红枣,具有补中益气,养血安神等功效,被《中国药典》收录为药食同源食品[1]。我国陕西沿黄流域地区红枣的栽培面积约17.342万hm2,年产量达70万t,是红枣重要优生区之一[2]。国内红枣产业存在加工产品附加值低、科技含量相对较低等问题[3-4]。益生菌发酵不仅能除去原果中苦味、涩味等不良风味,还能赋予红枣更为丰富、浓郁的香味成分,提高其营养价值及产品附加值[5-7]。
顶空气相色谱-离子迁移谱联用技术(headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy,HS-GC-IMS)将气相色谱与离子迁移谱有效结合,克服了GC-MS耗时长、解谱难,电子鼻法精度较低、易漂移,气相色谱嗅觉测量法(GC-O)稳定性不高等缺点[8-9]。在食品风味分析及香气指纹图谱构建中显示出巨大的发展潜力[10]。
课题组前期从蜂蜜中分离出的2株产香物质丰富的产香酵母菌,具有独特的应用开发前景。本研究以陕北佳县红枣为原料,通过测定产香酵母及乳杆菌发酵后红枣汁理化指标,结合HS-GC-IMS对挥发性香气成分进行定性,确定不同菌种发酵红枣汁香气指纹图谱,初步探究益生菌发酵对红枣汁品质及香气成分的影响。研究结果可对后续益生菌发酵红枣汁的工业生产菌种筛选、品质评价提供理论依据,并进一步拓宽HS-GC-IMS技术在红枣资源开发与利用的应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干红枣,陕西佳县；酵母菌(Zygosaccharomyces sp.XDJM-1；Zygosaccharomyces sp.XDJM-2)为分离自蜂蜜中的产香酵母菌,均为本实验室保存；保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus,LB),北京川秀科技有限公司；MRS琼脂、MRS肉汤,北京陆桥；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、邻苯三酚、重铬酸钾、2,6-二氯靛酚,西安三浦化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Flavour Spec®气相离子迁移谱联用仪,德国G.S.A公司；SW-CJ-2FD超净工作台,苏州净化设备有限公司；TGL-206R离心机,上海安亭科学仪器厂；DSX-280KB24灭菌锅,上海申安医疗器械厂；DHP-9162恒温培养箱,上海齐欣科学仪器有限公司；722型紫外分光光度计,青岛聚创环保设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化
将冻存酵母菌及乳杆菌分别划线接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)及MRS平板上过夜培养,挑取单克隆转接于YPD及MRS液体培养基中,分别在28、42 ℃下培养36 h。用无菌超纯水清洗菌体2次,离心收集菌体,4 ℃贮存备用。
1.3.2 红枣发酵汁制备
(1)清汁制备：选取无霉烂红枣,洗净、蒸煮4 h。红枣与水质量比1∶3打浆,过滤后加入0.15%的果胶酶进行酶解。离心,取上清液,65 ℃灭菌25 min。
(2)接种发酵：将酵母菌与乳杆菌分别以0.1%及0.5%(质量分数)的比例接种于灭菌红枣汁中。酵母菌发酵汁、乳杆菌发酵汁及灭菌清汁分别在28、42 ℃下培养4 d,发酵完成后于4 ℃贮存。
1.3.3 理化指标测定
维生素C含量参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》第三法2,6-二氯靛酚滴定法测定；酒精含量采用比色法测定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定采用邻苯三酚自氧化法；可溶性固形物采用手持折光仪测定。
1.3.4 HS-GC-IMS分析
