鱼糜制品作为现今深受人群青睐的食品，营养丰富，味美价廉，种类繁多，还可长期保存，适合全年龄段消费者食用。当下常见的鱼糜类产品是先通过将生鱼采肉、斩拌、盐擂后形成初始鱼糜凝胶，再经过各自加工方式形成不同种类的鱼糜制品。在传统鱼糜生产工艺中，漂洗是不可缺少的工序之一。但漂洗同时也会使蛋白、脂肪等营养物质流失，造成产品得率的下降，漂洗废水排放也会造成环境的污染。因此，制作未漂洗鱼糜不仅可省略漂洗工序，还能减少废水对环境的污染，同时减少鱼糜营养成分损失，提髙鱼糜得率。
大黄鱼(Pseudosciaena crocea)作为常见鱼类，因其鲜美的味道与细致的口感而广受消费者的喜爱，其肉营养价值高，可为消费者提供充足的蛋白质与不饱和脂肪酸[1]。为了有效贮存鱼糜及其制品，通常以冷冻保藏作为其贮存方式，延长货架期。但是，内源性蛋白酶的作用导致蛋白质结构展开，键位暴露，使得鱼糜内部肌原纤维蛋白易发生冷冻变性，加上未漂洗鱼糜内部含有更多的脂肪、水溶性蛋白等，使得脂肪氧化加速，其产生的醛、酮类物质则会与蛋白交联进而加重蛋白质的变性。并且间接的影响鱼糜的保水性、凝胶特性[2]。
为解决蛋白质冷冻变性，国内鱼糜在冷冻保藏上常采用复合磷酸盐以及4%(质量分数，下同)蔗糖+4%(质量分数，下同)山梨醇混合而成的商业抗冻剂来延缓蛋白变性，但诸多国家对于复合磷酸盐的使用较为严格，并且过度的添加亦会影响人体对钙离子的吸收；另一方面，商业抗冻剂的高热量与高甜度也破坏了食材的口感、降低消费者的购买欲望[3]。因此，国内外探究以动植物的天然提取物作为抗冻剂，延缓鱼糜冷冻过程中品质的下降，高文宏等[4]研究了水溶性大豆多糖对冷冻鱼糜蛋白变性起抑制作用；HUANG等[5]研究发现菊粉可以增强MTGase对肌球蛋白重链的交联作用，从而抑制冷冻过程中蛋白质氧化降解。
常用的天然抗冻剂有海藻糖、海藻胶、茶多酚、酵母提取物等[6]，而海藻糖类可以有效地促进细胞内氧化自由基的清除，延缓蛋白质、脂肪等氧化变性，并且可以提升肌原纤维蛋白溶解度[7]，其也常因低热量、低甜度等优点作为代糖用于食品生产中。未漂洗鱼糜在冷冻过程中更易发生蛋白质变性，本研究将海藻糖、蔗糖、山梨醇以不同比例复配加入并与常规商业抗冻剂(4%蔗糖+4%山梨醇)对比，以期探究复配多糖对于大黄鱼未漂洗鱼糜Ca2+-ATPase活性、总巯基含量、pH、凝胶强度、持水性、二级结构含量以及凝胶微观结构的变化，以期探究一种新型复配抗冻剂最佳比例，旨在将天然抗冻剂与商业抗冻剂相结合，降低其热量与甜度，并在此基础上提高其抗冻性能，延缓未漂洗鱼糜品质的降低。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
冰鲜大黄鱼：通框养殖，规格1 kg/尾，宁德蔡氏水产有限公司，连夜捕捞，次日冰台送达使用。
氯化钠、氯化钾、马来酸、Tris固体、酒石酸钾钠、浓硫酸、ATP、5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、硼酸、曲拉通(Tritonx-100)、钼酸铵、牛血清白蛋白、硫酸亚铁、95%(体积分数)乙醇溶液、溴化钾、无水硫酸铜等(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；PBS磷酸缓冲液、2.5%戊二醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
D-130电动匀浆机，德国Wiggens有限公司；GL-20B 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；TA.XT Plus质构仪，英国SMS公司；切碎机QSJ-B02R1，九阳电器有限公司；UV1100型紫外分光光度计，广州罡然机电设备有限公司；FI-TR傅里叶红外分光光度计，赛默飞世尔；日立SU5000热场发射扫描电镜，日立(中国)有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鱼糜样品的制备
未漂洗鱼糜制备：将大黄鱼随机分成5组，分别去头、去尾、去皮、去鳞、去内脏；清洗,取肉于吸水纸上沥干表面水分；取300 g碎鱼肉于绞肉机中搅碎,以不添加抗冻剂作为空白对照组(CK)，保持总糖量8%(质量分数，下同)不变。考虑到海藻糖(trehalose, TR)的经济效益，以及预实验中得出单独加入4%、6%、8%的TR并无太大差异，因此分别加入商业抗冻剂4%山梨醇(sorbitol，SUC)+4%蔗糖(sucrose，SBT)、2%TR+3%SUC+3%SBT、3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT、4%TR+2%SUC+2%SBT、斩拌3 min制成鱼糜。-60 ℃冰箱内快速冷冻2.5 h，转入-18 ℃冰箱冷冻保藏0、15、30、45、60、75、90 d，随机抽样进行相关指标测定。
