单宁作为葡萄酒中重要的酚类物质，对葡萄酒的颜色、香气、结构感和陈酿潜力等有重要的影响。葡萄酒中的单宁主要被分为2种：来源于葡萄果实的重要次生代谢物[1-2]缩合单宁(原花青素)和来源于橡木桶陈酿或添加的外源性酚类的水解单宁。缩合单宁是葡萄酒中的主要呈色物质，分为类黄酮物质(黄烷-3-醇)、黄酮类物质、花色苷类和黄烷醇类(主要代表为儿茶酚)[3]；水解单宁衍生自β-D-吡喃葡萄糖羟基与没食子酸或六羟基联苯酸之间的酯化作用，儿茶素及鞣花酸(也被称为联苯三酚酯和鞣花酸酯)含有脂键，被称为可水解的多酚，是水解单宁的主要类型[4]。
在酿造葡萄酒的过程中，研究人员添加橡木制品或单宁产品，来辅助澄清葡萄酒、稳定颜色、防止还原风味的产生[5-7]。FREDRICKSON等[8]通过添加高浓度的外源单宁(400 mg/L)来提高红葡萄酒中浓缩单宁的浓度，以提高葡萄酒的结构感。JORD
O等[9]添加6种不同的商业酿酒单宁，发现葡萄酒中总花青素含量明显提高，在陈酿期间表现出更高的抗红色调衰退能力。酿酒师会在葡萄酒酿造的多个阶段组合添加外源单宁产品，充分发挥其护色固色、增强口感协调性、捕获硫化物的功能[10-11]，以提高葡萄酒的香气复杂性和感官特性[12]，因此，在改良葡萄酒生产工艺的过程中，合理地使用单宁可以提高葡萄酒的质量和稳定性，并保证葡萄酒良好的贮藏性[13]。研究者通常使用不同的商业单宁产品用于葡萄酒酿造，在葡萄酒酒精发酵阶段配套添加一种单宁产品对葡萄酒质量的影响还暂无研究阐述。近几年由于商业单宁产品的不断改革优化，本研究证明了配套使用一种单宁产品也可以有效改善葡萄酒品质。
在实际酿造过程中，由于葡萄质量的差异或酿造工艺的不同，单宁浸出物差异较大，造成干红葡萄酒口感协调性差、陈酿过程中褪色较快等问题。本研究基于生产实践中的工艺需求，利用有效的配套单宁添加工艺，通过分析葡萄酒的风味理化指标和香气感官特征获得了颜色稳定、风味良好的高品质葡萄酒，为大生产的工艺改良优化提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验葡萄品种为赤霞珠(Cabernet Sauvignon)；外源单宁选择贝丹2号(护色单宁)、贝丹1号和贝丹5号，上海鼎唐国际贸易有限公司。
主要试剂：乳酸菌、橡木片，宁夏新慧彬酒庄;偏重亚硫酸钾、没食子酸标准品、福林-肖卡试剂、Na2CO3、KCl、儿茶素、果胶酶等,北京索莱宝科技有限公司；酵母CECA,安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)装置配有57330-U联用手柄、DVB/CAR/PDMS萃取纤维(50/30 μm，2 cm)，美国Supelco公司；7890B气相色谱仪、5975B质谱仪，美国安捷伦公司；DB-WAX毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)。
1.3 实验方法
参考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》测定葡萄酒发酵阶段的基本理化指标。
1.3.1 葡萄酒酿造
对照组为酿造过程中未添加外源单宁产品的酒样，处理组为酿造过程中配套工艺添加外源单宁产品的酒样。取样时间：在酒精发酵结束后进行取样冻存。每项实验设置3个重复。
发酵试验筛选成熟度良好、卫生合格的葡萄浆果，除梗破碎，葡萄原料的总糖含量为247.5 g/L。入罐时加入100 mg/L的偏重亚硫酸钾、30 mg/L的果胶酶，总酸含量调整到7.0 g/L左右，初始pH值为3.42。低温(8～10 ℃)浸渍3 d，回温后接种酵母CECA 150 mg/L，启动发酵，每12 h压帽，测比重、温度。发酵中前期(比重在1 070左右)温度控制在13～17 ℃，发酵中期(比重在1 040～1 060)温度控制在25 ℃左右，发酵后期温度控制在22～26 ℃。还原糖含量<4 g/L，比重<993进行皮渣分离，添加100 mg/L的偏重亚硫酸钾，进行基本理化指标分析。静置澄清后分离转罐。单宁添加具体方案见表1。
表1 外源单宁添加的类型时期及用量
Table 1 Type, period and dosage of exogenous tannins added
对照酒样处理酒样添加时期无起酵后比重1 080比重1 040单宁名称无贝丹2号贝丹1号贝丹5号使用量/(mg·L-1)0505060
1.3.2 多酚、颜色指标测定