(1)样品前处理：取1 mL样品80 ℃孵化15 min,进样针85 ℃进样500 μL。
(2)色谱柱：FC-SE-54；色谱柱温度40 ℃；载气：高纯N2(纯度>99.999%)；设置程序流速2.00 mL/min保持2 min,20 min内线性增至100 mL/min。
(3)IMS条件：漂移管温度45 ℃；漂移气：N2(纯度>99.999%)；漂移气流速150 mL/min。
1.3.5 感官评价
感官评价方法参照GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》。将3种红枣发酵汁(XDJM-1、XDJM-2、LB)与未发酵的红枣汁(CK)随机编号,邀请7名受过专业训练的品评人员,分别从色泽(包括颜色明亮度、澄清度、均匀度)、香气(包括果香味、酒花香味)、组织形态、口感(包括甜度、酸度、酸甜适宜度、苦度、辛辣度)4个方面进行评价[8]。感官评价以10分为标准,对7位品评者的打分结果进行统计分析。
1.3.6 数据处理
最终数据以(平均值±标准偏差)表示,采用Graph pad prism 8.0软件进行数据处理及绘图。
HS-GC-IMS风味成分通过GC-IMS Library search 1.0.3软件进行分析,并采用LAV中Gallery插件构建指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 理化指标
如表1所示,不同菌种发酵后红枣汁乙醇含量及SOD酶活性存在显著差异。虽然乳杆菌发酵红枣汁的维生素C含量最高(0.73 g/L),但不同组间维生素C含量无显著差异(表1,图1-a)。不同菌种发酵红枣汁乙醇含量、可溶性固形物及SOD酶活性与对照组相比存在显著差异(P<0.05)(表1)。酵母菌XDJM-1、XDJM-2发酵后乙醇体积分数分别为1.30%及1.47%,极显著高于乳杆菌发酵组及对照组(图1-b),而可溶性固形物均低于乳杆菌发酵汁(图1-d),这是由于发酵产酒精过程消耗其可溶性固形物,与其产酒精能力相对应。经益生菌发酵后,红枣汁SOD酶活性均显著提高,其中LB发酵枣汁的SOD酶活性达7.19 U/mL,极显著高于对照及酵母组(图1-c)。
表1 不同菌种发酵枣汁的理化指标
Table 1 Physical and chemical indexes of jujube juices fermented by different strains
菌种维生素C/(g·L-1)乙醇体积分数/%SOD活性/(U·mL-1)可溶性固形物/°Brix对照0.67±0.050.06±0.034.52±0.1813.6±2.3XDJM-10.63±0.061.30±0.145.59±0.089.6±1.2XDJM-20.62±0.071.47±0.095.83±0.119.7±0.2LB0.73±0.120.10±0.047.19±0.1010.8±0.5
2.2 HS-GC-IMS二维谱图分析
图2为不同菌种发酵红枣汁HS-GC-IMS指纹图谱,横坐标为离子迁移时间,纵坐标为气相色谱保留时间,红色竖线为反应离子峰(reaction ion peak,RIP),其右侧的每一个点代表一种挥发性有机物,颜色随物质浓度增高而加深,整个谱图代表了发酵红枣汁的全部顶空成分。由三维谱图(图2-b)及其二维投影谱图(图2-a)可以看出红枣汁经酵母菌发酵后样品挥发性组分相对丰度明显高于乳杆菌发酵样品,且挥发性组分具有较明显差异。其中圆圈标注位置为乳杆菌发酵样品LB特有挥发性物质组分,方形标注位置为酵母菌发酵样品特有挥发性物质组分。
2.3 不同菌种发酵红枣汁的挥发性组分定性分析
采用HS-GC-IMS内置NIST数据库进一步定性分析,从XDJM-1、XDJM-2、LB发酵红枣汁中共识别出39种挥发性成分(表2)。主要为醛酮类及醇类化合物,其中酮类化合物10种,醛类化合物8种,醇类化合物7种,酯类化合物6种,杂环类化合物5种,酸类化合物2种,醚类化合物1种(表2)。乳杆菌发酵红枣汁香型主要为醛香型,酵母菌发酵后则以酮醇香型为主。研究表明,红枣汁香气成分主要以酮类及醛类物质为主,经过发酵后逐渐生成酯类及醇类组分[13]。本研究中红枣汁均为轻度发酵,因此生成的酯类及醇类物质较少,与上述究结果一致。