1.2.2 肌原纤维蛋白的制备
参照KATOH等[8]的方法提取肌原纤维蛋白，整个过程利用冰浴将温度维持在5 ℃以下。鱼糜解冻后称取样品5 g，先加入提取缓冲液A、B各20 mL(其中，缓冲液A：40 mmol/L Tris-马来酸，0.16 mol/L KCl，1%Triton，马来酸调pH 至7.5；缓冲液B：40 mmol/L Tris-马来酸，0.16 mol/L KCl，马来酸调pH至 7.5)，10 000 r/min均质2 min，5 000 r/min，4 ℃离心10 min，取沉淀加入40 mL 缓冲液B，重复上述步骤2次得粗蛋白；接着将粗蛋白充分溶于20 mL 0.1 mol/L KCl，同之前步骤均质，离心。最后沉淀溶于40 mL 0.1 mol/L KCl重复上述操作，将蛋白溶液用双层纱布过滤杂质后离心，沉淀即为肌原纤维蛋白。蛋白浓度以双缩脲法处理并用紫外分光光度计测定吸光度，最后以0.6 mol/L KCl配制成所需浓度，置于4 ℃冰箱贮存待用。
1.2.3 Ca2+-ATPase活性测定
参考BENJAKUL等[9]的方法，量取3.5 mL 2 mg/mL蛋白质溶液加入0.3 mL 0.5 mol/L Tris-Maleat(pH 7.0)和0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液，再加入0.25 mL 20 mmol/L ATP，25 ℃水浴10 min后加入2.5 mL (体积分数) TCA，5 000 r/min，4 ℃，离心5 min。取上清液0.5 mL加入蒸馏水2.5 mL，振荡摇匀后加入2 mL硫酸亚铁-钼酸铵溶液(取10 mL 10%钼酸铵硫酸溶液加5 g硫酸亚铁定容到100 mL)，25 ℃静置1 min，在660 nm处测定吸光度，结果以1 mg肌原纤维蛋白1 min生成无机磷量(μmol)来表示。其中空白组中ATP和TCA调换添加顺序。
1.2.4 鱼糜总巯基含量测定
依据文献[10]的方法，取1 mL 2 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液加入 50 mmol/L的磷酸缓冲液9 mL，混匀后取4 mL混合液加入0.4 mL的Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)，40 ℃水浴25 min，然后412 nm处测定吸光度。
1.2.5 鱼糜pH的测定
测定方法依照 GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[11]稍作修改(将10 g样品降至5 g，100 mL蒸馏水减少至50 mL)，将5 g鱼糜样品充分溶于50 mL蒸馏水中，12 000 r/min均质60 s后与4 ℃恒温箱中静置30 min，离心。上清液于滤纸上再次过滤，用pH计测定pH值，每组3个平行。
1.2.6 鱼糜凝胶的制备
将-18 ℃冷冻鱼糜取出放入3 ℃低温培养箱中放置到中心温度为-5 ℃左右的半解冻状态，切成小块，放入搅碎机中空搅2 min，后加入25 g/L食盐混匀搅拌3 min，最后加冰水调节水分含量至80%后，将肉浆注入小型灌肠模具中，灌入直径3.5 cm的塑料肠衣中封口，采用二段式加热(40 ℃加热60 min，90 ℃加热30 min)，后将鱼肠放入碎冰中冷却30 min，放入4 ℃冰箱中保藏，统一在4 d内陆续完成凝胶指标测定。过程中，搅拌机放入碎冰中，全程保持搅拌温度低于6 ℃。
1.2.7 鱼糜凝胶强度的测定
参考文献[12]的方法稍作修改。冰箱中取出鱼肠室温放置0.5 h，将鱼肠切成直径3 cm，高3 cm的圆柱体，每组5个平行。测试条件：选用P/5S探头。测试参数：测前、测中、测后速度均为1 mm/s，形变压缩比50%，触发力5.0 g。记录破断强度(g)和破断距离(cm)，凝胶强度计算如公式(1)所示：
凝胶强度/(g·mm)=破断强度×破断距离
(1)
1.2.8 鱼糜凝胶持水性测定
持水性(water holding capactity,WHC)测定：参考文献[13]方法，将制备好的鱼糜凝胶切成0.5 cm左右的薄片，称重(m1)后用双层滤纸包裹，离心机离心(4 ℃，3 000×g，10 min)，随后滤纸中取出样品称重(m2)，持水性计算如公式(2)所示：
(2)
1.2.9 鱼糜肌原纤维蛋白二级结构测定
