBUAS56096等5株菌被鉴定为明串珠菌属(Leuconostoc)的肠膜明串珠菌(L.mesenteroides),部分乳酸菌分离株及其模式株的系统发育树,如图4所示。
图4 部分乳酸菌分离株及其模式株构建的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree constructed from partial lactic acid bacteria isolates and their model strains
注:选择分离株进行系统发育树构建的依据为,若隶属于某一个种的菌株数≥2株,则随机选择2株分离株进行系统发育树构建,若分离株仅有1株,则该菌株直接纳入系统发育树构建
经统计分析可知,Lactobacillus为泡菜中的优势菌属,占分离株总数的58.62%,杜晓华[21]亦得出类似结论,其研究发现四川泡菜中的细菌以Lactobacillus为优势菌,含量在各个样品中普遍较高,有的甚至达到108 CFU/mL。本研究中占比29.82%的E.faecium为泡菜水样品中分离株的优势菌种,孟令帅等[22]的研究结果与本研究相似,其通过采用传统纯培养方法分离并鉴定了辣白菜中的乳酸菌,发现在分离出的81株乳酸菌中有55.56%的分离株隶属于E.faecium。王秋霞等[23]对自然发酵和纯种发酵的大白菜泡菜在发酵过程中的乳酸菌多样性及风味品质进行了研究,发现自然发酵泡菜中挥发性风味物质与有机酸的种类和含量较之纯种发酵的泡菜更为丰富。因此,为解析五峰泡菜水样品的品质与乳酸菌的关联性,本研究绘制了乳酸菌分离株的热图,如图5所示。
图5 泡菜水样品中乳酸菌分离株的热图
Fig.5 The heatmap of lactic acid bacteria isolated from Paocai brine samples
由图5可知,2个聚类样品中均存在L.corynifor- mis、L.sakei 和L.mesenteroides,而L.fermentum、L.plantarum、L.pentosus、L.paracasei 和L.parabuchneri 仅存在于聚类Ⅰ样品中,L.brevis、L.cerevisiae、E.faecium 和E.lactis 仅存在于聚类Ⅱ样品中。值得一提的是,肠球菌属虽然可以分解蛋白质和酯类等物质,产生芳香类化合物,有利于改善食品的风味,但目前大量研究表明,肠球菌作为肠道中的一类共生菌群具有一定安全风险[24],并不建议在食品中使用。结合图3和图5可知,具有较好酸味和咸味品质的A4和A17样品,其分离菌株全部隶属于Lactobacillus;具有较好酸味品质但咸味相对较弱的A2、A10和A14样品,其分离菌株中有88.89%隶属于Lactobacillus,其余隶属于Leuconostoc;在酸味上相对较弱但具有较好咸味品质的A1和A5样品,其分离菌株中有75%隶属于Enterococcus,其余隶属于Lactobacillus;在酸味和咸味品质上均相对较弱的A8、A9和A13样品,其分离菌株中Enterococcus 和Lactobacillus 的含量上并无较明显的区别。HAGHSHENAS等[25]的研究表明,隶属于Enterococcus 的菌株具有双层膜结构,使得其耐高渗透压的能力较强[25]。罗强等[26]的研究表明,从中国北方4个不同地区传统自然发酵泡菜样品中分离得到的乳酸菌在pH值低于4.0的发酵液中培养24 h后约有94.9%的存活株隶属于Lactobacillus[26]。由此可见,样品的咸味品质表达越强,Enterococcus 的含量相对增加,酸味品质表达越强,Lactobacillus 的含量相对增加,造成这种现象的原因可能与不同类型乳酸菌的耐受能力不同有关。
2.5 泡菜水中乳酸菌分离株的α多样性分析
研究进一步对2个聚类样品中代表乳酸菌菌群多样性的香农指数和代表乳酸菌菌群丰富度的超1指数进行了分析,构建的箱型图如图6所示。
a-香农指数;b-超1指数
图6 隶属于聚类Ⅰ和聚类Ⅱ泡菜水蕴含乳酸菌分离株的多样性分析
Fig.6 The α-diversity analysis of lactic acid bacteria isolates affiliated with cluster Ⅰ and cluster Ⅱ Paocai brine samples
注:NS代表差异性不显著(P>0.05);*代表差异性显著
(P<0.05)
由图6可知,隶属于聚类Ⅰ和聚类Ⅱ样品其乳酸菌类群多样性差异不明显(P>0.05),而聚类Ⅰ样品的乳酸菌丰富度显著高于聚类Ⅱ样品(P<0.05)。结合图3可知,隶属于聚类Ⅰ的泡菜水口感更酸,其蕴含的乳酸菌丰度也较高。通过对新、老泡菜水中乳酸菌的类群进行解析,付莎莉[27]发现老泡菜水pH值更低,其乳酸菌菌群丰度和多样性均比新泡菜水丰富,并且群落具有较高的稳定性,受发酵环境的影响较小。由此可见,泡菜的酸度对其乳酸菌类群的构成具有明显的影响。
3 结论
五峰土家族自治县泡菜水样品在滋味和风味品质上均有较大的区别,并且以酸味、乙醇和萜类物质的差异最为明显。研究亦发现,泡菜水中乳酸菌的多样性和丰富度均较高,并且咸味越突出的样品中Enterococcus 的含量越丰富,酸味越突出的样品中Lactobacillus 的含量越丰富。
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