在传统发酵食品中,黑曲霉(Aspergillus niger)具有悠久的应用历史。美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)已认定黑曲霉生产的多种酶制剂和有机酸为公认安全(Generally Regarded As Safe,GRAS)等级[1]。黑曲霉在工业生产中除了具有食品安全性的特性,同时还具备高生产经济性、极端环境耐受性、强发酵鲁棒性等优点[2]。GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中,44%的酶制剂使用黑曲霉发酵生产,包括应用于烘培食品中的天冬酰胺酶(asparaginase,ASN,EC,3.5.1.1)[3]。为了进一步开发黑曲霉细胞工厂用于表达重组蛋白,分子手段理性改造黑曲霉宿主成为研究热点[4]。
黑曲霉与大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等工业表达宿主相比,生长周期更长,生长和生殖方式更复杂。这些生理特性使黑曲霉分子操作更加耗时耗力,且菌株之间也存在转化方式和条件的差异[5]。转化效率低下不仅消耗大量的劳力和物力,而且阻碍黑曲霉菌株的进一步开发。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein(Cas))基因编辑系统在黑曲霉中的应用需要以高效的转化系统为前提。因此,构建高效的转化系统对于黑曲霉菌株开发至关重要。目前,电转化、农杆菌介导法(Agrobacterium mediated transformation,AMT)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化法(Agrobacterium-mediated and PEG-mediated transformation,PMT)是黑曲霉中常用的转化方法[6]。3种转化法中,以电转化最简便和快捷,黑曲霉MGG029-△aamA电转化能产生50个转化子/μg DNA[7],然而,丝状真菌电转化的转化效率通常较低[8]。AMT利用农杆菌与黑曲霉共培养,使转化步骤和周期增加,该方法虽然能提高外源基因同源重组的效率[9],但外源基因在基因组上形成的拷贝数低[10],黑曲霉CICC2462[11]和CICC2169[12]使用AMT进行重组蛋白表达。PMT在黑曲霉中的应用最多,实验室标准菌株N402及其衍生菌株均使用PMT转化[13]。原生质体的制备是提高PMT效率的关键[6],通过优化菌丝酶解的体系和条件能提高原生质体浓度[14]。因此,筛选适合宿主的转化方法,并系统地优化转化关键步骤,提高转化效率有利于CRISPR-Cas基因编辑系统在黑曲霉中的应用。
CRISPR-Cas基因编辑系统在不缺失非同源重组基因kusA的黑曲霉菌株中,也能进行高效的同源重组[15]。黑曲霉转化子的纯化步骤是耗时的[16],阳性转化的获得约需要2周时间[15]。为了快速筛选里氏木霉阳性转化子,利用目的基因与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合,再结合流式细胞仪(flow cytometer,FCM)分选技术,已构建了基于荧光强弱快速筛选高表达目标基因的单孢子平台[17]。因此,以GFP为报告基因,利用FCM可实现荧光孢子的快速分选。
本研究针对黑曲霉AG11,考察电转化、AMT和PMT对外源基因转化效率的影响,系统优化PMT中的关键步骤,以期显著提高转化效率。利用CRISPR-Cas9技术,将融合GFP的ASN基因整合至黑曲霉AG11糖化酶位点,并通过流式细胞仪分选表达ASN的孢子。研究结果将为黑曲霉基因编辑提供重要的基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒
黑曲霉AG11(CCTCC M 2018881)、大肠杆菌JM109、米曲霉NRRL3488、质粒pAN7-1、pUC57和pET-22b(+)/S1-gfp[18],实验室保存。质粒pCAMBIA1301编码潮霉素基因,淼灵质粒平台；pFC332(Addgene质粒#87845)编码密码子优化的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9基因和潮霉素基因,Addgene。
