谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为革兰氏阳性菌,是氨基酸领域最常用的发酵菌株[1-2],安全无害、繁殖迅速、容易培养,在规模发酵生产中极具潜力[3-4]。随着基因工程等技术的快速发展,利用谷氨酸棒杆菌工业生产L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸等实现了规模化,这些氨基酸被广泛应用于营养保健品、食品添加剂及药物制备等领域[5]。目前,基于代谢工程育种技术已逐步应用到谷氨酸棒杆菌的改良[6],主要通过基因增强、定点突变和无痕敲除等方法对氨基酸合成网络进行增流、疏通和截流等[7]。
在谷氨酸棒杆菌中,调控氨基酸合成网络中的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)供应至关重要。维持细胞内ATP的供应是发酵中细胞正常生长和代谢的关键,提高ATP的供应可改善细胞工厂实现终产物氨基酸的增产[8]。对于谷氨酸棒杆菌的发酵,虽然可通过改变能量底物添加的量和时间控制胞外能量输入,但会增加生产的总成本。因此,应用基因工程等方法[9]对胞内ATP供应进行优化,对实现氨基酸的增产有积极的推动作用。本文综述了近年来通过调控ATP供应实现谷氨酸棒杆菌氨基酸增产的研究进展,并对调控ATP供应的一些新的发展趋势进行介绍。
1 谷氨酸棒杆菌中的ATP
ATP可为细胞供应能量[10],对细胞的生长和维持[11]、终产物出口至关重要。ATP几乎参与所有代谢物的合成途径[12-13],如在谷氨酸棒杆菌中,1 mol精氨酸的生物合成至少需要5 mol的ATP[14]。另外,HACKETT等[15]发现,糖酵解通量的速率是由细胞总ATP需求量决定,而不是由糖酵解酶表达决定。可见在工业菌株中,ATP对产物合成至关重要,甚至可以通过控制ATP供应来实现更高的生产浓度,更高的生产率等。对ATP需求高的产物,增加ATP的供应可以提高生物合成终产量；对于生物合成与ATP形成相结合或受到细胞内高ATP水平抑制的产物,能够通过减少ATP供应以提高产量。调控ATP的供应是实现特定生物技术目标切实可行的手段[16]。
在谷氨酸棒杆菌中,ATP可酶解为ADP和Pi,ADP和Pi通过有氧生产中的电子传递链和厌氧发酵中的糖酵解来再生ATP,即氧化磷酸化和底物水平磷酸化。在过去,一直认为谷氨酸棒杆菌是1种需氧微生物,所以氧化磷酸化是ATP形成的主要方式。然而,KOCH-KOERFGES等[17]证明氧化磷酸化对谷氨酸棒杆菌的生长不是必需的,一个缺乏ATP合酶的菌株氧化磷酸化受损,完全可以依赖于底物水平磷酸化进行ATP合成,在葡萄糖基本培养基中,它仍达到野生型约50%的生长速率的和65%的生物量。SUN等[18]发现在谷氨酸棒杆菌缺氧时,呼吸链受氧限制,为了平衡NAD+/NADH并产生更多的ATP,糖酵解途径上调,胞内底物水平磷酸化增强。ZELLE等[19]通过实验数据和网络模型的综合研究发现在野生型谷氨酸棒杆菌中,底物水平磷酸化和氧化磷酸化对ATP的产生具有同等的贡献。可见,电子传递链在谷氨酸棒杆菌中的作用可能被高估了。因此,在谷氨酸棒杆菌中通过底物水平磷酸化和氧化磷酸化生成ATP都是极其重要的。
在谷氨酸棒杆菌中,各种物质的代谢相互关联。目前,科研工作者们已基于ATP的两种再生途径操纵谷氨酸棒杆菌的代谢途径、电子传递链、NADH、ADP、基因组等调控ATP的供应,从而提高氨基酸的产量(表1)。
表1 谷氨酸棒状杆菌产氨基酸的ATP调控研究
Table 1 ATP regulation of amino acid production by Corynebacterium glutamicum