参考文献[14]的方法，使用傅里叶变换红外光谱测定未漂洗鱼糜肌原纤维蛋白的二级结构产生的变化，先将肌原纤维蛋白冷冻干燥去除水分。取5 mg 冻干样品和100 mg 溴化钾粉末充分混合后充分研磨，使用压片机将粉末压缩成薄片。保持全程干燥条件下，室温环境中以光谱分辨率为4 cm-1进行测试，扫描32次，波数范围为 4 000～400 cm-1。使用 PeakFit 4.12对获得的图上的曲线进行多次曲线拟合，然后以二阶导数求出峰面积所占比。
1.2.10 鱼糜凝胶微观结构
参考PETCHARAT等[15]的方法略作修改。将鱼糜凝胶切为厚度不超过3 mm的片状，并用体积分数2.5%的戊二醛溶液于4 ℃培养箱中固定24 h，去除固定液，使用磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.2)漂洗3次，15 min/次，后用蒸馏水反复冲洗，而后依次用体积分数30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液梯度脱水，每次15 min，最后以100%乙醇溶液脱水2次，每次30 min，进行冷冻干燥，而后喷金，扫描电镜观察。
1.3 数据处理
以Microsoft Excel软件作图，并用IBM SPSS Statistics 25.0进行显著性分析，差异显著水平为P<0.05，不显著水平为P>0.05。
2 结果与分析
2.1 Ca2+-ATPase活性测定
Ca2+-ATPase活性常用来评判蛋白质的冷冻变性程度。研究发现，Ca2+-ATPase活性下降可能是肌球蛋白中的活性巯基氧化成二硫键，蛋白分子发生交联，使得肌球蛋白头部与ATP的接触减少导致[16]。由图1可知，冻藏时间为90 d时，各实验组Ca2+-ATPase活性显著下降(P<0.05)，下降率分别为67.36%、53.13%、57.17%、54.43%、47.58%，与不添加组(CK)相对比，添加组均可一定程度上抑制Ca2+-ATPase活性下降。随着TR含量的增加，对Ca2+-ATPase活性下降的抑制明显，当TR含量达到4%时，Ca2+-ATPase活性最高(P<0.05)，这可能是因为，相比于商业抗冻剂，TR内部有更多的羟基可以与水分子相互作用，从而减少冷冻期间冰晶的生长，避免其破坏细胞结构，防止蛋白变性。
图1 复配抗冻剂对冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜Ca2+-ATPase 活性的影响
Fig.1 Effect of compound antifreeze on Ca2+-ATPase activity of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi 注：不同小写字母表示差异性显著(P<0.05)(下同)
2.2 巯基含量的测定
总巯基作为反应蛋白质氧化程度的一大指标，是活性巯基与非活性巯基含量的总和[17]。巯基在肌原纤维蛋白中是活性极强的基团，蛋白质冷冻变性时，其被氧化形成二硫键，而随着外层蛋白质的变性引起的结构改变，内部蛋白质的非活性巯基暴露出来，继续被氧化，进一步导致巯基含量下降[18]。二硫键含量的增加又会进一步影响蛋白质其他特性的变化。如图2所示，0～30 d蛋白质巯基含量下降剧烈，而后巯基含量下降趋于平缓，这可能是因为随着蛋白质冷冻变性，导致巯基含量下降，而随着外部蛋白不断变性，肽链打开，导致内部蛋白质巯基暴露出来，而使总巯基含量的增加，造成后期总巯基含量的下降越发平缓。冻藏90 d后，各实验组巯基含量显著下降(P<0.05)；与0 d相比分别下降了37.89%、27.30%、30.47%、27.11%、24.03%，并且4%TR+2%SUC+2%SBT的巯基含量显著高于其他4组(P<0.05)，这与Ca2+-ATPase 活性相对应，说明总巯基含量的下降可以影响Ca2+-ATPase 活性的变化[19]。可见，添加复配多糖可以在不同程度上延缓巯基含量的下降，而随着海藻糖占总百分比的升高，这种延缓效果越发显著。
图2 复配抗冻剂对冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜巯基含量的影响
Fig.2 The effect of compound antifreeze on the sulfhydryl content of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi
2.3 pH值的测定
