由多糖、蛋白质和脂类等制作的可食用涂层可以作为微生物、氧气和水汽的屏障以此来延长食品的保质期。壳聚糖(chitosan,Ch)由甲壳素(chitin)经脱乙酰作用生成,具有无毒、可降解、成膜性和生物相容性等生物功能[1-2],同时具有广谱抑菌性[3]、抗氧化[4]和保鲜作用[5],在食品工业中有着广泛的应用[6]。鲜鱼的生物成分变化,如脂质的氧化、自身酶活性变化、微生物的代谢活动等导致其极易发生腐烂,使得鱼类比其他水产品的保质期短。基于壳聚糖的众多优点,通过壳聚糖涂膜解决水产品易腐败的问题已成为当前水产品保鲜研究的热点,很多研究表明,可通过使用壳聚糖涂膜来抑制鱼和鱼产品的脂质氧化、微生物生长、风味变差、色泽劣化等问题是可行的[7-8]。
植物精油由于抗菌活性高,抗菌范围广而成为众多科研者青睐的研究对象,植物精油具有良好的防腐抗菌作用,广泛应用于食品、药品等领域[9-10]。一些研究表明,将植物精油添加到壳聚糖中可大大增强壳聚糖的抗菌和抗氧化作用[11-12]。肉桂精油(CIN),富含肉桂醛、石竹烯、芳樟醇等萜类化合物。肉桂精油的主要活性成分是肉桂醛,具有与肉桂相关的独特气味和风味。肉桂醛在世界范围内被用作食品添加剂和调味剂[13],美国食品和药物管理局将其列为“公认为安全的添加剂”[14]。研究表明,肉桂精油和肉桂醛都具有良好的抗氧化和抗菌潜力[15-16]。在壳聚糖薄膜或涂层中加入精油不仅可以增强壳聚糖膜的抗菌和抗氧化性能,而且还可以降低薄膜产品的水蒸气通透性和脂质氧化,开发具有高抗氧化、抗菌活性的天然防腐剂涂层或膜,延长鲜食鱼和鱼产品的保质期是可行的。本研究旨在探讨壳聚糖和含肉桂精油的壳聚糖涂层在草鱼片保鲜中的应用潜力。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
鲜活健康草鱼,长沙步步高超市；壳聚糖(脱乙酰度>95%),上海蓝季生物试剂有限公司；食品级肉桂精油、乙酸、甘油、三氯酸、高氯酸、氢氧化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氧化镁、碳酸钾、甲醛、甲苯、氨水、甲基红、溴甲酚绿、硫代巴比妥酸、三氯乙酸,国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂(生化试剂),青岛海博生物技术有限公司。
1.2 仪器和设备
UV-1000 紫外可见分光光度计,上海天美科学仪器有限公司；4K15高速冷冻离心机,德国 Sigma 公司；EL-20 pH 计,上海 Mettler Toledo 仪器有限公司；KDN-103F蒸馏器,上海纤检仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂；超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司；T10 高速分散机、C-MAG HS4磁力搅拌器,德国 IKA 公司；生化培养箱、恒温恒湿箱,上海一恒仪器有限公司；BCD-610 WkM冰箱,美的集团股份有限公司。
1.3 样品制备
鲜活健康草鱼,每尾质量约550～600 g。鲜活草鱼买回后,立即去鳞,剖杀,去内脏,无菌水清洗,分段切片(宽5 cm×长12 cm),称质量,装袋(刀具与案板均用75%乙醇溶液消毒,整个过程在无菌环境下进行),将所有样品组置于(4±1) ℃条件贮藏。
1.4 鱼片涂层液的制备及鱼片的处理
根据前期预实验结果,3%壳聚糖溶液较为黏稠,不再适合进行鱼片涂膜保鲜。因此,后续的实验选择的壳聚糖涂膜溶液为 1%、2%和2.5%。将一定量的壳聚糖溶解于1%(体积分数)乙酸溶液中,添加质量浓度5 g/L的甘油作为塑化剂,混合溶液在室温环境下磁力搅拌4 h至壳聚糖完全溶解。溶液在4 ℃、10 000×g条件下离心15 min,去除不溶性颗粒,加入一定量的乳化剂吐温-80有助于肉桂精油在壳聚糖溶液中的分散,混合搅拌30 min,接着将不同体积分数(0.5%、1%、1.5%、2%)肉桂精油加入壳聚糖膜液中,混合搅拌30 min形成壳聚糖-肉桂溶液,只含壳聚糖的涂层溶液作为对照用于鱼片涂膜处理。通过前期预实验发现,肉桂精油体积分数<1.0%时涂层不能均匀分布在样品表面上,而肉桂精油体积分数>1.5%时,涂层剂的黏度非常高。而通过涂层液的稳定性试验表明壳聚糖含量为2%时,涂层液的稳定性最好。因此,最终形成的处理涂层溶液配方为：2%壳聚糖、1%乙酸、0.75%甘油、0.2%吐温-80和1.5%肉桂精油,涂层溶液的使用性和稳定性最佳,所以选取这一配方的壳聚糖-肉桂精油涂膜溶液作为后续冷藏草鱼片抗菌保鲜研究的涂层保鲜剂。