1.1.2 试验试剂
PrimerSTAR Hs DNA聚合酶、Yatalase、反转录试剂盒(Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser)、定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM Tli RNase H Plus),TaKaRa公司；溶解酶,广东省微生物菌种保藏中心；几丁质酶、溶壁酶、葡萄糖醛酸酶,Sigma公司；潮霉素、质粒提取试剂盒,上海生工公司；ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒,南京诺唯赞公司；植物基因组提取试剂盒、植物RNA总提取试剂盒,天根公司；其他常规试剂及药品为国产或进口分装。
1.1.3 培养基与缓冲液
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨 10,酵母提取物 5,NaCl 10。筛选平板中添加50 μg/mL硫酸卡那霉素或者100 μg/mL氨苄青霉素。
马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基(g/L)：马铃薯 200,葡萄糖 20。
ME培养基(g/L)：蔗糖 20,麦芽提取物 5,ZnSO4·7H2O 0.001,CuSO4·5H2O 0.000 5,pH 5.5。
改良察氏培养基(modified Czapek-Dox,MCD)(g/L)：蔗糖 20,麦芽糖 10,NaNO3 3,K2HPO4 1,MgSO4 0.5,KCl 0.5,FeSO40.01。作为转化平板时蔗糖添加量为342.3 g。
种子培养基(g/L)：玉米浆 30、精制黄豆粉 20、玉米淀粉 20、葡萄糖 5,pH 6。
发酵培养基(g/L)：玉米浆 30、精制黄豆粉 20、玉米淀粉 20、麦芽提取物 30、天冬酰胺 10,pH 6。
以上固体培养基中添加15～20 g/L的琼脂。
KMC缓冲液：50 mmol/L CaCl2,20 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸。
STC缓冲液：1.2 mol/L山梨糖醇,10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L Tris,pH 7.5～8。
PEG缓冲液：250 g/L PEG,50 mmol/L CaCl2,10 mmol/L Tris,pH 7.5～8。
磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)(g/L)：NaCl 8,KCl 0.2,Na2HPO4 1.44,KH2PO4 0.24,pH 7.4。
磷酸盐缓冲液：0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4,pH 7.5。
1.2 试验方法
1.2.1 转化质粒和片段的构建
PCR片段使用ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒组装后在大肠杆菌JM109中进行构建。根据表1中的引物,以质粒pAN7-1为模板用引物HyhB-F/HyhB-R扩增潮霉素基因表达框片段用于转化AG11。
如图1-b所示,由烟曲霉u3 snRNA启动子和终止子[19]、tRNAGly[19]与靶向glaA基因的gRNA组成的gRNA表达框由南京金斯瑞合成并克隆至pUC57载体,以此质粒为模板,用引物P57-F/P57-R进行gRNA表达框扩增用于黑曲霉转化。靶向glaA的目标序列为CATCCTGAATAACATCGGGG。
以黑曲霉AG11基因组为模板用引物Uppy-F/Uppy-R和Dopy-F/Dopy-R分别扩增pyrG基因(GeneID：4985706)上游和下游片段。以pUC57质粒为模板,用引物Tp57-F/Tp57-R扩增载体片段,以上3个片段通过一步克隆试剂盒组装成含有pyrG敲除片段的质粒。以此质粒为模板,pyrG敲除片段通过引物对P57-F/P57-R扩增用于转化。
图1 黑曲霉CRISPR-Cas系统的转化质粒/片段