pH是评价水产品变质与否的重要指标，而鱼糜冻藏期间pH值变化与冻藏前添加抗冻剂与否有着密切联系。由图3可知，整个冻藏期间，各组pH下降幅度并不大，均呈现出前30 d先下降，而后缓慢回升或趋于平衡的趋势；这是因为冻藏前期鱼糜内部乳糖等降解产生乳酸，并且ATP分解产生磷酸使得pH先出现下降趋势[20]。而到了冻藏后期，随着蛋白质冷冻变性而生成小分子氨基酸进一步分解产生胺类等挥发性物质，造成pH转而上升或趋于平缓，这与谢青青等[21]研究的鱼糜制品冻融循环期间pH的变化趋势相似。
其中空白组与2%TR+3%SUC+3%SBT在0～90 d时pH下降相对较大，从0 d的6.92下降到 6.77 与6.79而其他各处理组则分别为6.81、6.83、6.85，较小程度上延缓了pH值下降(P<0.05)，这是由于小分子糖的加入产生的抗冻效果，避免了大量的冰晶在胞内生成而产生的细胞液浓缩、胞内浓度升高，进而导致pH的下降。特别是复配抗冻剂比例为4%TR+2%SUC+2%SBT时，pH下降的趋势更为缓慢，90 d时下降程度最小，为7.24%，说明其对于冰晶生成的抑制效果最好。
2.4 鱼糜凝胶强度的测定
凝胶强度表示凝胶破断力和凹陷距离的乘积，可以反映凝胶内部结构是否牢固；而凝胶强度的变化则可以反过来说明鱼糜凝胶内部的肌原纤维蛋白品质变化[22]。如图4所示，随着冻藏时间的增加，鱼糜凝胶强度总体呈不断下降趋势，空白组凝胶强度从开始的652.60 g·mm下降到90 d的157.35 g·mm，下降幅度最大，达到75.92%；而4%TR+2%SUC+2%SBT组从开始的627.72 g·mm下降到90 d的 426.38 g·mm，下降程度最小，为30.07%，明显优于其他各组(P<0.05)，研究表示小分子多糖对冷冻过程中的冰晶产生、聚集起抑制作用，因此可以减少冰晶对细胞内结构的损坏，从而延缓鱼糜凝胶强度的下降，而4%TR+2%SUC+2%SBT、蔗糖组合对蛋白质冷冻保护作用最好，这与苏赵等[23]研究的海藻糖对草鱼鱼糜冷冻期间延缓凝胶强度下降的结果相类似。
图3 复配抗冻剂对冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜pH值的影响
Fig.3 Effect of compound antifreeze on the pH value of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi
图4 复配抗冻剂对冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜凝胶强度的影响
Fig.4 The effect of compound antifreeze on the gel strength of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi
2.5 鱼糜凝胶持水性的测定
持水性是评价鱼糜品质好坏的重要指标，表示凝胶遭受外力时维持水分的能力。其直接反映了凝胶内部蛋白质结合水能力的强弱，凝胶内部结构复杂、紧致，说明蛋白质与水分子结合能力强，表现出来的持水性也较好；反之则说明凝胶内部结构松散，持水性较差[24]。如图5所示，冻藏期间，空白组持水力急剧下降(P<0.05)；与空白组相比，添加组持水力则下降的较为缓慢。在90 d时空白组持水性以及显著低于其他4组(P<0.05)，较新鲜鱼糜下降了2.64%，添加物4组持水力相比于新鲜鱼糜分别下降了1.40%、1.61%、1.43%、1.39%，差异较小(P>0.05)；说明加入不同比例的复配抗冻剂均能作用于蛋白质，通过多糖与水分的结合从而减少因细胞在冷冻过程中而导致水分的流失。
图5 复配抗冻剂对冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜持水性的影响
Fig.5 Effect of compound antifreeze on water holding capacity of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi
2.6 蛋白二级结构的测定