将鱼片样本随机分配为3个样品组,包括1个空白对照组(未涂覆)和2个处理组：壳聚糖(Ch)处理和壳聚糖+肉桂精油(Ch+CIN)处理。每个样品组重复3次。对于每个涂覆的样品组,大约20条草鱼片在500 mL涂层溶液中浸渍30 s,取出晾置2 min,然后再重复1次。在涂层溶液中浸渍30 s,然后在10 ℃下取出鱼片并置于灭菌后的生物密闭罩中的金属网上放置5 h,以便形成食用涂层,然后储存在4 ℃条件下用于后续质量评估。分别在冷藏0、4、8、12和16 d进行化学、微生物和感官分析,以确定冷藏鱼片的总体质量。
1.5 基本成分分析
冷藏鱼片的水分含量、灰分含量、粗蛋白含量和总脂肪含量分别参照GB 5009.3—2016中的直接干燥法、GB 5009.4—2016、GB 5009.5—2016和GB 5009.6—2016中的第一法进行测定。
1.6 微生物分析
根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》,称取切碎后的约10 g样品置于无菌均质袋中,加入90 mL 0.85%的无菌生理盐水,均质拍打4 min,吸取1 mL均质液进行连续10倍梯度稀释,选取3个合适的浓度对微生物进行倾注平板法培养计数,所有操作在无菌条件下进行。菌落总数和嗜冷菌总数采用平板计数琼脂,分别在30和10 ℃条件下培养3和7 d,微生物计数单位为lg CFU/g,每个处理3次重复。
1.7 化学分析
1.7.1 挥发性盐基总氮值(total volatile basic nitrogen,TVB-N) 含量的测定
参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》第一法进行测定,单位以 mg/100 g样品表示。
1.7.2 TBARS的测定
用比色法测定硫代巴比妥酸的值,取约2 g搅碎样品放入离心管中,加入 20 mL 100 mg/mL三氯乙酸溶液均质 2 min,过滤后取上清液 5.0 mL 加入到装有 5.0 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid,TBA)溶液的具塞玻璃试管中。混合溶液在沸水浴中加热 20 min,冷却至室温后在 532 nm 处测吸光值,并做空白试验。吸光值带入1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准曲线进行计算,单位以 mg MDA/kg样品表示。
1.7.3 过氧化物值(peroxide value,POV)测定
不同贮藏时间鱼片中的过氧化值采用GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中的第一法滴定法进行测定。
1.7.4 汁液流失率测定
通过比较鱼片在贮藏一段时间后质量变化得到汁液流失率,如公式(1)所示：
(1)
式中：P,汁液流失率,%；m0,鱼片初始质量,g；mt,鱼片贮藏后质量,g。
1.7.5 鱼片感官评价
鱼片感官评价参照黄晓春等[17]的方法并做适当修改,感官评价人员对鱼片色泽、气味、可接受性方面进行考察并给出喜好性打分。感官评价分为好、较好、一般、较差和差,对应的分值分别是10、8、6、4、2分,其中刚宰杀的新鲜草鱼肉感官评分为10分。所有样品以3位数字进行标号,再送样评价,感官评价人员由13人组成,均为研究室资深理化检验员。
1.7.6 数据分析
所有实验分析均重复3次,数据以平均值±标准偏差表示。用SPSS19.0和Excel软件对实验数据进行分析和作图,采用Duncan’s多重比较进行显著性分析(P<0.05表示具有显著性差异)。
