我国是水产品生产、加工及消费大国，近些年来，水产品产量和需求不断增加，2020年我国水产品总产量约达6 545万t，占世界总产量的3/5以上，预计2029年将达到7 232万t，但近些年来，我国水产品加工企业数量呈下降趋势[1]。鱼体在加工过程中超鲜重的50%都会被当作下脚料，按50%计算[2]，2020年就产生了约3 272.52万t下脚料，在这当中有近25%为鱼骨。大部分的鱼骨都被当做加工废料直接丢弃，仅有少部分被加工成动物饲料，事实上，经研究发现，鱼骨中蛋白质、必需氨基酸、矿物质等营养物质含量丰富，如果能被合理加工利用，不仅能够减少垃圾处理费用，增加加工附加值，为行业带来巨大利益，还能节约宝贵的鱼类资源，减少对环境的污染。
胶原蛋白又常称胶原，主要存在于自然界的动物结缔组织中，常以胶原纤维的形式广泛存在于动物的皮、骨、软骨、肌键、肌膜和韧带等组织中。经近些年研究发现，胶原蛋白具有独特的理化特性，自被提取出以来，广泛应用于食品、化妆品、医药、化工等领域，具有防止骨质疏松[3]、美容抗衰[4]、抗溃疡[5]、治疗类风湿关节炎[6]、调控内分泌[7]、促进伤口愈合[8]等生理功能。由于口蹄疫、传染性海绵状脑病和牛海绵状脑病等各种疾病的爆发，水源胶原蛋白逐渐替代陆生源胶原蛋白的市场占有，与陆地动物相比，水源胶原蛋白具有胶原蛋白含量高、疾病传播风险小、没有宗教和伦理冲突、炎症反应低等优点。从加工下脚料——鱼骨中提取胶原蛋白，不仅能够充分利用鱼类资源，改善环境污染严重问题，还为提取胶原蛋白提供了新的材料。本文对鱼骨中胶原蛋白的提取、纯化及其应用进行系统综述，介绍其研究现状，并对未来发展进行思考与展望，为该领域的学者提供参考。
1 鱼骨胶原蛋白的提取
在今天，鱼骨经常以低价出售给饲料厂生产骨粉[9]，仅有少部分零售或加工成即食零食出售，而这些零食的生产人工、设备费用远高于材料本身。鱼骨中的胶原蛋白主要为I型，含有多种人体必需氨基酸，是一种良好的提取胶原蛋白的原料。鱼骨作为加工副产物，其表面往往含有许多色素、矿物质、非胶原蛋白和脂肪等物质，故在加工前要先进行预处理。矿物质常使用无机材料如乙二胺四乙酸溶液去除，脂肪和色素等常使用氯化钠、正丁醇等有机溶剂去除[10]，预处理的主要目的是去除杂质以提高胶原蛋白的质量。由于胶原蛋白具有难溶于水、微溶于有机溶剂的特点[11]，所以需根据不同种类、用途、条件组合破坏胶原蛋白分子间共价交联作用力，根据这些方法，胶原蛋白可分为酸溶性或碱溶性胶原蛋白(alkali soluble collagen，ASC)、中性盐溶性胶原蛋白(salt-soluble collagen，SSC)、超声辅助胶原蛋白(ultrasound assisted collagen，UAC)和酶溶性胶原蛋白(pepsin-soluble collagen，PSC)[12]。表1列出从不同鱼骨中提取胶原蛋白的条件及提取率。
表1 不同鱼类骨骼中胶原蛋白的提取率
Table 1 Rate of collagen extraction in different animal bones
骨骼来源提取方法提取条件提取率/%云南鲷鱼骨[13]ASC0.5 mol/L pH 2.6乙酸溶液、酶提时间3 d3.15鲢鱼鱼骨[14]PSC料液比1∶10(g∶mL)、酶添加量8 220 U/g、pH8、酶提温度51℃、酶提时间4.5 h4.9齐口裂腹鱼骨[15]ASC、UPAC提取温度30℃,液料比75∶1(mL∶g)超声处理时间20 min,提取时间48 h6.91梭鱼骨[16]ASC、PSC0.5 mol/L冰乙酸溶液(料液比1∶20)24h、胃蛋白酶1∶10 000(g∶mL)提取温度4℃、提取时间72 h15.11牦牛骨[17]PSC固液比为 1∶28 (g∶mL)、胃蛋白酶用量为0.4(g∶mL)、提取时间为12.5 h35.88鮟鱇鱼骨[18]PSC加酶量6%、酶提时间4h、酶提温度 40 ℃ 、pH 1、料液比为 1∶15(g∶mL)43.06龟甲[19]PSC加酶量4%、酶提时间4 