a-维生素C含量;b-乙醇含量;c-SOD酶活性;d-可溶性固形物
图1 不同菌株发酵红枣汁理化指标
Fig.1 Physical and chemical indexes of jujube juices fermented by different strains
注：****：P<0.000 1；***：P<0.000 2；*：P<0.05
a-HS-GC-IMS 二维谱图;b-HS-GC-IMS 三维谱图
图2 不同菌种发酵红枣汁HS-GC-IMS谱图
Fig.2 HS-GC-IMS spectrum of jujube juices fermented by different strains
构建不同菌种发酵红枣汁香气指纹图谱,比较挥发性组分不同样品间相对丰度差异(图3)。醛酮类化合物是红枣特征香气物质的主要成分,同时可以使红枣发酵产品感官香气更为明显。乳杆菌发酵红枣汁中苯甲醛、戊醛、糠醛、3-甲基丁醛相对丰度均显著高于酵母菌发酵产物(表2,图3)。其中苯甲醛呈果香味,3-甲基丁醛呈水果香,糠醛属于芳香族醛,赋予发酵汁焦糖香味及苦杏仁味[11]。乳杆菌发酵红枣汁醛类化合物显著高于酵母发酵,可能与红枣汁中抗坏血酸在微生物作用下降解生成大量的C6～C9小分子醛和糠醛有关。胡贝多等[12]选取6种商业益生菌分别对红枣汁进行发酵,研究发现发酵红枣汁的特征风味主要来源于氮氧化物、广谱甲基类、硫化物、萜烯类、乙醇和芳香化合物,这与本研究结果略有差异,推测与红枣成熟度、干燥度及产地有关。马腾臻等[1]以甘肃地区的红枣为原料酿造红枣酒,共鉴定出10种醛酮类化合物,与本研究中乳杆菌发酵汁风味结果较为相似。酵母菌发酵红枣汁中除苯乙酮外,剩余9种酮类化合物相对丰度均远高于乳杆菌发酵产物。其中2,3-戊二酮、2,3-丁二酮及乙偶姻赋予发酵汁愉快的奶油香味。3-辛酮、2-戊酮具有典型的水果及植物香气,且为酵母发酵汁中特有的香气组分[13]。有研究报道酮类化合物为新鲜红枣汁重要香气成分[14]。而醛酮类物质属于不稳定的中间化合物,随着不同菌种的发酵,其产物变化也相对较大,因此本研究中乳杆菌和酵母菌发酵红枣汁分别呈现醛香型和酮醇香型。由于本研究中酵母菌及乳杆菌发酵红枣汁的时间与果酒相比较短,因此对发酵过程中醛酮类物质的代谢及转化影响相对较少。
酯类物质具有较强的果香及花香的感官性质,对红枣汁及发酵汁特殊香气的形成具有非常重要的贡献[11]。本研究中除乙酸己酯在乳杆菌发酵红枣汁中相对丰度略高于酵母菌发酵汁外,红枣汁经酵母菌发酵后酯类物质种类及相对丰度均高于乳杆菌发酵。其中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯为酵母菌发酵红枣汁特有组分(表2,图3)。乙酸乙酯具有类似苹果、桃等果香及花香味,是红枣果酒中酯类香气的重要组分。乙酸己酯及乙酸异戊酯具有强烈的香蕉、梨等甜水果香气[9],乙酸苯乙酯则赋予红枣发酵汁浓郁的花香气。本研究中酵母发酵产生大量醇类物质,脂肪酸、醇经过发酵和陈酿不断酯化生成酯类物质,而乳杆菌发酵过程中醇类物质较少,其酯类物质种类也较少。因此酵母菌与乳杆菌发酵红枣汁酯类物质相对丰度及种类具有较大差异,而丰富的酯类物质可赋予红枣发酵汁令人愉悦的果香及花香气味[1,15]。其次,不同酵母发酵后其酯类物质种类与相对丰度也略有差异,任晓宇等[11]发现红枣白兰地中含量较高的酯类物质为月桂酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯,与本研究略有不同,可能与红枣的原料产地、酵母种类、加工工艺以及发酵液的含糖量有关[16-18]。
