萜类化合物(terpenoids)广泛存在于微生物、真菌、高等植物以及昆虫中，结构多样，总数超过50 000种。橙花叔醇(nerolidol)为一种倍半萜，是香料和精油中的重要成分[1]，常见于紫丁香型、蔷薇香型等各种类型的花香气息，常作为香精香料应用于生活日化品和高档香水中。橙花叔醇在医学方面有一定的功效，有抑制细菌活性和体外的抗真菌作用，还具有良好的抗病毒能力[2-3]，它是维生素K1与维生素E、α-甜橙醇(柑橘清香，如甜橙酱)的重要前体[4]，同时也是治疗消化性溃疡药物替普瑞酮的中间体[5]。
酿酒酵母的甲羟戊酸途径的主要终端产物中，麦角甾醇占比较大，这使得酿酒酵母具备了合成多种萜类化合物的广阔发展空间，因而被广泛地作为合成异源萜类化合物的底盘细胞[6]。研究者通过将猕猴桃的橙花叔醇合酶基因与法尼烯合酶融合表达，转入改造后的酿酒酵母中，橙花叔醇发酵罐产量达到1.71 g/L[7]。PENG等[8]增强酿酒酵母甲羟戊酸途径的代谢流，使得橙花叔醇摇瓶产量达到392 mg/L，并在碳源优化后进行上罐发酵得到5.5 g/L的产量。LI等[9]克隆了来自于苦皮藤的橙花叔醇合成酶，橙花叔醇摇瓶产量740.13 mg/L，发酵罐产量达到7.01 g/L。
工程酵母菌发酵过程中因氧化胁迫、蛋白质错误折叠等压力致使生产能力降低。生物产品的合成过程中，维持细胞的功能稳定性和动态稳态，对提高产物合成效率具有重要意义[10]。萜类化合物破坏酿酒酵母体内的氧化还原平衡，造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)积累，诱发氧胁迫，同时如法尼基焦磷酸等萜类代谢的中间产物对细胞均有毒性，使得细胞的鲁棒性降低[11-12]。本研究在甲羟戊酸途径增强的酵母工程菌中，表达B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)和谷胱甘肽合成酶(glutathione synthase，GSH1)，观察它们对橙花叔醇合成的影响，并进一步在代谢水平探讨BCL-2促进酵母合成橙花叔醇的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
用于进行基因克隆的DH5α大肠杆菌、合成来源于人的BCL-2(Genbank NP_000624.2)并按酿酒酵母密码子优化，杭州擎科生物科技有限公司；酿酒酵母YS036、YS037和pRS316质粒，本实验室保藏；GSH1(Genbank NP_012434.1)扩增于本实验室保藏的酵母CEN.PK2-1D菌株的基因组DNA。
1.2 试剂与培养基
LB培养基(g/L)：蛋白胨10、氯化钠10、酵母抽提物5，调节pH 7.0～7.5。
YPD培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母抽提物10。
YND培养基(g/L)：葡萄糖20、硫酸铵5、YNB 1.7。
YNS培养基(g/L)：蔗糖20、硫酸铵5、YNB 1.7。
配制上述培养基相应的固体培养基时另加20 g/L的琼脂粉。
高纯度质粒小提试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA片段回收纯化试剂盒，擎科生物公司；连接试剂盒无缝克隆试剂盒，全式金公司；高保真酶，宝生物公司产品；其余试剂为国产分析纯。
测定橙花叔醇的气相色谱为GC 7890A、气相柱为HP-5(30 m×0.25 μm,0.25 μm)，美国安捷伦；代谢组测定使用的超高压液相色谱ExionLC和Triple TOF5600 plus质谱仪，英国SCIEX公司；液相色谱柱为ACQUITY UPLC T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),英国Waters。
1.3 实验方法
1.3.1 过表达BCL-2和GSH1基因的菌株的构建
利用附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20210702.1642.007.html)中的pRS316-F引物和pRS316-R引物，以pRS316质粒为模板扩增表达载体的质粒骨架；使用上游引物TDH3-F和连接不同外源基因同源臂的下游引物TDH3-BCL2-R、TDH3-HSP104-R，扩增源于酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上的组成型启动子TDH3；使用下游引物Leu2-R和连接不同外源基因的同源臂的上游引物Leu2-BCL2-F、Leu2-HSP104-F，以实验室保存的YEp181质粒为模板扩增LEU2基因用作筛选标记；利用上游引物BCL2-F和下游引物BCL2-R以公司合成的BCL-2基因为模板扩增BCL-2；利用上游引物GSH1-F和下游引物GSH1-R以酿酒酵母基因组为模板对GSH1进行扩增。菌株YS037为菌株YS036转入橙花叔醇合成酶表达质粒pYES2-A1构建而来[13]。通过overlap-PCR融合构建表达BCL-2和GSH1基因的表达盒[14]。将以pRS316为模板构建的表达载体骨架和外源基因表达盒同时转入菌株YS037中，形成完整质粒，得到菌株YS039和YS045。