Fig.1 Transformation plasmid/fragments of CRISPR-Cas system into A.niger
以黑曲霉AG11基因组为模板用引物对Pgla-F/Pgla-R、Tgla-F/Tgla-R、A1-F/A1-R、A2-F/A2-R和A3-F/A3-R分别扩增GlaA启动子片段(包括GlaA信号肽,SPgla)、GlaA终止子片段、ASN基因ASN-1(GeneID：4989881)、ASN-2(GeneID：37096104)和ASN-3(GeneID：37104124)。以米曲霉NRRL3488基因组为模板用引物Aopy-F/Aopy-R扩增pyrG表达框(AopyrG)。以pET-22b(+)/S1-gfp为模板用引物GFP-F/GFP-R扩增GFP片段。以pUC57质粒为模板用引物Tp57-F/Tp57-R扩增载体片段。以上片段经一步克隆试剂盒如图1-c中供体DNA片段顺序进行组装得到3个携带不同ASN基因的质粒。以这些质粒为模板用Tp57-F/Tp57-R扩增供体DNA片段用于转化黑曲霉。
表1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
基因/DNA片段名称引物名称引物序列潮霉素基因表达框片段HyhB-FGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAGGCTHyhB-RGTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGpyrG基因上游片段Uppy-FGTTGTAAAACGACGGCCAGTTCAGATCTGTCTTGATGCCCATAATACTAGCUppy-RTTGGTCTTCCTTCAGATTTAGACCAATGTCGAGCACGGGTApyrG基因下游片段Dopy-FTAAATCTGAAGGAAGACCAAGGACAATGTTCDopy-RGCTATGACCATGATTACGCCGCAGTGTGAGCCGAATGTGAATGTAApUC57载体片段Tp57-FGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCTp57-RACTGGCCGTCGTTTTACAACGTGlaA启动子片段Pgla-FACGTTGTAAAACGACGGCCAGTTCTCCCCTGATCTTCCGAACT Pgla-RTGCCAACCCTGTGCAGACGA GlaA终止子片段Tgla-FACAATCAATCCATTTCGCTATgla-RCGCGTTCTCGAGGAAGTTGCTCATCCGTGAGAATGAAGAGASN-1A1-FTCGTCTGCACAGGGTTGGCAATGAGTCGCTCAAAGGGAAGCGGAA1-RCCCATCGCAAGCTTGCGCTTGCTGGTTTTGGGGCCCTGGGTASN-2A2-FTCGTCTGCACAGGGTTGGCAATGACCGTACCTCCCAACCCATA2-RCCCATCGCAAGCTTGCGCTTTACCTTGCCCATTTGAAATTGGTGASN-3A3-FTCGTCTGCACAGGGTTGGCACCGCTGCTCTACTCGCGGACCACCAATGAAACA3-RCCCATCGCAAGCTTGCGCTTCGCATCCGTGCCCAGAGCAAACACGTCAGA3-RT-FGCGGACCACCAATGAAACCTTCA3-RT-RATGGCACCGCATCGATGAG米曲霉pyrG表达框Aopy-FGCAACTTCCTCGAGAACGCGAopy-RGCTATGACCATGATTACGCCCCCTTTTAGTCAATACCGTTACACGFPGFP-FAAGCGCAAGCTTGCGATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTGFP-RTAGCGAAATGGATTGATTGTTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCGF-RT-FGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTGGGF-RT-RAGTGACAAGTGTTGGCCAAGG转化片段P57-FGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGP57-RCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATpyrG Pyg-FAGTACTTTCCCAGTGGAAGCCTCPyg-RCTATTCGCCGCTTGTTGGTCGTG