时间菌株改造途径或研究发现文献2007Corynebacterium glutamicum ATCC14067发现1株突变株F172-8的ATPase活性降低,糖酵解途径增强,可产生更多的ATP[20]2011Corynebacterium crenatum SYPA 5-5引入VHB,增加氧气摄取率,L-精氨酸产量增加17.3%[21]2013Corynebacterium glutamicum CYS过表达hisE、hisG,促进组氨酸合成途径对ATP的利用率,组氨酸效价提高80%[22]2013Corynebacterium glutamicum ATCC 13032构建1种无前噬菌体变体MB001,基因组减少6%,避免不必要的ATP消耗[23]2014Corynebacterium glutamicum ATCC1303过表达pgk,胞内ATP水平增加,L-精氨酸产量增加8%,L-鸟氨酸产量增加17.5%[24]2016Corynebacterium crenatum SYPA 5-5敲除Frd181、Frd188,敲除 noxA、amn,过表达pgk、pyk,增加了ATP水平,L-精氨酸产量增加80.6%[14]2018Corynebacterium glutamicum VWB-1发现1株L-缬氨酸高产菌株磷酸戊糖途径和TCA途径相关基因上调,NADPH和ATP生成能力增强[25]2018Corynebacterium glutamicum ATCC 13032消除412个基因,基因组减少13.4%,避免不必要的ATP消耗[26]2020Corynebacterium glutamicum CGMCC 1.15647 敲除NCgl0909,抑制ABC转运体对ATP的消耗,驱动更多的ATP供应于产物合成[27]2020Corynebacterium glutamicum JH41发现1株突变株JH41生长率增加58%,研究发现该菌株细胞内ATP含量比亲本高50%,并且在JH41转录组中NCgl1610等操纵子上调[28]2020Corynebacterium glutamicum JL-6 敲除sigH,使SigmaH因子失活,提高FoF1-ATP编码基因在中性pH下的表达水平,ATP水平增加,促进在混合糖中生产赖氨酸[29]
2 ATP供应优化促进谷氨酸棒杆菌产氨基酸的 策略
2.1 通过操纵代谢通量调控ATP的供应
在谷氨酸棒杆菌的代谢中,代谢通量与ATP含量密切相关。可以通过操纵代谢通量从而优化胞内ATP的分布,实现氨基酸的增产。增加产物合成路径的ATP,提高产物生成路径对ATP的利用率,或阻遏消耗ATP的副产物路径,都可以将代谢通量推向所需的方向,将更多的ATP集中于目标产物的增长。
在底物水平磷酸化中,1 mol葡萄糖形成2 mol的ATP,这是由pgk编码的甘油酸-3-磷酸激酶和pyk编码的丙酮酸激酶催化产生的[12]。在谷氨酸棒杆菌中pgk催化磷酸基从1,3-二磷酸甘油酯转移至ADP,从而生成3-磷酸甘油酸和ATP。REDDY等[24]发现在谷氨酸棒杆菌中,可以通过过表达pgk使胞内ATP水平增加,从而提高菌株的生产力。MAN等[14]对pgk和pyk同时过表达,胞内ATP水平更是显著提高,且以葡萄糖为碳源发酵生产的L-精氨酸产量亦显著增加。
LI等[20]发现1株谷氨酸棒杆菌的自发突变株F172-8出现了H+-ATPase缺陷,ATPase活性降低了75%。在以葡萄糖为碳源并富含生物素的培养基中培养该突变株时,野生株和突变株的蛋白质组进行比较结果显示,突变株中6-磷酸果糖激酶(6 phosphate fructose kinase,Pfk)、果糖-二磷酸醛缩酶(fructose 1,6 disphosphate aldolase,FdaA)、磷酸甘油酸变位酶I (Gpm)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,Pyk)的表达量都有所增加。Pfk、FdaA、Gpm、Pyk均属于糖酵解途径相关酶,这些酶的表达量上调有助于增强突变体的糖酵解途径,从而促进突变体的底物水平磷酸化。在此突变株中,ATPase活性的降低与糖酵解途径的增强,可使更多的ATP用于谷氨酸的生产。ZHANG等[25]运用转录组学和蛋白质组学相结合的分析方法,对1株高产工业菌株谷氨酸棒杆菌VWB-1进行研究,发现该菌株的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和ATP生成能力通过磷酸戊糖途径和三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环途径相关基因的上调而增强。因此,操纵代谢通量增加产物合成途径的ATP供应,有利于产物的合成。