2 结果与分析
2.1 基本成分分析
鲜切草鱼片中水分、蛋白质、脂肪和灰分[g/(100 g鱼肌)]的平均值分别为(69.70±2.13)、(23.21±0.36)、(2.20±0.37)和(4.12±0.3),这与其他研究中鱼片的一些基本成分有一些差异,特别是脂类含量,这类化学成分的变化主要与鱼类营养、捕捞季节(产卵周期)、性别变化、鱼类大小、生活区以及其他环境条件密切相关。
草鱼肉中水分主要分为2种：分布于结缔组织间游离状态的自由水和与蛋白质、糖类中羟基、氨基、羧基等结合的结合水。鱼肉在贮藏过程中会因微生物、酶等作用发生生理变化,导致水分的流失,因此通过持水率变化情况可反映鱼肉在贮藏中水分与蛋白结合的状态以及鱼肉品质的变化。通过对生鱼片持水率的研究发现,涂层处理可以减少鱼片中的水分流失,从而使鱼片的观感更新鲜、色泽更鲜艳。由图1可知,鲜切草鱼片在贮藏过程中,鱼肉的持水率呈不断下降的趋势,其中贮藏前4 d,各组持水率均下降平缓；第4天后,对照组持水率下降速率加快,且明显快于其他处理组；第12天开始,对照组与Ch和Ch+CIN涂布鱼片的持水率差异显著(P<0.05)；第16天对照组持水率下降至71.2%,而同天Ch和Ch+CIN处理组的持水率分别为88.5%和91.4%。结果表明,添加抗菌涂层,鱼肉持水能力得到了提高,且Ch+CIN的效果较Ch好,这说明壳聚糖涂层能增加草鱼片的持水能力,这可能是因为壳聚糖涂层能够减少鱼片表面水分蒸发和重吸收流失的水分。JEON等[18]也报道了类似的研究结果,冷藏期间壳聚糖涂膜处理的鲱鱼和大西洋鳕鱼的汁液流失率显著低于对照组。周然等[19]的研究发现一些微生物可以分泌一种裂解肌纤维细胞的酶致使肌肉中的水分流失。而Ch+CIN这2种抗菌保鲜成分联合起来,能有效抑制裂解鱼肉肌纤维微生物的繁殖,更好地提高了鱼片的持水能力。
图1 草鱼片冷藏期间持水率的变化
Fig.1 Changes in water retention ratio of grass carp fillets during cold storage
2.2 微生物分析
图2-a分析了冷藏过程中总活菌数(total viable count,TVC)的变化,结果表明,Ch和Ch+CIN处理草鱼片中的初始TVC分别为3.18和3.38 lg CFU/g,而对照组为3.86 lg CFU/g。在不进行处理的情况下,鱼肉在贮藏过程中TVC含量会随时间而增加,而Ch和Ch+CIN处理中鱼片的菌落总数在第8天开始显著低于对照组,到贮藏12 d,Ch和Ch+CIN处理组鱼片中的TVC仍低于6.00 lg CFU/g,而对照的TVC高达8.15,高于生鱼片中TVC的最高允许限量(7.00 lg CFU/g)。结果表明,Ch和Ch+CIN处理能显著延长鲜切草鱼片的冷藏保质期。嗜冷细菌是在冷藏温度储存下导致鲜鱼腐败的主要微生物群[18]。图2-b中结果表明,随着储存时间的延长,嗜冷细菌的生长模式与TVC相似,不同的是Ch和Ch+CIN处理中鱼片的嗜冷细菌菌落总数在第4天开始就显著低于对照组,对照在第16 天时嗜冷细菌菌落总数达到8.43 lg CFU/g,而Ch和Ch+CIN处理分别为4.82和4.26 lg CFU/g,壳聚糖和壳聚糖-肉桂精油复合涂层对导致鱼片腐败的嗜冷细菌的抑制效果更显著。壳聚糖涂层对鱼肉制品的抗菌性能在文献中已有过报道,壳聚糖包被的鳕鱼和鲱鱼样品在冷藏12 d后细菌生长(琼脂平板计数总数,20 ℃)才达到最高允许限量,涂层样品较对照组减少了3个对数生长周期[20]。TSAI等[21]也发现,用1%壳聚糖溶液对生鱼片进行3 h的预处理,可延缓生鱼片中嗜中杆菌、嗜冷菌、大肠菌群、气单胞菌和弧菌属数量的增加。而影响壳聚糖抗菌作用的各种因素及其作用机制似乎与带正电荷的壳聚糖分子与带负电荷的微生物细胞膜之间的相互作用有关[20]。本研究发现,与Ch涂层相比,Ch+CIN涂层添加了天然植物精油,对腐败细菌具有更强的抑制作用。这可能是由于肉桂精油中含有高浓度的反式肉桂醛,而反式肉桂醛是一种很强的抗菌化合物,此外肉桂精油中的芳樟醇、丁香酚和其他酚类化合物也有一定的抗菌作用[22]。