h、酶提温度40 ℃ 、pH 1.511.08鸡膝软骨[20]ASC、UPAC料液比1∶26(g∶mL)、超声功率253 W、酶提时间4 h42.83金鲳鱼骨[21]PSC酶添加量 4.0 %、酶提温度 45 ℃、酶提时间 1.5 h、 pH 6.521.87马鹿鹿骨[22]ASC料液比1∶15(g∶mL)、酶添加量6 000 U/g、酶提时间48 h40.86银鳍鲨头骨[23]PSC、ASC0.5 mol/L冰乙酸溶液、料液比为 1∶6 (g∶mL)、胃蛋白酶用量为 1%、提取时间为48 h7.1史氏鲟[24]PSC胃蛋白酶用量为 0.1%、料液比1∶100、0.01 mol/L HCl溶液、提取时间24 h55.92ASC0.5 mol/L醋酸溶液、料液比1∶100、提取时间24 h27.04SSC0.45 mol/L Nacl溶液、料液比1∶100、提取时间24 h2.18青鱼[25]PSC、UPAC胰蛋白酶量 100 U/g、pH 7.5、酶解温度 40 ℃、超声波处理时间 50 min45.3
1.1 酸法或碱法提取胶原蛋白
酸法或碱法提取胶原蛋白的原理是加入一定浓度的酸碱溶液，破坏胶原蛋白分子间的共价交联作用力，使肽键水解，胶原分子溶解。酸法提取常用的酸性介质为醋酸、冰乙酸、柠檬酸、盐酸、甲酸、乳酸等。碱法常用的碱性介质为氢氧化钠、石灰等。酸法提取胶原蛋白的优势在于能够最大程度保留其原本的三螺旋结构[17]，且提取率更高，得到的产物可用于化妆品、制药和制作一些具有不同功能特性的明胶。而利用碱法提取胶原蛋白得率远低于酸法，且产物结构易发生变异，分子量较低，局限性较大，所以碱法现如今很少单独使用，常与酸法进行结合使用。吴缇等[26]在相同条件下，分别采用柠檬酸与乙酸两种酸液提取斑点叉尾鮰鱼骨中胶原蛋白，结果表明，柠檬酸的提取率比乙酸高出0.14倍，同时柠檬酸具有无色无味的特点，更加适合应用于食品、医疗美容等行业。不同种类的鱼骨酸提取条件不同，实验过程中往往通过调节提取时间、温度和酸碱液浓度等变量最大化地提取鱼骨中的胶原蛋白。NAGAI等[27]以多种鱼混合废料中的鱼骨为原料，利用醋酸提取其中胶原蛋白，发现样品中含有大量的胶原蛋白(40%～53%)，是非常好的胶原蛋白潜在来源。
1.2 中性盐法提取胶原蛋白
中性盐提取胶原蛋白的原理是利用中性盐提取鱼骨中盐溶性胶原蛋白，常用的中性盐介质有氯化钠、磷酸盐、柠檬酸盐等，通过选择不同种类的盐溶液、提取温度和溶液浓度来提高胶原蛋白提取率。中性盐法提取法具有胶原蛋白在盐溶液中溶解度较低、提取过程中稳定性较差等缺点。WANG等[24]采用了酶法、酸法、中性盐法、提取史氏鲟中软骨的胶原蛋白，对比3种方法的提取率分别为55.92%、27.04%、2.18%，可以看出利用酶法的提取率是中性盐法的近28倍，因此该技术已被限制用于胶原蛋白提取。
1.3 酶法提取胶原蛋白
酶法提取胶原蛋白的原理是酶作用于胶原中的大分子蛋白，使胶原蛋白末端肽链间的赖氨酸或羟赖氨酸相互作用形成的共价键断裂。酶法提取具有不容易破坏胶原蛋白的三螺旋结构，作用条件温和，操作简单，无污染，提取率高，理化性质稳定等优点，因此酶法现广泛应用于胶原蛋白提取工业,常用的酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和不同的胶原酶等。陈申如等[28]分别利用猪胰蛋白酶和蛋白酶K提取鲨鱼、鲢鱼、草鱼、罗非鱼4种鱼鱼骨中的胶原蛋白并对酶解结果进行分析，发现4种鱼骨均可被酶水解，且水解产物的一级结构与鱼的品种有关，鱼品种差异越大，结构差异也越大。LI等[29]比较了从西班牙鲭鱼骨中提取的ASC和PSC，发现PSC产量要略高于ASC，说明胃蛋白酶可以消化水解胶原端肽区域的交联分子，提高水解效率，YU等[30]提取并比较了来自鲣鱼头骨和脊柱的ASC和PSC，发现利用胃蛋白酶消化可以令胶原蛋白产量提高1.88～2.28倍。
1.4 超声波辅助提取