提高产物合成途径对ATP的利用率也可以提高谷氨酸棒杆菌生产氨基酸的性能。CHENG等[22]过表达了谷氨酸棒杆菌中hisE编码的磷酸核糖ATP焦磷酸水解酶和hisG编码的ATP磷酸核糖转移酶,促进了组氨酸合成途径对ATP的利用率,组氨酸效价提高了80%。
另外,阻断消耗ATP的副产物途径也可以有效提高产物形成所需的ATP供应。司雅楠[27]发现NCgl0909敲除菌株可以提高胞内ATP含量。NCgl0909基因用于编码ABC转运体,ABC转运蛋白包含有ATP酶活性的跨膜结构域,表明NCgl0909可能结合并水解ATP为物质的跨膜运输提供能量。而在谷氨酸棒杆菌中,敲除NCgl0909可以抑制ABC转运体对ATP的消耗,能够驱动更多的ATP供应于产物合成。因此,增加产物合成路径的ATP,提高产物生成路径对ATP的利用率,或阻遏消耗ATP的副产物路径,都可以提高菌株的生产性能。
2.2 通过操纵电子传递链调控ATP
仅通过底物水平磷酸化产生的ATP并不能满足氨基酸的大量生产,谷氨酸棒杆菌还要能够通过电子传递链的氧化磷酸化产生ATP[30]。据报道称将pH值控制在适当酸性水平会产生质子动力,进而驱动呼吸链中的ATP合酶的活性,从而增强胞内ATP供应[31]。然而,提高ATP供应的酸碱度范围有限,因为较低的酸碱度会抑制细胞生长或细胞代谢。因此,利用代谢工程等手段操纵电子传递链影响ATP的供应与氨基酸的生产引起研究者们的广泛关注。
2.2.1 电子呼吸链氧化酶的供应
谷氨酸棒杆菌的分支需氧呼吸链由几种脱氢酶组成,用来还原甲萘醌[32]。从甲萘醌到氧的电子转移由细胞色素bc1-aa3超复合物(bc1-aa3分支)或细胞色素bd氧化酶(bd分支)催化。bc1-aa3分支的产能效率明显高于bd分支[32]。细胞色素bd氧化酶途径在微需氧条件下是必需的,而bc1-aa3超复合物途径在富氧条件下占优势[33]。
WOLF等[34]发现在谷氨酸棒杆菌中,cyaB敲除使菌株细胞色素bc1-aa3超复合物的表达量减少,会影响谷氨酸棒杆菌质子动力,继而影响氧化磷酸化代谢途径中的相关反应。说明电子呼吸链氧化酶的表达量降低会破坏氧化磷酸化从而使胞内能量受损。PARK等[28]发现谷氨酸棒杆菌突变株JH41比野生型生长快58%,比较二者转录组发现该菌株细胞内ATP含量比亲本高50%。研究发现在JH41转录组中NCgl1610操纵子上调,NCgl1610操纵子在细胞色素c氧化酶的组装和氧化还原控制中起作用。NCgl1610操纵子上调,会使电子呼吸链氧化酶供应增加,提升胞内氧化磷酸化水平,从而使ATP增加,调控产物的合成。因此,通过操纵电子呼吸链氧化酶的表达量,可以影响氧化磷酸化使胞内能量受到调控,从而影响氨基酸产量。
2.2.2 氧气的供应
在电子传递链中,末端电子受体的供应至关重要。在谷氨酸棒杆菌中,氧气是最常见的末端电子受体[32]。在工业生产过程中,培养液中氧的丰度是ATP产生的决定性环境因素,可以通过生物反应器中的搅拌速度控制曝气速率或向培养液中加入氧载体等方法加强氧气输送,从而促进生物合成。对于谷氨酸棒杆菌也可以利用代谢工程等手段对胞内氧气供应进行优化。增加氧气摄取率,或者促进氧气更多转移至有氧呼吸途径有效增加胞内ATP供应[12]。