1.3.2 酿酒酵母培养条件
将构建的酿酒酵母工程菌接种至YNS液体培养基中，于摇床中30 ℃，200 r/min振荡过夜培养得种子液。接入27 mL的YNS液体培养基中，接种量为2%，于30 ℃，200 r/min摇床中振荡发酵培养96 h。于发酵24 h后加入3 mL十二烷用于萃取产物，发酵96 h后取发酵液离心后的有机相进行测定。
1.3.3 橙花叔醇的测定
将离心发酵液所得十二烷有机相进行气相分析，进样量设定为1 μL，载气为氮气，设置流量为1 mL/min，以1∶10分流比进行分流，60 ℃保持5 min后，以10 ℃/min的升温速率升至280 ℃。
1.3.4 代谢组学分析
取培养96 h的菌体0.1 g，进行离心和使用液氮于坩埚中研磨。在样品中加入50%甲醇120 μL，将其充分混匀并振荡，进行离心20 min，转速为4 000 r/min。上清液为所需的代谢物，将上清液置于-80 ℃的超低温冰箱中备用。
样品的液相测定条件为柱温35 ℃，流速0.4 mL/min，A和B流动相分别为水和乙腈，A和B流动相中均含有1%的甲酸。液相梯度设置为0～0.5 min：5% B；0.5～7 min：5%～100% B；7～8 min：100% B；8～8.1 min：100%～5% B；8.1～10 min：5% B。采取高分辨率的Triple TOF5 600 plus质谱仪进行样品检测，质谱仪参数如表1所示。将一级图谱中信号积累太信号离子进行二级碎裂扫描。
表1 样品检测质谱仪参数设定
Table 1 Sample detection mass spectrometer parameter setting
质谱仪运行条件参数离子源30 PSI气体160 PSI气体260 PSI离子源温度650 ℃正离子模式下电压+5 000 V负离子模式下电压-4 500 V数据依赖型扫描(information dependent analysis,IDA)模式采集循环中一级采集范围60～1 200 DaIDA模式采集循环中一级采集时间150 ms
将得到的气质MS数据用XCMS软件进行选择、分组和校准保留时间。使用KEGG、HMDB这些在线数据库的分子质量数据与上述采集的分子质量数据(m/z)进行匹配分析，对代谢物说明注释。有监督的偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)通过使用metaX来实现，区分组之间的不同变量，计算出每个代谢物的变量重要性投影值(variable important in projection，VIP)，筛选出>2倍差异、P<0.05、VIP>1的代谢物为显著差异代谢物。
1.3.5 表达连接不同细胞器定位信号肽BCL-2的菌株构建
BCL-2蛋白羧基末端氨基酸序列为KTLLSLALVGACITLGAYLGHK，利用引物对mBCL2-F/mBCL2-R以构建好的BCL-2-pRS316质粒为模板，连接定位信号肽将上述羧基末端氨基酸序列替换为ILATVAATGTAI，得到将BCL-2蛋白定位于线粒体膜的表达载体[15]；利用引物对nBCL2-F/nBCL2-R以构建好的BCL-2-pRS316质粒为模板，连接定位信号肽将上述羧基末端氨基酸序列替换为PKKKRKV，得到将BCL-2蛋白定位于核膜的表达载体[16]；利用引物对ER-BCL2-1b/ER-BCL2-2和ER-BCL2-3/ER-BCL2-4b通过over lap-PCR合成内质网定位信号肽[13]，再用引物对ER-BCL2-F/ER-BCL2-R以构建好的BCL-2-pRS316质粒为模板,连接定位信号肽将上述羧基末端氨基酸序列替换为GSGTLVVILAILMLGVAYYLLNE，并用连接试剂盒与载体骨架进行连接，得到将BCL-2蛋白定位于内质网的表达载体[17]；对于截短BCL-2蛋白的表达载体，直接利用引物对tBCL2-F/tBCL2-R以构建好的BCL-2-pRS316质粒为模板扩增，得到BCL-2蛋白羧基末端氨基酸序列缺失后变为SWLSLN的BCL-2蛋白表达载体[16]。将表达载体转入出发菌株YS036中得到对应的表达菌株。所使用引物见附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20210702.1642.007.html)。本研究涉及所有菌株见表2。