a-菌落总数;b-嗜冷细菌数
图2 草鱼片冷藏期间菌落总数和嗜冷细菌数的变化
Fig.2 Changes in total viable and psychrotrophic counts of grass carp fillets during cold storage
2.3 化学品质分析
2.3.1 TVB-N值分析
贮藏中的鱼肉在内源酶以及细菌的作用下,蛋白质会分解为胺类、氨以及含氮挥发性物质和盐基态氮,这类物质总称TVB-N,TVB-N与新鲜度关系紧密,因此被作为评价鱼类等水产品变质腐败程度的重要指标。参考水产品新鲜度标准[23]：一级鲜度≤15 mg/100 g,二级鲜度≤20 mg/100 g,变质肉>20 mg/100 g。本研究通过测定在冷藏条件下鱼片中的TVB-N值来分析抗菌涂层对鱼片的保鲜效果。由图3可以看出,随着贮藏时间的延长,鲜切草鱼片的TVB-N值逐渐上升,表明其鱼肉腐败加剧,大量含氮挥发物释放。在贮藏前4 d,所有组TVB-N值均缓慢上升,其后对照组上升趋势加剧,TVB-N值随贮藏时间的延长而显著较高(P<0.05)。在第8天,对照组的TVB-N值为22.66 mg/100 g,达到变质肉标准,而抗菌涂层处理组的TVB-N值在整个保存期内都保持在变质肉标准以下。由于TVB-N主要是由鱼肉的细菌分解而产生的,而冷藏8 d后对照样品的总活菌数比处理组显著增高,所以这可能就是对照组冷藏8 d 后TVB-N值显著增高的原因。JEON等[18]使用可溶性壳聚糖涂料处理鳕鱼和鲱鱼鱼片发现,在12 d储存期结束时,处理组的TVB-N较对照组分别减少了33%～50%和26%～51%。TSAI等[21]也发现使用1%壳聚糖溶液预处理生鱼片3 h,显著延缓了鱼片中TVB-N的增加。在本研究中,涂布Ch+CIN鱼片的TVB-N值在12 d后显著低于只涂布Ch的样品(P<0.05),这可能归功于肉桂精油的强力抗菌作用。
图3 草鱼片冷藏期间TVB-N值的变化
Fig.3 Changes in TVB-N of grass carp fillets during cold storage
2.3.2 TBA分析
含脂食品中不饱和脂肪酸的氧化产物丙二醛可以与TBA试剂反应生成红色化合物,并且在波长532 nm处有最大吸收峰,因此,TBA可以用来反映鱼肉中脂肪氧化程度,并以此判断其腐败程度[19-20]。由图4可知,冷藏草鱼片的TBA值随时间的延长逐渐增加。涂布了抗菌涂层剂的处理组TBA值均低于对照组,这可能是因为添加抗菌涂层剂后,减轻了因微生物释放出的酶类作用导致的鱼肉肌纤维细胞裂解[19],从而加剧了其中脂肪的氧化；其中Ch+CIN处理组TBA值上升趋势最为缓和,且始终低于其他组,这可能是因为肉桂醛的抗氧化作用抑制了草鱼片脂肪的腐败氧化。第16天,Ch+CIN处理组TBA值仅为0.19 mg MDA/kg,显著低于对照组的0.26 mg MDA/kg(P<0.05)。研究表明壳聚糖的阻隔性能可能有助于控制草鱼片中的脂质氧化,这也是壳聚糖抗氧化性在食品中的应用之一[1],而在壳聚糖涂层中加入肉桂油可能具有协同作用。有研究者建议,质量良好的鱼肉TBA值应<5.00 mg MDA/kg[27],在本研究中,对照和涂布抗菌涂料的草鱼鱼片样品的TBA值在16 d的冷藏期内都远远低于该建议的临界值。
图4 草鱼片冷藏期间TBA值的变化
Fig.4 Changes in TBA of grass carp fillets during cold storage
2.3.3 POV
涂层对鱼片POV变化的影响如图5所示,鱼片样品的POV随贮藏时间的延长而显著增加,在贮藏第16天时,对照组(6.12 meq/kg)与Ch(4.34 meq/kg)和Ch+CIN(3.92 meq/kg)涂布鱼片样品的POV差异显著(P<0.05)。研究结果表明,壳聚糖涂层能有效地抑制冷藏保存草鱼片中POV的产生。这些结果与JEON等[18]报道的壳聚糖涂层能有效地延缓鲱鱼鱼片中初级脂质氧化产物的产生的结果一致。
图5 草鱼片冷藏期间POV的变化