注：下划线为用于一步克隆组装的同源臂序列
1.2.2 黑曲霉转化
在MCA平板中分别添加50、100、150、200、250、300、350 μg/mL潮霉素和0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的5-氟乳清酸对AG11菌株进行梯度抗性耐受性试验。黑曲霉AG11于PDA平板30 ℃培养4～7 d后收集新鲜孢子。电转化使用生长4 d的孢子,2 h萌发后在5 kV/cm的电场强度[7]中与10 μg潮霉素基因表达框片段进行转化。使用冻融法将质粒pCAMBIA1301转入农杆菌AGLI,农杆介导转化的条件为使用OD600为0.9～1.0的农杆菌阳性转化子与生长5 d的黑曲霉AG11孢子,23 ℃共培养48 h后转膜[20-21]。生长7 d的新鲜孢子接种于装有10% ME培养基的250 mL摇瓶中培养32 h,收集0.1 g菌丝用于原生质体制备。菌丝在复合酶液(5 mg/mL溶壁酶、0.2 U/mL几丁质酶和460 U/mL葡萄糖醛酸酶[14]溶于10 mL KMC缓冲液)30 ℃,120 r/min振荡酶解2 h后,使用过滤膜进行过滤,离心弃上清液后用10 mL预冷的STC洗涤2次原生质体。100 μL原生质体与10 μg转化片段/质粒在PEG缓冲液中混匀,冰上放置25 min后,再加入PEG缓冲液于室温倒至含抗性的转化MCA平板中[14]。转化平板置于30 ℃培养箱5～7 d后挑取单菌落进行转化子传代纯化。黑曲霉菌株基因组参照植物基因组提取试剂盒说明书进行。以转化子基因组为模板用相应的验证引物对(表1)扩增目标基因序列,并在苏州金唯智公司进行测序验证。
在以上初始的PMT基础上进行转化条件优化,优化原生质体制备的条件依次包括使用酶的种类(初始条件中的复合酶和Yatalase、溶解酶进行比较)、酶解温度(20～40 ℃)、酶解时间(0.5～3.5 h)、酶解缓冲液pH(3～8)、菌丝干重(0.2～1.4 g)、菌丝生长时间(24～84 h)和菌丝球直径(0.1～0.5 cm)。PMT过程优化的条件包括PEG的种类(PEG 2 000、4 000、6 000和8 000)和Ca2+浓度(10～50 mmol/L)。
1.2.3 FCM分选黑曲霉单孢子
使用PBS洗下MCD转化平板上生长5 d的黑曲霉孢子,使用膜过滤后离心收集孢子,用2 mL PBS重悬2次,稀释孢子液OD至0.3～0.5上FCM进行荧光检测。AG11的孢子悬液样品作为阴性对照,样品由FITC-Log通道检测。预先在48孔板中加入2 mL固体MCD培养基,荧光信号强的单孢子被分选入单独的孔中,分选结束后孔板置于30 ℃培养4～6 d。
1.2.4 黑曲霉摇瓶发酵
取48孔板单孔中黑曲霉的孢子涂布于PDA平板30 ℃培养7 d制备孢子悬液,接种500 μL的107个/mL新鲜孢子菌悬液于含有10%种子液培养基的250 mL摇瓶中。发酵24 h后以10%的接种量转接至含有30 mL发酵培养基250 mL摇瓶中发酵48 h进行目的基因的实时荧光定量PCR分析；发酵72 h测定ASN酶活力。
1.2.5 实时荧光定量PCR分析
黑曲霉48 h发酵液离心弃上清液,菌体用PBS冲洗2次,离心收集菌体用液氮研磨至细粉状,参照植物RNA提取试剂盒说明书提取RNA。使用反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。以相应菌株的cDNA为模板,使用引物对GF-RT-F/GF-RT-R和A3-RT-F/A3-RT-R分别对GFP和ASN-3基因进行实时荧光定量PCR分析,操作步骤参照试剂盒说明书。
1.2.6 ASN酶活力测定