表2 本研究涉及到的菌株
Table 2 Saccharomyces cerevisiae strains used in this reserch
菌株表型质粒来源YS036CEN.PK2-1D, gal80Δ∶∶loxP;trp1-289∶∶PGAL1-tHmg1_PGAL10-Erg20-TRP1;rox1Δ∶∶PGAL1- Mvd1_PGAL10-ERG8_PGAL2-Idi1;ypl062wΔ∶∶PGAL1-RP.Hmgr_ PGAL10-ERG13_PGAL2-Erg12;Perg9Δ∶∶PGAL10- Erg13_PGAL1- Erg12_PGAL2- Idi1_PHXT1-Erg9;bts1Δ∶∶PGAL1-RHMGR_ PGAL10- ERG10- PGAL2-tHMG1noneQU[13]YS037YS036pYES2-A1QU[13]YS039YS037pRS316-BCL-2;pYES2-A1本研究YS045YS037pRS316-GSH;pYES2-A1本研究TXC21YS036pRS316-mBCL-2本研究TXC22YS036pRS316-nBCL-2本研究TXC23YS036pRS316-ER-BCL-2本研究TXC24YS036pRS316-tBCL-2本研究TXC25YS036pRS316-BCL-2本研究TXC26YS036pRS316-ER-BCL-2;pYES2-A1本研究
2 结果与分析
2.1 BCL-2和GSH1表达对酵母工程菌合成橙花叔醇的影响
BCL-2是一种来自于哺乳动物细胞内的抗凋亡蛋白，酿酒酵母中并不存在BCL-2的同源序列，但其在酿酒酵母中表达后具有一定生理活性，例如，通过减少ROS的生成抑制细胞凋亡，使得酿酒酵母超氧化物歧化酶缺失菌株的生存效率提高[18]。GSH1是编码最常见的非酶系抗氧化物谷胱甘肽的2种同工酶之一，通过控制自由基的生成，在保护细胞膜和维持氧化还原稳态方面发挥重要作用[19]。在上述研究中，BCL-2和GSH1等基因在酵母体内高表达使得酿酒酵母缓解环境和异源表达产生的氧化压力，因此我们推测这2种蛋白的表达可能促进工程酵母橙花叔醇的合成。
将构建好的工程菌接种于YNS培养基中摇瓶发酵96 h，对发酵液处理后测定橙花叔醇的产量，如图1所示。在发酵96 h后，相对于菌株YS037(336.5 mg/L)而言，菌株YS039和YS045的产量分别提高了77.7%和32.7%，达到594.1、446.9 mg/L。因此，过表达BCL-2和GSH1的菌株橙花叔醇的合成起到了促进作用。在大部分哺乳动物的细胞体内，在连续不断的内质网压力下，未折叠蛋白应激反应(unfolded protein response，UPR)通过促凋亡蛋白的转录和翻译后调控，引发细胞凋亡。来源于人的细胞凋亡调控因子BCL-2与细胞凋亡、UPR、细胞自噬和Ca2+平衡的信号途径均有联系，是压力信号网络的关键调节剂，其与癌症的发生也有密切关系[20-21]。BCL-2蛋白家族可以细分为2大类，一类为促凋亡亚家族，另一类为抗凋亡亚家族。其中，促凋亡蛋白Bax通过直接激活UPR，使得HAC1的mRNA被剪切；同时GCN4、DER1和KAR2等UPR的靶基因也可以被Bax蛋白诱导表达[22]。而第二类抗凋亡蛋白BCL-2与BCL-XL能够与第一类促凋亡蛋白Bax进行结合，来减弱Bax在促凋亡中的活性，同时改变内质网的压力，但其调节机理仍未明确[22-23]。在酿酒酵母中，有2种平衡胞内氧化还原的系统，分别为含抗氧化酶的系统和非酶的保护系统。增强编码谷胱甘肽的同工酶GSH1的表达强度，使得还原型谷胱甘肽通过氧化作用生成氧化型谷胱甘肽并控制自由基的生成，保护细胞膜和维持氧化还原稳态，从而在一定程度上减弱ROS的积累，提高菌株活力。因为BCL-2对酵母合成橙花叔醇的促进作用比GSH1更强，因此后面的研究以表达BCL-2的工程酵母菌株作为研究对象。
图1 BCL-2和GSH1表达对酵母工程菌合成 橙花叔醇的影响
Fig.1 Effects of BCL-2 and GSH1 expression on nerolidol production in engineered yeast 注：以YS037菌株产量为对照进行分析，误差线表示3次平行 测定的标准差，*表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)
2.2 表达BCL-2蛋白和不表达BCL-2蛋白工程菌的代谢组学研究