超声波辅助提取是近年来新兴的提取方式，超声波是一种无污染、环保、操作简便、反应速度快且经济实惠的技术，其辅助提取胶原蛋白的机理为利用超声空化作用产生的巨大压力，使未交联的胶原分子瞬间分离，而后超声的机械效应能够促使分离，提高胶原蛋白提取率，同时超声处理，能够打开胶原纤维，从而促进酸和酶处理，与传统方法相比能够显著缩短提取时间。在利用超声波辅助提取的过程中，原料所含I型胶原蛋白含量、超声波时间、单位面积的超声的不同，都会影响提取率的高低，因此工业上往往应用低频大功率的超声波辅助提取胶原蛋白。严秋萍等[15]利用超声辅助提取齐口裂腹鱼骨中胶原蛋白，胶原蛋白得率可达6.91%，得到的产物完整性较好且纯度较高，但仍具有提取时间较长的问题。
2 鱼骨胶原蛋白的纯化
胶原蛋白自鱼骨中提取出来后，仍会存在杂质、提取过程中使用的剩余溶剂、小分子蛋白肽等物质，致使胶原蛋白的纯度低，需要进一步纯化产物，得到可利用和分析的高纯度胶原蛋白。胶原蛋白的纯化目前的方法有盐析、透析、层析、色谱、电泳等，最常使用的方法为盐析与透析相结合，这个过程往往需要反复多次，纯化周期从1周～数周不等。近些年来，相关领域学者不断探寻新方法，研究出多种复合材料组成的超滤膜来分离纯化蛋白，在缩短纯化周期和提高纯化效率方面有了显著提升，但目前技术尚未成熟且成本较高，胶原蛋白纯化技术仍需继续研究发展。下列举出3种传统的和近些年新兴的胶原蛋白纯化方法。
2.1 盐析法
盐析法纯化胶原蛋白往往与透析组合使用，通常需要反复多次才可达到纯化目的，AHMED等[31]从大眼金枪鱼副产品中提取ASC和PSC过程中，不断加入NaCl至溶液终浓度为2 mol/L，离心收集沉淀后溶于乙酸，ASC需要用0.1 mol/L乙酸透析24 h，后透析液换为蒸馏水再透析48 h。为了终止胃蛋白酶反应得到出纯度较高的PSC，需要将上清液置于0.02 mol/L Na2HPO4溶液中(pH 7.2、分子质量为30 kDa)透析24 h。CUMMING等[32]为了得到纯度较高的硬骨鱼软骨胶原蛋白，采用差盐沉淀法去除蛋白聚糖，可以保持分子的主要胶原核心仅被特定的酶切割，同时通过调节加入的NaCl浓度来提取不同种类的胶原蛋白[33]。但这种方法只允许部分胶原蛋白种类，纯化后得到的沉淀物总是被污染，必须经过后续的步骤中使用如色谱法等技术处理[34]。由此可见，常用的盐析和透析组合方法具有工艺复杂、周期长、胶原蛋白易污染等缺点，难以满足工业需求。
2.2 层析法
层析法又称色谱法，是众多蛋白纯化方法中针对性最强的一种方法，它的机制是利用目的蛋白与特定分子间的特异性识别和其性质的差异进行分离，该种方法具有高度的专一性、效率高、操作简单、成本相对较低等优点。刘磊[35]利用阳离子层析法纯化海蜇胶原蛋白，选用NaCl作为洗脱液，对得到的产物进行SDS-PAGE分析，结果表明，得到的I型胶原蛋白在经过离子交换后纯度大大提高。MIURA等[36]则选用CM-纤维素色谱法进行纯化，将得到的水母胶原蛋白粗品应用于羧甲基-纤维素柱，并以0～0.5 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，探究纯化后的蛋白发现，羧甲基-纤维素能够成功地分离水母胶原蛋白中的α链，其结构类似于脊椎动物中的V型胶原蛋白。
2.3 超滤法
超滤法早些年就用于蛋白质的脱盐、分离以及浓缩步骤，但关于纯化胶原蛋白的报道并不多，其原理主要是利用渗透压所产生的压力，在膜内外分离不同尺寸的粒子。陈思谨[37]选用聚醚砜作为超滤膜材料，对鱼鳞中的ASC与PSC进行超滤分离，超滤前对超滤膜及其设备进行放大处理，可一次性处理15 L胶原蛋白处理液，大大解决了盐析法处理量小，无法满足工业需求的弊端。张雄等[38]同样利用超滤技术去除酸处理后样液中残留的大量盐离子，将样液加入到装备有聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜的超滤杯中，不断加入蒸馏水进行洗涤，达到脱盐的目的。结果表明，胶原溶液质量分数为1.2%时截留效果最好，且在过程中施加的压力越大，操作温度在30 ℃范围内越高，脱盐效果越好，最高可达74.4%。