总酚含量根据OIV-MA-BS-19《Overall determination of phenolic compounds in spirituous beverages of viti-vinicultural origin without added caramel》标准中福林酚法测定(以没食子酸计)；单宁含量用甲基纤维素—单宁沉淀法[14]测定；黄烷醇(以儿茶素计)、酒石酸脂和黄铜醇含量(以咖啡酸计)采用紫外分光光度计法检测，黄烷醇的吸收波长为640 nm，黄酮醇类物质的黄色波段吸收波长为360 nm，酒石酸酯的吸收波长为 320 nm；总花色苷含量测定参考LEE等[15]的pH示差法，按公式(1)计算。
(1)
式中：R，总花色苷含量(以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计)，mg/L；A=(A520 nm-A700 nm)pH 1.0-(A520 nm-A700 nm)pH 4.5；Mw，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的分子质量，449.2 g/mol；DF，样品稀释倍数。
颜色指标参照OIV-MA-AS2-11《Determination of chromatic characteristics according to CIELab》(2006)标准进行测定和表示，明度值(L*)保留1位小数，红/绿指数(a*)、黄/蓝指数(b*)、彩度(C*)、色调角(H*)和色差ΔE*等保留2位小数。实际测量时使用色差仪和10 mm石英比色皿测定，色差仪参数为液体测量，标准观察者角度为10°，光源为D65标准白光源。
1.3.3 香气化合物检测
使用SPME/GC/MS仪器对标准溶液和酒样进行检测，气相色谱条件：色谱柱HP-INNOWAX(60 mm×0.25 mm×0.25 μm)。柱温箱升温程序为50 ℃恒温1 min，以3 ℃/min的速度升温至220 ℃，保持5 min。质谱条件：质谱接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，EI电离方式，离子能量70 eV，质谱扫描范围29～350 u。每个样品重复测定3次。化合物定性与定量：使用安捷伦公司的Masshunter定性和定量软件，通过香气标准品的保留时间和质谱图解析对色谱峰进行定性，通过标准曲线对化合物定量。
1.3.4 葡萄酒感官评价
品评小组由11名专业的品评员组成，对葡萄酒感官风味特性(葡萄酒颜色深浅、澄清度、香气浓郁度、协调性、持久性及复杂度；口感酒体、浓郁度；单宁强度；香气描述词)进行打分，采用0～10数字标度为感官评分标尺，数字由低到高代表葡萄酒各个感官风味特征特性由弱到强的变化。
1.3.5 数据分析
数据整理和统计使用Excel 16.0，单因素方差分析、相关性分析使用SPSS 19，绘图使用Origin 2018。
2 结果与分析
2.1 供试酒样基本理化指标分析
酒精发酵结束后，葡萄酒理化指标如表2所示，2组酒样的理化指标均符合国标GB/T 15037—2006《葡萄酒》标准的规定。LIU等[16]的研究表明，酒样残糖浓度与单宁添加的品种有关，本研究中处理酒样的酒精度、pH值、挥发酸和游离二氧化硫含量与对照酒样相比无显著差异，残糖、总酸和总二氧化硫含量略有下降。
表2 酒精发酵结束时的基本理化指标
Table 2 Physical and chemical indexes measured after alcoholic fermentation
不同处理酒精度/(% vol)残糖/(g·L-1)总酸/(g·L-1)(以酒石酸计)挥发酸/(g·L-1)(以乙酸计)pH游离二氧化硫/(mg·L-1)总二氧化硫/(mg·L-1)对照酒样13.76±0.03a4.8±0.04a6.24±0.02a0.48±0.1a3.48±0.02a26.72±0.22a66.80±0.99a处理酒样13.69±0.07a4.3±0.03b6.04±0.03b0.42±0.04a3.50±0.02a25.05±0.75a65.11±0.62b
注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 多酚、颜色指标分析
2.2.1 总单宁、总酚、黄烷醇、黄酮醇、酒石酸酯和总花色苷分析