YS037和YS039发酵96 h的细胞进行代谢物提取和液相色谱质谱联用仪测定后，进行主成分分析(principal components analysis，PCA)，各个样品依据重新组合后的变量都可以进行正确的分组，2种工程菌株导致的63.5%的样品数据差异见图2-a。为了对差异代谢物进行确定，使用PLS-DA模型对样品进一步进行分类(图2-b)，建立其PLS-DA模型。对于表达BCL-2蛋白(YS039)和不表达BCL-2蛋白(YS037)的样品组的PLS-DA模型，R2=0.999，Q2= 0.991，说明PLS-DA模型构建成功。满足VIP>1且P<0.05的代谢物定义为差异代谢物。基于PLS-DA的结果，工程菌株YS037和YS039的差异代谢物一共有182种。
差异代谢物途径富集分析如图3所示，表明BCL-2蛋白的表达主要影响了半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、色氨酸等氨基酸的代谢途径、α-亚麻酸和亚油酸等脂肪酸代谢途径以及泛酸和辅酶A的生物合成途径等。与未表达BCL-2蛋白的菌株相比，富集于氨基酸代谢途径的差异代谢物主要为下调的代谢物。下调氨基酸的代谢是否可以促进酵母工程菌中萜类化合物的合成仍未被完全证实。我们推测，胞内氨基酸含量的下调可能是由于前体羧酸的转化受到抑制，而调节羧酸转化也许是提高萜烯生物合成的一个策略。富集于谷胱甘肽、α-亚麻酸和亚油酸的代谢途径以及泛酸和辅酶A的生物合成途径的差异代谢物多为上调的代谢物。谷胱甘肽作为一种非酶系抗氧化物，其代谢的上调可以起到抗氧化的作用对细胞进行保护。而不饱和长链脂肪酸中的亚麻酸和亚油酸则对酿酒酵母的生长繁殖和抗逆性的提高有显著促进作用。泛酸和辅酶A的合成的上调则可以提高甲羟戊酸途径前体乙酰辅酶A的合成，并进一步增加酿酒酵母合成萜烯的能力。对于差异代谢物途径富集的分析在代谢水平基本解释了BCL-2蛋白对酿酒酵母产萜类能力的促进作用的机制，为进一步提高萜类在工程酵母菌中的产量提供了理论依据。
a-所有样品的PCA;b-所有样品的PLS-DA
图2 菌株YS037和YS039的代谢物组成差异分析
Fig.2 Differential analysis of metabolite composition of strains YS037 and YS039
2.3 连接不同定位信号肽的BCL-2蛋白对内源性橙花叔醇合成的影响
哺乳动物BCL-2一般分布于细胞的线粒体、内质网和核膜中，在细胞质中含量较低[16]。酿酒酵母自身可以合成少量的法尼醇和橙花叔醇[24]。为进一步探究BCL-2蛋白定位于不同细胞器表达时，对橙花叔醇产量的影响，将线粒体内膜、内质网和核膜的定位信号肽连接BCL-2蛋白，观察其对内源性萜类化合物产量的影响。我们发现当摇瓶培养不控制pH时，酵母可以合成的内源性萜类以橙花叔醇为主。以未连接定位信号肽的BCL-2蛋白的菌株(TXC25)相比，BCL-2连接内质网定位信号肽(TXC21)、线粒体内膜定位信号肽(TXC22)、核定位信号肽(TXC23)和羧基端截短的BCL-2蛋白(TXC24)，内源性的橙花叔醇产量分别提高了30%、2.8%、2%和5.2%(图4)。
图3 YS039与YS037差异代谢物代谢途径富集
Fig.3 Pathway enrichment of differential metabolites by YS037 versus YS039
图4 BCL-2蛋白连接不同细胞器定位信号肽对 酵母内源性橙花叔醇合成的影响
Fig.4 Effects of different organelle localization signal peptides linked to Bcl-2 protein on endogenous nerolidol synthesis in yeast 注：以TXC25菌株产量为对照进行分析
之后在菌株TXC21中转入带有橙花叔醇合成酶基因的质粒pYES2-A1，对比菌株YS039橙花叔醇产量提高了29.2%，达到767.6 mg/L。这可能与BCL-2 蛋白抑制细胞自噬的作用机制有关，目前已经发现BCL-2蛋白降低内质网的Ca2+稳态水平，进而诱导一系列调控机制来抑制细胞自噬，提高细胞活力[25]。然而本研究中定位信号肽是否将BCL-2蛋白定位至目标细胞器，还有待进一步确认。本研究为提高酿酒酵母工程菌产萜类化合物提供了新的策略。
3 结论
本研究观察到BCL-2和GSH1基因的表达对工程酿酒酵母产橙花叔醇有促进效果，并进一步通过代谢组分析对BCL-2蛋白的作用机制进行了探究，发现BCL-2蛋白的表达影响菌株氨基酸和脂肪酸的代谢，并与泛酸和辅酶A的生物合成途径有关。另外，对连接不同定位信号肽的BCL-2蛋白对工程菌橙花叔醇合成的影响进行了探究，发现当BCL-2蛋白与内质网膜定位肽连接时对橙花叔醇产量的促进作用最大，为解释其作用机制提供了有力支持。本研究对提高酿酒酵母工程菌异源生产萜类化合物提供了一个新的策略。
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