3 鱼骨胶原蛋白的应用
3.1 在食品领域中的应用
胶原蛋白中富含多种人体所需营养物质，特别是钙、磷等微量元素，易于被人体吸收利用。赵玉红等[39]在生产的运动饮料中加入鲢鱼副产物中水解的胶原蛋白，能够同时为运动员补充充足的蛋白质和水分，并显著改善产品功能特性。胶原蛋白作为一种天然的高分子化合物，可以作为食品添加剂被添加到食品中作为乳化剂、澄清剂、增稠剂等[40]。DUAN等[41]提取鲤鱼鳞中的胶原蛋白，针对其生物活性特点，将胶原蛋白掺入水牛奶中开发了一种乳基食品——奶酪。发现加入胶原蛋白的合成奶豆腐具有良好的质地和感官属性，且增加了牛奶的蛋白质含量。胶原蛋白也可用来食品保鲜，胶原蛋白和明胶因其成膜能力、生物相容性、抗菌性和良好的气体阻隔性而被广泛应用，能够隔绝氧气与食品接触，防止水分迁移、脂肪氧化、变色和微生物活动，保证食品良好的感官品质和货架期。甘钊生等[42]利用罗非鱼鳞胶原蛋白制作涂膜液保鲜圣女果，结果表明，胶原蛋白涂膜液能够有效抑制圣女果发生褐变，在贮存过程中降低腐烂率，延长圣女果的贮藏期和货架期，是一种安全、高效且价格低廉的保藏手段。
3.2 在化工品领域中的应用
胶原蛋白因其具有丰富的营养物质和特殊的生理活性，也常被广泛用于动物饲料、医疗美容、组织工程等行业。沈徽霞[43]在母羊的饲料中添加一定量的胶原蛋白，形成微囊型酸化剂，制得的饲料不仅能够满足母羊的基本营养需求，其酸化成分还能够在母羊胃中消化吸收，改善肠道菌群平衡，增强免疫力，提高母羊的泌乳量。鱼类水解胶原蛋白作为一种营养添加剂，具有安全营养、价格低廉、原料易得等优点。SUOSA等[44]从大西洋鳕鱼鱼鳔中提取酸溶和酶溶性胶原蛋白，分析结果发现，产物具有典型的剪切稀化行为，同时在高质量浓度(3 mg/mL)产物存在下，对培养的人成纤维细胞也不具有细胞毒性行为，为进一步将其开发生物材料提供了有力证明。目前鱼骨胶原蛋白在美容、组织工程行业应用较少，主要是人们对其营养成分的认识和开发利用远远不够，仍待进一步研究。
3.3 在医疗领域中的应用
胶原蛋白具有生物相容性、止血性、可塑性、功能性等特点，在医药领域应用广泛。外科手术常使用源自动物胶原蛋白的天然可吸收缝合线，这种缝合线具有较好的抗张强度，操作简单，便于手术医生打结缝合，且又具有可吸收性，不会留下明显的疤痕。在各科手术中，止血也是一个必不可少的环节，胶原蛋白同样是一种良好的止血材料[45]，其独特的三螺旋结构能够诱导血小板附着凝结，能够使创面渗血区迅速凝结成血痂，同时也可充当敷料，防止术中或术后感染，促进伤口愈合。胶原蛋白也拟作为人体器官或组织的替代品，在心血管外科领域常被用来制作心脏支架或血管的替代品[46]。在皮肤科，胶原蛋白等高分子化合物为主要材料在临床上已广泛应用于修复皮肤损伤创面、人造皮肤、瘢痕挛缩改善、皮肤组织工程等方向[47]。重组后的胶原蛋白材料也可用于角膜移植、隐形眼镜的制作等，在未来有期望成为高危患者的角膜替代品[48]。
4 结论及展望
随着科技的发展以及国人对健康生活的重视，胶原蛋白行业近些年来飞速发展，到2019年，中国天然胶原的产量规模已经达到2 000 t，占全球产量份额的6.33%，其中医疗健康模块占比47%，食品饮料模块占比32%，化妆品模块占比13%。研究表明，鱼类加工副产物可作为提取胶原蛋白安全且低廉的材料，但现如今仍存在原料前处理复杂、提取纯化过程周期较长、无法满足工业化大规模生产需要、消费者认可度不高等问题存在，因此探索水源胶原蛋白功能活性，优化提取纯化工艺流程，缩短生产周期是未来的研究方向。目前，对于水源胶原蛋白生理活性的研究仍处于实验阶段，需要进一步研究其长期安全性。随着技术不断更新发展，会有更多安全、功能多样、利用率高、价格低廉的水源胶原蛋白及其制品能够造福人类，为产业带来巨大利益，为我国水产品行业的发展推波助澜。
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