如表3所示，处理酒样的总单宁、总酚含量增加，这与LI等[17]和曲一鸣等[18]的研究结果一致，说明添加外源单宁可以提高葡萄酒的总单宁、总酚含量，使葡萄酒的“骨架感”更强[19]。处理酒样的黄烷醇和黄酮醇含量增加，说明添加外源单宁有利于黄烷醇-花青素缩合产物的生成，HJELMELAND等[20]的研究同样证实了这一观点。而处理酒样的总花色苷含量降低，葡萄酒颜色相比于对照组偏黄，FREDRICKSON等[8]认为这是由于外源单宁的添加量过多而破坏了葡萄酒的平衡。酒石酸酯是葡萄酒中的酒石酸和乙醇通过脱水生成的化合物，处理酒样酒石酸酯含量显著提高，提高葡萄酒的抗氧化能力[19]。
表3 不同处理的酒样总酚、黄烷醇、黄酮醇、酒石酸酯含量
Table 3 Contents of total phenols, flavanols, flavonols, and tartaric esters with different wine samples
不同处理总单宁/(mg·L-1)总酚/(mg·L-1)黄烷醇/(mg·L-1)黄酮醇/(mg·L-1)酒石酸酯/(mg·L-1)总花色苷/(mg·L-1)对照酒样674.55±3.26b1 778.46±87.03b572.31±1.31a188.93±0.49b124.02±0.14b228.42±9.82a处理酒样863.537±1.003a2 277.69±64.18a 620±0.87a199.05±0.36a136.93±1.90a216.37±0.6b
2.2.2 葡萄酒颜色指标分析
用色差仪测定葡萄酒的L*、a*、b*参数值，参数L*表示酒样的明暗程度；参数a*表示酒样的红绿色程度；参数b*代表了酒样的黄蓝色程度。如表4所示，标样为空白比色皿，处理酒样的明度与对照相比无显著性差异，L*相较于对照组变低，这与HJELMELAND等[20]的研究结果一致，表明添加外源单宁的葡萄酒颜色的稳定性更高，VIVAS等[21]同样也证明了这一观点，认为添加外源单宁可使乙醛诱导单宁/花青素缩合，有利于稳定和加深颜色(低L*)。处理酒样的a*变小，说明添加外源单宁后葡萄酒的红色调减少。处理酒样b*变大，说明添加外源单宁可以使酒样减少一部分蓝色调，LIU等[16]认为这是由于酒精发酵过程中添加的外源单宁抑制了大部分花青素的降解，并抑制了部分吡喃花青素的下降，从而使葡萄酒的b*值高于对照。色差值(ΔE*)、彩度(C*)、和色调(H*)是Lab值衍生的指标，ΔE*是两个物体之间颜色的总体差异，色差值>3.0时人眼可以区分2种颜色的差异[22-23]。如表4所示，酒样之间的差值不超过1.0，所以人眼不能区分各酒样的颜色差异。
表4 不同处理酒样的色度
Table 4 Chroma parameters of different wine samples
不同处理L∗a∗b∗色差(ΔE∗)彩度(C∗)色调(H∗)标样32.07-0.36-0.92---对照酒样24.39±0.1a0.55±0.09a-0.91±0.00b7.71.1-1.7处理酒样23.99±0.0a0.12±0.06b-0.69±0.00a8.10.7-5.8
2.3 葡萄酒香气成分分析
使用GC/MS仪器检测处理酒样中挥发性香气化合物的含量，结果如电子增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031202)所示。处理组酒样共检测出挥发性成分80种，对化合物按照香气类别和官能团进行分类，可以分为11类，其中数量最多的是脂肪酸乙酯类化合物，共16种。高级醇13种，其他脂肪族酯类8种，苯乙基和脂肪酸各7种，萜烯类、乙酸酯类、醛类和酚类各5种，降异戊二烯类4种，C6醇3种，硫醇和吡嗪化合物各1种。对照组香气含量414.43 mg/L，处理组香气含量为472.66 mg/L。如图1所示，处理酒样的C6醇、脂肪酸乙酯类、脂肪酸类、乙酸酯类和降异戊二烯类的含量降低，其中，2组酒样的C6醇和降异戊二烯类含量差异极显著。高级醇、硫醇、苯乙基类和酚类的含量增加，其中2组酒样的苯乙基类、高级醇、硫醇和酚类含量差异极显著。
图1 不同处理酒样的香气成分类别含量
Fig.1 Contents of different aroma component categories of wine samples with different treatments
注：小写字母表示组间差异显著(P<0.05),大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)(下同)
将OAV>0.1的香气成分进行显著性分析，香气成分含量差异极显著的如图2所示。