发酵过程使红枣中的氨基酸和糖发生转化,亚麻酸降解物氧化生成醇类化合物[11]。醇类化合物赋予发酵汁新鲜的醇香风味,同时也是发酵果汁中酯类化合物重要的前体物质[9,12]。红枣汁经乳杆菌发酵后正丁醇、2-甲基丙醇相对丰度高于酵母菌发酵,其中正丁醇具有水果醇香味,2-甲基丙醇则主要起到呈香呈味作用[16]。酵母菌发酵后醇类物质种类多于乳杆菌发酵,且异戊醇、2-甲基丁醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇均为酵母菌发酵特有产物(表2,图3)。醇类是发酵过程中酵母代谢形成的重要次级代谢产物,其含量易受发酵条件和酶解条件等因素的影响[19]。有文献表明果酒的清香气味主要来自于C6～C9的醛醇类化合物,由脂肪酸经过逐步氧化、裂解及还原形成[3]。异戊醇与2-甲基丁醇均为杂醇油,具有苹果、白兰地、辛辣味,是果酒发酵中主要的呈香组分之一[8,16]。3-甲基-3-丁烯-1-醇赋予红枣发酵汁辛辣味与水果气味。但只有当高级醇与酸、酯比例协调时才有助于丰富枣酒风味成分[16]。本研究中乳杆菌在红枣汁发酵过程中对醇类物质生成过程影响较小,而酵母菌通过一系列氧化还原、酯化反应将醛类物质代谢为其他的醇酸酯类物质。
杂环类物质虽然相对丰度较低,但是具有独特的风味,对红枣发酵汁特征香气的形成也有一定的作用[20]。2-乙基呋喃、2,6-二甲基吡嗪及正戊基呋喃是酵母菌发酵汁中特有的杂环类物质,2-乙基呋喃具有甜香、咖啡香和薄荷芳香风味,2,6-二甲基吡嗪呈现咖啡和炒花生的气味,正戊基呋喃则具有青草香气。异戊酸、2-甲基丙酸是酵母菌发酵汁中主要的脂肪酸类化合物,具有甜润的果香、奶酪味及脂肪味,对发酵产物风味呈现正向贡献。虽然本研究中红枣发酵汁中酸类物质种类较少,且仅酵母发酵汁中有2种脂肪酸类物质,但发酵饮品中的脂肪酸类物质主要为微生物代谢生成的副产物,对红枣发酵汁特征风味的形成也有重要影响[5]。
由不同菌种发酵红枣汁特征风味指纹图谱可发现(图3),酵母菌与乳杆菌发酵枣汁的风味物质的种类和相对丰度存在较大差异,且酵母菌发酵后风味组分及丰度均高于乳杆菌发酵。其中A区域为酵母及乳杆菌发酵共有组分,主要为苯乙酮、苯甲酸甲酯、苯乙醛和2-乙酰基呋喃,这部分物质受发酵菌种影响较小,推测为红枣中原有组分。B区域为乳杆菌发酵优势组分,主要为醛类物质并赋予乳杆菌发酵汁醛香型特性。C区域为酵母菌发酵优势组分,主要为酮类物质及杂环类化合物。D区域为酵母菌发酵特有组分,主要为酮类化合物和醇类化合物,共同赋予酵母发酵红枣汁酮醇香型特性。另一方面,不同酵母菌间风味成分也略有差异,例如XDJM-2发酵后乙偶姻、2-乙酰基呋喃(二聚体)、乙酸苯乙酯、3-辛酮、正戊基呋喃、乙酸异戊酯、异戊酸等呈香性物质相对丰度均略高于XDJM-1发酵红枣汁。相比于醛类对乳杆菌发酵汁风味物质的重要影响,酯类则在酵母菌发酵汁的特征香气中占主导作用,并与其他醇酮类物质相互协调,共同赋予酵母菌发酵枣汁独特的风味和良好的口感。
表2 发酵红枣汁挥发性风味成分的定性分析
Table 2 Volatile compounds identified in fermented jujube juice
序号化合物名称风味描述XDJM-1XDJM-2LB1苯乙酮山楂、水果、花香+++2苯乙酮(二聚体)山楂、水果、花香+++3苯甲酸甲酯酚、樱桃核+++4苯甲酸甲酯(二聚体)酚、樱桃核+++5苯乙醛花香+++62-乙酰基呋喃苦杏仁+++7乙酸己酯水果、梨、苹果+++8戊醛发酵、面包、果浆+++9正丁醇杂醇油、水果、甜味、香脂、威士忌--+10糠醛焦糖、花香、杏仁、苦味+++112-甲基丙醇醚味、酒味、果皮+++123-甲基丁醛果味(桃子)、发酵、巧克力、青草、杏仁、坚果+++13苯甲醛杏仁、果味、粉末、坚果、苦味+++14苯甲醛(二聚体)杏仁、果味、粉末、坚果、苦味+++152,3-戊二酮甜香、奶油、焦糖、坚果+++162,3-丁二酮甜香、奶油+++17正己醇刺鼻、扩散、杂醇油、油、果味、甜味、酒味、青草+++186-甲基-5-庚烯-2-酮水果、柠檬++-19乙偶姻甜香、奶油+++202-乙酰基