Fig.5 Changes in POV of grass carp fillets during cold storage
2.4 感官评价分析
对草鱼片冷藏期间的感官性状进行了评定,结果如表1所示。对照组和涂层剂处理组的鱼片质地、气味和色泽均在第8天开始出现显著差异(P<0.05),且在冷藏12 d后Ch+CIN和Ch处理组与对照组相比出现显著差异(P<0.05),说明壳聚糖联合肉桂精油对草鱼片冷藏期间的感官品质保持具有更好的效果。对照样品(无涂层处理)在第8天开始出现腐败现象,同时鱼片出现质地松散、有异味和褪色,这些现象可能跟鱼片中水分的丢失、脂质的高度氧化、腐败菌的大量繁殖等有关。而添加了抗菌保鲜涂层后,其抗氧化、抑菌和气体阻隔效果使得鱼片氧化和品质劣化程度最小化,延长了产品保质期,同时保证了产品品质。
表1 处理草鱼片冷藏期间的感官性状变化
Table 1 Changes in sensory characteristics of grass carp fillets during cold storage
感官性状处理冷藏时间/d0481216质地对照10±0.00a10±0.00a6.0±0.00b2.0±0.00b2.0±0.00cCh10±0.00a10±0.00a9.5±0.15a9.5±0.15a8.8±0.33bCh+CIN10±0.00a10±0.00a9.5±0.15a9.5±0.15a9.5±0.15a气味对照10±0.00a10±0.00a5.4±0.21b2.0±0.00b2.0±0.00bCh9.3±0.18a9.8±0.28a9.2±0.21a9.2±0.21a9.0±0.32aCh+CIN9.1±0.44a9.0±0.24a9.2±0.83a9.3±0.83a9.0±0.32a色泽对照10±0.00a8.8±0.33ab7.0±0.21b4.3±0.32b4.0±0.00cCh9.2±0.32a9.0±0.32a9.0±0.32a8.2±0.80a7.6±0.60bCh+CIN9.1±0.36a9.1±0.24a9.2±0.34a8.5±0.42a9.2±0.21a总体评价对照10±0.00a9.0±0.42ab7.0±0.21b2.5±0.32b2.2±0.22bCh10±0.00a9.5±0.22a9.0±0.34ab9.0±0.40a8.5±0.42aCh+CIN9.5±0.36a9.6±0.36a9.5±0.23a9.2±0.44a9.2±0.44a
注：同行不同字母代表差异显著(P<0.05)
3 结论
本研究制备了一种能抑制草鱼片脂质氧化和微生物生长的含肉桂精油壳聚糖涂层,抗菌保鲜涂层用于冷藏草鱼片的储藏保鲜结果表明,添加抗菌涂层后,鱼肉持水能力得到了提高,且Ch+CIN的效果大于Ch,使鱼肉的观感和色泽得以保持更长时间。壳聚糖涂层和含肉桂精油壳聚糖涂层均能很好地抑制草鱼片冷藏期间菌落总数和嗜冷菌数的增加,与Ch涂层相比,Ch+CIN涂层添加了天然植物精油,对腐败细菌具有更强的抑制作用。添加抗菌涂层Ch和Ch+CIN后,冷藏草鱼片中TVB-N含量、TBARS、POV随着冷藏时间的增加分别在冷藏第8、16天、冷藏第16天较对照出现了显著下降,且涂布Ch+CIN鱼片的TVB-N值在12 d后显著低于只涂布Ch的鱼片,说明Ch+CIN涂层对鱼片的保鲜效果更好。感官特性分析表明无涂层对照组和涂层处理组的鱼片质地、气味和色泽均在第8天开始出现显著差异,在冷藏12 d后Ch+CIN和Ch处理组出现显著差异。综上所述,在冷藏16 d内Ch+CIN涂层处理草鱼片能很好地保持草鱼片的感官特性,延长草鱼鱼片的保质期,直至储存周期(第16天)都没有出现任何明显的质地、气味、色泽变化,且无显著微生物生长,保质期达到16 d以上,较无涂层空白对照延长货架期8 d以上。因此壳聚糖和肉桂精油处理草鱼片能增加冷藏期间草鱼片的防腐保鲜能力,而壳聚糖与肉桂精油同时使用可以为冷藏草鱼片提供更好的防腐保鲜效果,这也是一种可用作水产品储藏保鲜的安全、方便和高效的活性涂层材料。
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