SUN等[18]发现在谷氨酸棒杆菌中缺氧会诱导NCgl0328和NCgl0603下调,导致从NADH到NAD+的循环受到限制而不利于产生ATP。因此,不同的氧气供应对谷氨酸棒杆菌的物质和能量代谢以及细胞氧化还原有很大影响。XU等[21]证实在谷氨酸棒杆菌中,引入透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHB)可以通过增加氧气摄取率从而提高左旋精氨酸的产量。VHB可与末端呼吸氧化酶直接相互作用,加大氧气输送率从而提高氧化磷酸化,促进ATP的产生。因此,氧气的供应也是优化谷氨酸棒杆菌发酵产氨基酸的重要因素。
2.2.3 ATP合酶的供应
ATP合酶,又称FoF1-ATP酶,它可以将ATP合成与质子梯度相偶联[32],对pH值的稳态和膜电位的产生以及ATP的合成都至关重要。在氧化磷酸化中,电子传递链产生的能量转变为跨膜质子(H+)梯度差,然后使ATP合酶通过旋转机制驱动ATP生成。
谷氨酸棒杆菌ATP合成酶操纵子包含8个结构基因和2个相邻基因cg1360和cg1361。cg1360是一个具有4个跨膜螺旋的疏水蛋白。WANG等[35]发现cg1360的缺失导致以葡萄糖和乙酸为碳源的细胞生长显著减少,ATP驱动的质子泵活性和ATP酶活性均降低。因此,cg1360可作为一个有效的工程靶点来提高谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量。XU等[29]设计谷氨酸棒杆菌中SigmaH因子失活,提高FoF1-ATP编码基因在中性pH下的表达水平,也可促进在混合糖中生产赖氨酸。因此,操纵ATP合酶的供应会影响ATP合成,从而影响终产物氨基酸的生产量。
谷氨酸棒杆菌好氧,其部分ATP是通过氧化磷酸化生成的。利用基因工程等手段改善电子传递链,是提高ATP合成速率、增加氨基酸生产效率的关键举措。但是,胞内呼吸链受到复杂而严格的调控,涉及氧化磷酸化反应代谢途径的修饰或过表达通常会导致氧化还原失衡[31],从而显著降低工程微生物的生长性能和生物合成能力。因此,通过操纵电子传递链从而调控ATP的供应需要更多的研究。
2.3 通过操纵NADH调控胞内ATP
ATP再生是氨基酸产生的关键步骤,加强ATP再生能力,维持细胞的能量平衡状态有利于产生氨基酸[36]。对于谷氨酸棒杆菌而言,NADH的可用性对ATP的再生至关重要。因此,通过操纵NADH的供应可调控胞内ATP,从而增加氨基酸产量。通过氧化磷酸化和底物水平磷酸化都可以使胞内NADH生成ATP。当有氧时,NADH是氧化磷酸化中最重要的电子供体,产生大量ATP。在缺氧时,通过发酵途径进行NADH的氧化,能量生成首要来自底物水平的磷酸化。INUI等[37]发现谷氨酸棒杆菌在缺氧条件下的糖酵解和TCA循环部分由胞内NAD+/NADH比率控制。因此,可以通过操纵NADH的氧化磷酸化和底物水平磷酸化调控ATP的供应。如,谷氨酸棒杆菌的sdhA基因编码琥珀酸脱氢酶的黄素蛋白,敲除sdhA基因的突变体可提高胞内NADH,进而增加NADH的电子贡献。增加的电子可通过电子传递链生成质子动力,再通过FoF1-ATP合酶促进ATP的合成,从而可提高ATP含量,进而促使谷氨酸形成[38]。
另外,NADH还能够经由NADH氧化酶直接氧化,这一过程属于非能量生成氧化。因此,可以通过降低NADH的非能量氧化使更多的NADH用于ATP的产生。MAN等[14]在谷氨酸棒杆菌中敲除2种H2O2的黄素还原酶编码基因Frd181和Frd188,降低H2O2的合成,抑制NADH的非能量生成氧化,使更多的NADH通过电子传递链进行ATP的再生,细胞内ATP水平提高有益于菌体生长和L-精氨酸的产生。MAN等[14]敲除谷氨酸棒杆菌中noxA基因,提高了氧化磷酸化途径NADH的含量从而导致ATP水平提高,致使精氨酸产量提高。noxA基因编码1种NADH氧化酶,运用分子氧为电子受体,促使NADH向NAD+进行非能量生成氧化,并形成H2O、H2O2或超氧化物。noxA基因编码的NADH氧化酶催化的NADH氧化与呼吸链中NADH氧化有较强的竞争性,并与氧化磷酸化相竞争[39]。敲除noxA基因有利于氧化磷酸化对NADH的氧化,从而导致ATP水平提高。