取发酵上清液100 μL与200 μL天冬酰胺(0.15 mol/L)、900 μL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L)混合,37 ℃孵育30 min,用Nessler试剂测定氨的释放量[22]。ASN酶活性单位定义为:在测定条件下1 min释放1 μmol/L氨的酶量。菌丝液氮研磨破碎后用于胞内酶活力测定[23]。
2 结果与分析
2.1 转化方法对黑曲霉AG11转化效率的影响
抗性结果表明,潮霉素对AG11的最小抑制质量浓度为300 μg/mL,而5-氟乳清酸对AG11的致死质量浓度为2 mg/mL。通过以上浓度选定转化平板中抗性的添加量。
黑曲霉的3种主要转化方法包括电转化法、AMT和PMT[6]。利用这3种方法分别将潮霉素基因转入AG11,对比AG11中的转化效率和外源基因的遗传稳定性(图2)。
图2 三种转化法在黑曲霉AG11中的转化效率对比
Fig.2 Comparison of transformation efficiency of three transformation methods in A.niger AG11
如图2所示,AMT和PMT获得了转化子,而多次电转均未在抗性平板上获得转化子。将AMT和PMT初级转化平板上所得转化子经过3轮的传代纯化后,检验外源基因的传代稳定性。结果显示,潮霉素抗性片段在PMT产生的转化子中稳定性良好,而在农杆菌介导转化子中丢失严重,假阳性高。因此,选择PMT用于AG11的转化。由于PMT产生的转化子较少,转化效率仍需提高用于CRISPR-Cas9系统在AG11中的构建。
2.2 PMT的系统优化
制备原生质体是进行高效PMT的关键步骤[10]。酶制剂[10]和菌丝体的生长状态对原生质体的释放有显著的影响。因此,本研究从影响酶制剂活性的因素(酶的种类、温度、时间和酶解缓冲液pH)和黑曲霉菌丝生长状态的因素(菌丝生长时间、干重和菌丝球直径)对原生质体制备的条件进行优化。
如图3-a所示,在初始转化条件下,对比酶制剂酶解效果的差异,Yatalase释放最多的原生质体,比复合酶释放的原生质体个数提高了约9倍,达9×105/mL。由于初始的酶解温度和缓冲液pH处于较优的状态,因此,优化这2个因素原生质体浓度无显著提升(图3-b、图3-c)。如图3-d所示,酶解时间延长至2.5 h使原生质体释放量增加,其浓度大于106/mL使转化效率得到明显提升。但是,酶解时间过长(>3 h)会导致原生质体在酶解液中破裂,应及时处理酶解好的原生质体。10 mL酶解液的适宜添加量为0.8～1 g菌丝,较初始条件约提高8.3～8.9倍,最高达8.9×106/mL(图3-e)。菌丝生长至48～72 h适于制备原生质体(图3-f),而早期的原生质体表现出更高的转化效率和活力。最后,菌丝的直径也会影响原生质体的制备效率,直径大(0.3～0.5 cm)松散的菌丝球比直径小(0.1～0.2 cm)紧实的菌丝球更易被酶解。
a-酶制剂；b-酶解温度；c-酶解缓冲液pH；d-酶解时间；e-菌体干重；f-菌体生长时间
图3 黑曲霉AG11原生质体制备条件优化
Fig.3 Optimization of protoplast preparation conditions of A.niger AG11
在PMT中,Ca2+介导外源DNA作为信号分子进入细胞质,而PEG的作用可能是负责协助外源DNA进入细胞质后的释放[24]。因此,针对PEG的种类和缓冲液中Ca2+浓度进行优化。然而,通过对比发现,所选PEG的种类和Ca2+浓度对转化效率的影响不显著。
在黑曲霉AG11的PMT中,原生质体的浓度对转化效率影响最显著。优化原生质体制备的条件下进行PMT转化,能产生90个转化子/μg DNA,阳性率达80%以上。
2.3 GFP单孢子分选及ASN在黑曲霉中的表达