蛋白质是通过小分子氨基酸形成的多条肽链再经过不同方式的组合所构成，而二级结构作为蛋白质最基本的空间构象，是判断蛋白质结构稳定与否的重要指标[25]。氢键是蛋白质二级结构构成的主要作用力，大部分蛋白质二级结构通过氢键使氨基酸肽链上的羰基与酰胺基团链接而成，分别形成4种不同构象：α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲。其代表的波长区域分别为：β-折叠1 600～1 640 cm-1、无规则卷曲1 640～1 650 cm-1、α-螺旋1 650～1 660 cm-1、β-转角1 660～1 700 cm-1。而傅里叶-红外变换光谱可以测定蛋白质不同波长下的基团、构象的来观察冻藏过程中蛋白质内部结构的变化，其中酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)是研究蛋白质结构变化的主要范围[26]。图6为新鲜鱼糜与90 d冻藏后各组二级结构百分比含量的变化。由图6可知，新鲜未漂洗鱼糜的α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲含量分别是25.12%、34.61%、26.08%、14.19%，经过冷冻保藏后，各组α-螺旋含量均有所降低，分别下降了39.41%、11.50%、10.35%、8.76%、4.66%，说明了肌球蛋白展开，疏水基团暴露。而无规则卷曲含量则显著上升，进一步说明了蛋白质有序结构的不断展开、无序结构进而增加；从而导致鱼糜形成的凝胶网络变得不规则，这也符合凝胶强度随冻藏时间延长而降低的趋势。5组实验组中，添加4%TR+2%SUC+2%SBT的抗冻剂时与新鲜鱼糜的二级结构含量最为相近，且效果好于商业抗冻剂，说明次比例可以更好稳定二级结构的完整。
图6 冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜二级结构的变化
Fig.6 Changes in the secondary structure of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi
2.7 鱼糜凝胶微观结构分析
使用扫描电子显微镜观察凝胶微观结构，是判断蛋白质变性程度的常用方法。如图7所示，新鲜鱼糜凝胶结构饱满，凝胶网络致密有序，形成了层次鲜明的凝胶网状结构。
A-空白对照组(新鲜)；B-空白对照组(90 d)；C-商业抗冻剂； D-2%TR+3%SUC+3%SBT；E-3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT； F-4%TR+2%SUC+2%SBT
图7 冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜凝胶结构的变化
Fig.7 Changes in gel structure of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi
经过90 d的冻藏，各组蛋白凝胶均出现不同程度的变化，空白对照组在90 d时凝胶结构变化较为明显，凝胶孔洞增多、变大，表面粗糙并且突起显著减少，说明凝胶网络三维结构受到较大破坏(图7-B)。而添加抗冻剂的4组凝胶也都有不同程度的破损，但相比于空白对照组明显变化较小。商业抗冻剂组相较于空白组表面突起较多，蛋白纤维平滑，孔洞较大(图7-C)；而 2%TR+3%SUC+3%SBT组相对于新鲜鱼糜突起减少，凝胶结构较为干瘪组，出现较多的孔洞(图7-D)。而3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT与4%TR+2%SUC+2%SBT组的凝胶网络相比于2%TR+3%SUC+3%SBT组结构更加复杂、紧致，结构也更具有空间立体感，产生的孔洞也明显减少，与商业抗冻剂组较为相近(图7-E、图7-F)。由此说明海藻糖含量的增加可以减小凝胶网络在冻藏过程中的变化，并且对蛋白质的保护作用较好。
3 结论
鱼糜在冷冻保藏过程中，蛋白质的冷冻变性会对鱼糜品质、口感等特性产生较大损害；其直接造成肌原纤维蛋白含量的下降，这主要是由于肌球蛋白的结构被破坏，从而对鱼糜表观上的特性，如凝胶强度、持水性等产生影响。此外，鱼糜冻藏过程中产生的冰晶也会破坏细胞结构，对鱼糜凝胶产生机械性的损害。
由此本试验研究了加入不同比例的海藻糖、山梨醇、蔗糖(保持总添加量与商业抗冻剂一致)对冷冻未漂洗大黄鱼鱼糜Ca2+-ATPase活性，总巯基含量、pH值、凝胶强度、凝胶持水性、蛋白质二级结构以及凝胶微观结构的影响。结果表明，3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT、4%TR+2%SUC+2%SBT作为抗冻剂加入均可以在一定程度上抑制蛋白质的冷冻变性，并间接延缓鱼糜凝胶的劣化，而当添加量为4%海藻糖+2%山梨醇+2%蔗糖时，对于蛋白质各指标的改善最为显著。与商业抗冻剂相比具有更小的热量与甜度，也能满足广大消费者的要求，是商业抗冻剂的良好替代品，也为今后未漂洗鱼糜冷冻保藏研究提供数据支持。
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