由此可见,通过代谢工程等手段操纵胞内NADH从调控ATP的供应,对于氨基酸的高效率产出是重要的手段之一。此外,在发酵过程中,可添加柠檬酸作为辅助能量底物,使氨基酸增产,但这种措施会提高工业生产成本[31]。
2.4 通过操纵底物水平调控ATP
腺嘌呤核苷酸[AMP(A-P)]是由腺苷和磷酸组成的一磷酸腺苷。在AMP基础上用高能磷酸键再连接1个磷酸基团为腺嘌呤核苷二磷酸ADP(A-P～P),是二磷酸腺苷。在ADP基础上用高能磷酸键再连接1个磷酸基团即为ATP(A-P～P～P)。根据胞内AMP、ADP与ATP相互转化的能量供应机理,AMP、ADP的供应直接影响细胞ATP的供应。
MAN等[14]发现amn基因的缺失促进了细胞生长和L-精氨酸的产生。amn基因编码谷氨酸棒杆菌的AMP核苷酶,催化AMP分解为5-磷酸核糖和腺嘌呤,在细胞内AMP水平调控中起作用。amn基因的敲除,抑制AMP的水解,使ATP的底物水平升高,有益于ATP的生成。
2.5 通过操纵基因组调控ATP
天然微生物通过进化获得了极其复杂的新陈代谢,以保证其在自然界中的生存。而对于菌株的大规模工业生产,在自然环境中生存所需的大量代谢、调节和应激反应特性的基因组并不都是必须的[40]。因此,剔除对细胞生长、维持和产物生物合成不必要的基因,可以避免不必要的基因转录和蛋白质合成等过程对ATP的消耗[26],可增加终产物生成途径的ATP供应。
BAUMGART等[26]消除了谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中412个基因,基因组减少了13.4%,构建的菌株降低了复杂性,表现出长期生长稳定性。可见,删除生物过程中不必要的基因,将为生物工业带来潜在的优势。该课题组还构建了谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的一种无前噬菌体变体MB001,其基因组减少了6%,该菌株在广泛的表型鉴定中没有表现出任何不利的特性[23]。在没有任何负面影响的情况下删除原噬菌体产生了一种新菌株,可提高代谢效率以及可控性,并为工业生产提供更优良的基础菌株[40]。
因此,通过消除对产品形成、细胞生长和维护不重要的基因来减少基因组,可能增加细胞ATP的供应,并提高菌株在人工发酵环境中的生产性能。
3 结论和未来展望
基于基因工程等技术,谷氨酸棒杆菌已发展为氨基酸生产领域最常用的发酵菌株。随着对谷氨酸棒杆菌及其相关亚种的生物学探索,其工业应用将更加广泛。ATP是通用的能源物质,驱动细胞内生物合成反应,可以通过增强细胞ATP供应来克服生物合成途径的饱和。
在谷氨酸棒杆菌中,对菌体内各种代谢途径进行干预,增加产物合成路径的ATP,提高产物生成路径对ATP的利用率,或阻遏消耗ATP的副产物路径,会使更多的代谢通量流向产物合成路径,同时增加产物形成所需的ATP供应。另外,通过操纵呼吸链的代谢工程也可在有氧生物生产中调控ATP的供应。但是,呼吸链的直接工程化很困难,呼吸链所涉及到的氧化磷酸化在胞内受到严格的调控。此外,操纵NADH的供应可以有效调控胞内ATP,从而使氨基酸产量升高；操纵ADP、AMP也可以直接影响胞内ATP水平从而影响氨基酸产量；且剔除谷氨酸棒杆菌胞内非必要的基因,可以减少对ATP的不必要消耗,从而提高氨基酸合成途径中ATP的供应。通过以上途径,都可以打破在发酵过程中谷氨酸棒杆菌中ATP对氨基酸生成的限制。
随着生物学的不断发展,越来越多的菌株被构建并运用于工业生产。ATP作为通用能量,可以通过操纵ATP供应和消耗实现工业生物技术的特定目标,以ATP为导向的调控可作为增强各种工业菌株产量的合理和有效的途径。此篇综述了通过调节谷氨酸棒杆菌细胞内ATP的供应来获得更有效的细胞工厂,也可为其他工业菌株通过操作ATP调控产物产量提供有意义的参考。
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