参考黑曲霉CBS513.88基因组中的基因注释[25],从黑曲霉AG11菌株基因组中获得ASN-1(GeneID：4989881)、ASN-2(GeneID：37096104)和ASN-3(GeneID：37104124)3个ASN基因。为了将ASN与GFP融合表达的供体DNA片段(图1-c)转化AG11。在AG11中转化pyrG敲除片段,并利用含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的转化平板,构建AG11△pyrG菌株。利用CRISPR-Cas系统(图1),供体DNA在AG11△pyrG菌株的glaA位点进行同源重组效率约为30%。收集AG11和转化平板上的孢子,使用FCM进行荧光强度分析。以AG11为阴性对照,只有ASN-3基因与GFP融合时检测到荧光信号(图4-b),在荧光显微镜下也能观察到孢子之间的荧光差异(图4-a)。FCM分析ASN-3基因与GFP融合转化平板上的30万个孢子,0.3%的孢子能表达GFP。分选后的单孢子在48孔板上存活率达65 %(图4-c)。随机挑选48孔板中的菌丝在荧光显微镜下进行观察,孔板中的菌丝均观察到GFP表达,而AG11菌丝中无荧光信号(图4-d)。为了进一步验证目的基因ASN-3能通过FCM进行精准分选,需要对48孔板中菌株ASN的表达情况进行验证。
a-转化子孢子表达GFP在激发光下产生绿色荧光,左图为明场拍摄,右图为蓝光场拍摄；b-黑曲霉孢子利用FCM分选,ASN-GFP：ASN-3与 GFP融合表达转化子；c-分选荧光孢子在48孔MCA板中生长60 h；d-黑曲霉菌丝在激发光下菌丝荧光对比图,菌株1和菌株2为48 孔板单孔随机挑选菌株,第一行图为明场拍摄,第二行为蓝光场拍摄
图4 FCM分选黑曲霉GFP单孢子
Fig.4 Flow cytometry sorting of GFP spore of A.niger
随机挑选48孔板中生长的6个菌株进行发酵,以验证ASN-3和GFP基因的转录水平和ASN表达情况。如图5所示,ASN-3基因和GFP基因在AG11菌株中无转录水平,而在分选的6个菌株中ASN-3和GFP的转录水平明显提高,说明2个基因的在6个菌株中均成功转录。此外,菌株1～6的胞外和胞内均检测到ASN活性,菌株5胞外ASN酶活力为0.6 U/mL。综合图4和图5的结果表明,在黑曲霉中利用GFP与目的基因融合,基于转化平板中孢子荧光强弱的差异,构建快速筛选重组单孢子的方法简单而有效。
3 结论与讨论
黑曲霉菌株改造过程中,由于转化子需要多轮次纯化,分子操作费时费力[6],且菌丝形态阻碍了菌株筛选的高通量。因此,黑曲霉工业菌株主要采用诱变的手段进行改造。然而,随着模式黑曲霉菌株组学信息的公布,其中新基因簇的发现、与酶分泌和形态学调控相关基因的挖掘为研究者理性改造菌株提供了更多的方向和思路[25]。提高黑曲霉菌株编辑效率和重组菌株筛选效率将简化和促进黑曲霉宿主的优化。
a-GFP和ASN-3基因转录水平；b-胞内胞外ASN酶活力； 菌株1～6为48孔板单孔生成菌株
图5 FCM分选GFP单孢子生成菌株的ASN表达验证
Fig.5 Asparaginase expression verification of GFP spore strains sorted by flow cytometry
本研究以前期筛选的黑曲霉优良表达宿主AG11为出发菌株,基于已报道的最佳转化条件,在AG11中比较电转化、AMT和PMT的转化差异,以PMT的转化阳性率最高。对PMT中原生质体的制备进行了优化,使得0.8～1 g松散的菌丝球于10 mL Yatalase溶液(0.8 mg/mL,pH 5.5)反应2.5 h原生质体释放量达8.9×106个/mL。以此高浓度、高活力的原生质体进行转化,转化效率较优化前提高14倍,获得90个转化子/μg DNA,阳性率达80%以上。基于构建高效转化系统的基础上,利用CRISPR-Cas9基因编辑系统将ASN与GFP融合表达框同源整合至黑曲霉AG11糖化酶位点。以GFP为报告基因,通过FCM分选确认ASN-3基因在黑曲霉中成功表达,其中,0.3%的孢子能表达GFP(共筛选30万个孢子),65%表达荧光蛋白的孢子能表达ASN,胞外ASN酶活力为0.6 U/mL。构建的此筛选的方法能高效分选出重组黑曲霉菌株,省去了转化子挑选和传代纯化的步骤,节约了时间和劳动力。研究结果将为黑曲霉基因编辑和重组菌株的快速筛选提供重要方法学基础。
基于FCM分选技术构建快速筛选黑曲霉重组孢子方法,所检测的目的基因表达水平仍处于孢子水平。然而,孢子生成菌丝后,目的基因在其中的表达和分泌还受到蛋白分泌途径和菌丝形态的调控。因此,为了检测目的基因在菌丝中的分泌差异,需要构建更精细的筛选技术的来分选黑曲霉菌丝。建立高效的黑曲霉微流控高通量筛选技术将是下一步研究的主要内容。
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