图2 不同处理酒样的香气成分含量
Fig.2 Contents of aroma components of different wine samples
处理酒样的壬醛和癸醛含量增加，有利于葡萄酒柑橘、玫瑰香味的产生；2-己烯酸乙酯含量的增加，有利于葡萄酒香料气味的产生；2-甲基丁酸乙酯和辛酸乙酯含量的增加有利于葡萄酒苹果、香蕉、梨等水果气味的产生；苯乙醇、苯乙酸乙酯和苯乙烯含量的增加会提高葡萄酒的玫瑰味和树脂味；己酸异戊酯含量的增加会提高葡萄酒的香蕉味和甜味。同时，处理酒样1-己醇含量大大降低，这减少了葡萄酒生青味的产生；3-羟基丁酸乙酯含量的降低也有利于平衡葡萄酒的生青味；乙酸乙酯含量的降低有利于减少葡萄酒指甲油等化学气味的产生；己酸和辛酸含量的降低，有利于减少葡萄酒酸腐等不愉悦气味的产生。处理酒样的β-大马士酮含量减少，会减弱葡萄酒的蜂蜜气味；异戊醇含量的增加会使葡萄酒产生指甲油的气味；1-庚醇、乙酸香叶酯和丁酸乙酯含量都相应减少，不利于葡萄酒产生这些成分所带来的菠萝、草莓的气味；乙酸异戊酯含量的降低不利于葡萄酒的香蕉气味的产生；虽然脂肪酸可能会对葡萄酒的香气产生负面影响，但在形成相应酯的过程中，脂肪酸参与了平衡反应，因此脂肪酸浓度增加可以提高相应酯的合成[24]。因此，添加外源单宁对葡萄酒香气成分的影响呈现较为复杂，综合多篇研究发现，这与单宁产品的添加时间[10-11]、单宁的浓度和种类[25-26]有关，但是总体来说，适当的添加外源单宁产品会有效地改善葡萄酒的品质。
2.4 葡萄酒香气感官分析
对酒样进行感官评价，并对得分进行显著性分析，结果如表5所示。
表5 不同处理酒样定量描述分析结果
Table 5 Quantitative description analysis results
for different wine samples
对照酒样处理酒样颜色深度7.38±0.02b8.00±0a澄清度10.00±0a10.00±0a香气浓郁度8.00±0b8.25±0.05a香气协调性7.25±0.25b8.25±0.05a香气发展变化及复杂度7.13±0.03b8.25±0.1a口中平衡性7.63±0.03b8.75±0.05a口中复杂性7.58±0.42b8.55±0.55a口香浓郁度7.75±0.05b8.25±0.13a酒体7.85±0b8.20±0.1a单宁强度6.75±0.05b8.50±0a总分77.29±1.2b85±0.9a香气特征(气味强度排列)果酱、生青、黑樱桃紫罗兰、黑醋栗、生青
2组酒样的澄清度没有显著差异，其他指标处理酒样得分均比对照酒样得分高，其中处理酒样的单宁强度与对照酒样差异最大，说明添加外源单宁产品可以直接增强葡萄酒的涩感和收敛性，这与王文璇等[25]的研究结果一致。表5展示了品鉴小组给的出现频率最高的香气特征描述词，处理酒样的紫罗兰、黑醋栗的气味有所上升，生青味减弱，说明添加外源单宁产品可以有效地减少葡萄酒的生青味，这与香气分析结果一致。
绘制定量描述分析数据的雷达图,如图3所示，处理酒样的颜色比对照组酒样深。2组酒样的香气浓郁度表现相似，但在香气协调性,香气发展变化和复杂度上，处理酒样得分更高。在口感指标中(口中平衡性、口中复杂性、单宁强度和口中浓郁度)，处理酒样的得分均比对照组酒样得分高。综上所述，在颜色、香气质量、口感质量以及单宁质感3方面，添加外源单宁的酒样表现更佳。
图3 不同处理酒样的感官指标定量描述分析雷达图
Fig.3 Radar map of QDA sensory indicators with
different wine samples
3 结论
本研究以宁夏产区的赤霞珠葡萄为酿酒原料，在20 L的发酵罐中进行发酵试验。在酿造过程中配套添加一种单宁产品，以不添加单宁产品的酒样为对照，通过分析处理组葡萄酒的风味理化指标、CIELab颜色参数、感官和香气特征的变化情况，研究其对赤霞珠干红葡萄酒品质的影响。结果发现在葡萄酒酒精发酵过程中，添加外源单宁使葡萄酒的总酚、总单宁、类黄酮、酒石酸酯等风味理化指标上升；酒样的颜色加深，颜色稳定性增强；葡萄酒的酸腐味和生青味减少，香气的复杂性和平衡性提高；葡萄酒整体感官表现良好，香气浓郁、协调，口感平衡、复杂。这说明添加外源单宁可以通过改变葡萄酒的香气成分、风味理化指标进而改善葡萄酒的整体感官质量，从而为组合添加外源单宁的大生产酿造工艺提供一定的理论依据和技术参考。
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