呋喃(二聚体)苦杏仁+++21乙酸苯乙酯花香、桃子、水果-++223-辛酮霉味、蘑菇、酮、干酪、青草、发酵、植物++-23正戊基呋喃青草+++24甲硫基丙醛洋葱、肉+++252,6-二甲基吡嗪烤香、咖啡、花生、土豆++-26二烯丙基硫醚-++-272-甲基丙酸酸味、腐臭味++-283-甲基丁醇苹果、白兰地、辛辣++-293-甲基丁醇(二聚体)苹果、白兰地、辛辣++-302-甲基丁醇杂醇油、香脂、酒精、刺鼻,白兰地、果味(香蕉)、糖浆++-313-甲基-3-丁烯-1-醇-++-322-乙基呋喃焦糖、咖啡、甜香++-332-戊酮橘皮、甜、水果++-342-戊酮(二聚体)橘皮、甜、水果++-35(E)-2-庚烯醛青草++-36羟基丙酮-++-37乙酸异戊酯甜味、香蕉、清新、果味(酯)++-38异戊酸干酪、奶制品、水果++-39乙酸乙酯果味(橙)、醋、扩散、焦糖、甜味、黄油、刺鼻、葡萄、朗姆酒++-
注：表中“+”代表化合物被检出,“-”代表化合物未检出
图3 不同菌种发酵红枣汁的指纹谱图
Fig.3 Fingerprints of jujube juices fermented by different strains
2.4 感官评价
红枣汁经3种益生菌发酵后整体感官评分均显著高于对照组,其中酵母菌XDJM-1发酵红枣汁的总风味评分最高。乳杆菌与酵母菌发酵红枣汁间各项指标均有一定差异。而2种酵母菌发酵汁除在口感方面具有显著差异外,在色泽、组织形态、香气均无显著差异(图4-a)。
酵母菌发酵红枣汁组织形态整体优于乳杆菌发酵汁。2种发酵汁香气类型具有显著差异,其中乳杆菌发酵汁果香味较突出,而酵母发酵红枣汁中酒花香味是表征其总风味的主要香气,其中,XDJM-1发酵后酒花香味更为浓郁,评分显著高于XDJM-2(P<0.05)(图4-b)。红枣汁经酵母菌发酵后乙醇含量显著提高,同时HS-GC-IMS中定性出酵母发酵特有的3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、乙酸乙酯及乙酸异戊酯等都有助于酒花香味的形成与突出,这与感官评价结果相符。
红枣汁在不同益生菌发酵后,甜度和苦度均显著下降,整体口感差别较大。乳杆菌发酵汁酸度显著高于酵母发酵汁,这与其发酵产酸特性相对应。红枣汁经酵母菌发酵后其辛辣度显著提高,一方面由于乙醇含量显著提高,另一方面推测可能与特有的3-甲基丁醇、2-甲基丁醇等香气组分特性相关。不同酵母菌在辛辣度、苦度以及酸甜协调度上均存在显著差异,其中XDJM-1的酸甜协调度评分最高,XDJM-2的苦度、辛辣度评分较高,因此在红枣发酵后续开发中应注重调节和改善(图4-c)。
a-综合评价；b-外观、香气评价；c-口感评价
图4 不同菌种发酵红枣汁感官评价雷达图
Fig.4 Radar map of sensory evaluation of jujube juice fermented by different strains
3 结论
本研究采用蜂蜜中分离的产香酵母及乳杆菌分别对陕北佳县红枣汁进行发酵。其中,产香酵母发酵对红枣汁乙醇含量影响显著,最高达1.62%,发酵后酒花香突出,酸甜协调度最优；乳杆菌发酵对红枣汁SOD活性影响显著,最高为7.19 U/mL,发酵后果香突出,酸度较高。发酵后总风味、口感、香气、组织形态及色泽均显著提高。通过HS-GC-IMS在发酵红枣汁中共定性出39种风味物质,主要为醛酮类、醇类及酯类。酵母菌发酵后香气物质种类及相对丰度明显高于乳杆菌发酵,其中异戊醇、2-甲基丁醇、2-乙基呋喃、2-戊酮、乙酸乙酯、乙酸异戊酯是酵母菌区分于乳杆菌发酵产品的主要香气物质。研究结果显示,前期研究从蜂蜜中分离的产香酵母具有较好的产香特征,乳杆菌则会提高红枣发酵汁生物活性。该研究为进一步拓宽HS-GC-IMS应用范围,及后续蜂蜜产香酵母在益生菌发酵红枣汁中产业化应用、工艺开发提供了理论依据。
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