多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌疾病，发病率高达5%～10%[1]。PCOS患者的主要临床表现为不孕、月经不调、高雄激素血症、卵巢多囊样改变等[2-3]。此外，PCOS患者的代谢功能异常，包括胰岛素抵抗和脂质代谢异常等[4]。研究表明，PCOS患者患二型糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌等疾病的风险也会显著增加[5]。目前，药物治疗依然是缓解PCOS症状的首选方案，常用的药物包括口服避孕药、促排卵药物、胰岛素增敏剂等。这些药物主要是通过调节月经周期、降低胰岛素抵抗来调节激素水平，促发排卵。但是使用以上药物也存在着明显的副作用，如口服避孕药可能增加胰岛素抵抗的风险，胰岛素增敏剂可能增加患膀胱癌的风险等[6-7]。因此，寻找一种更加安全且有效的PCOS缓解手段很有必要。
相关研究表明，PCOS患者往往伴随着肠道菌群的失调，其特征表现为菌群α多样性降低以及特定种属丰度的显著变化[8-10]。此外，研究表明，将正常大鼠的肠道菌群移植到PCOS大鼠中，PCOS大鼠的症状得到了缓解，而将PCOS小鼠的肠道菌群移植到正常小鼠体内，正常小鼠也会表现出一定的PCOS症状[1, 11]。因此，肠道菌群与PCOS二者之间存在十分密切的联系，以肠道菌群为靶点的膳食干预方法具有缓解PCOS症状的潜在价值。益生菌是一类能够对宿主健康发挥有益作用的活性微生物，可以调节宿主的肠道菌群。研究表明，长期服用益生菌可以调节PCOS患者血清中异常的睾酮水平[12]。此外，SHAMASBI等[13]发现长期摄入益生菌可以显著降低PCOS 患者体内激素和炎症指标的水平。而本研究团队也已证明特定植物乳杆菌可以缓解PCOS大鼠的相关病症[14]。
为了进一步探究具有缓解PCOS潜力的菌株在食品中的应用价值，本研究将3株植物乳杆菌(CCFM1019、LP4、LP5)进行豆乳发酵，进一步评价了不同植物乳杆菌发酵豆乳摄入对PCOS大鼠的影响。
1 材料与方法
1.1 实验菌株与动物
植物乳杆菌CCFM1019、LP4、LP5均来源于江南大学生物技术中心菌种保藏库，具体信息如表1所示。
表1 实验菌株的具体信息
Table 1 The information of strains used in study
编号来源地区CCFM1019泡菜 四川成都LP4健康人体粪便新疆喀什LP5健康人体粪便重庆
实验选用购自浙江维通利华实验动物技术有限公司的36只SPF级7周龄的雌性SD大鼠，饲养于江南大学动物实验中心。动物实验方案经江南大学实验伦理委员会批准，审批号：JN.No20201030S0421230[283]，所有动物实验操作符合江南大学动物管理与使用委员会的规定(SYXK 2012—0002)和欧盟指导手册(编号:2010 /63 /EU)。
1.2 药品与试剂
大豆、蔗糖购于当地超市；来曲唑片(批号：200903KB，来曲唑单片的有效药物含量为2.5 mg)，江苏恒瑞医药股份有限公司；羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)，上海麦克林生化科技有限公司；达英-35(批号：KT04L5J2，达英-35单片的有效药物含量为醋酸环丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg)，拜尔医药保健有限公司；大鼠性激素睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、孕酮(progesterone，P)、促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。
1.3 仪器与设备
PB300-N电子天平，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；BS-480全自动生化分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；GRP-9160型隔水式恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；Eppendorf 高速冷冻离心机5804R，德国艾本德股份公司；994型Thermo超低温冰箱、酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；血糖仪，Roche Diabetes Care GmbH罗氏血糖健康医护公司。
1.4 发酵豆乳的制备
挑选表面光泽无霉烂变质的大豆，按大豆∶纯净水=1∶10(g∶mL)加水过夜浸泡。将浸泡过的大豆用破壁机磨浆，磨浆过滤之后沸水煮浆，添加7%蔗糖调浆，在115 ℃下灭菌20 min，冷却至室温。按照4%的接种量将3株植物乳杆菌分别接种至已经冷却好的豆乳中，发酵温度为37 ℃，发酵时间为8 h，最终发酵终点发酵豆乳活菌数均在1×108 CFU/mL，-80 ℃贮存，待用。
1.5 动物实验方案
大鼠适应喂养1周后，将36只SD雌性大鼠按体重随机分为空白组、模型组、达英-35组、CCFM1019组、LP4组、LP5组，每组6只。造模期间，模型组、达英-35组和发酵豆乳干预组大鼠分别每天灌胃来曲唑悬浊液(20片来曲唑悬浮于250 mL 1% CMC溶液)，最终灌胃体积达到0.5 mL/100g BW，连续灌胃21 d诱导建立PCOS模型[15]，同时空白组大鼠每天灌胃1%CMC溶液，最终灌胃体积达到0.5 mL/100g BW。干预期、空白组、模型组分别灌胃2 mL未发酵豆乳，达英-35组每天灌胃达英-35悬浊液(1片达英-35悬浮于50 mL 1% CMC溶液)，最终灌胃体积达到0.45 mL/100g BW，乳酸菌发酵豆乳组分别灌胃2 mL发酵豆乳，具体实验流程如图1所示。实验期间，观察各组大鼠一般情况，记录体重变化。
图1 动物实验流程图
Fig.1 The process of animal experiment
1.6 口服葡萄糖耐量实验
灌胃3周后，各组大鼠禁食不禁水12 h，利用血糖仪测空腹血糖值，按0.5 mL/100g体重灌胃50%葡萄糖注射液，鼠尾采血测量灌胃后30、60、90、120 min血糖值。
1.7 血清及组织收集
实验第29天采用异氟烷麻醉法，使大鼠麻醉，心脏采血，室温静置2 h后以3 000 r/min离心15 min收集血清并保存于-80 ℃冰箱。摘取双侧卵巢，用镊子仔细分离并去除其表面脂肪组织，用天平称重。一部分卵巢于4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分于液氮中迅速冷冻后转移至-80 ℃冰箱保存备用。
1.8 大鼠卵巢病理学检测
将固定在4%多聚甲醛中的卵巢，各级酒精依次脱水后，二甲苯透明，石蜡包埋，卵巢切片(每张切片厚5 μmol/L)，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色后镜检，盲法统计每张样本切片的囊性卵泡数、黄体数。
1.9 大鼠血清性激素水平测定
采用ELISA试剂盒检测血清中的FSH、LH、E2、T水平、P、GnRH，具体操作严格按照相应试剂盒说明书进行。
1.10 大鼠生化分析指标测定
生化分析指标包括谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，总胆固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein，LDL-C)，均采用全自动生化分析仪测定。
1.11 数据分析
数据以“均数±标准差”表示，用 GraphPad Prism 5(GraphPad software，California，USA，5.0 版)将实验数据进行正态分布检验，对符合正态分布的数据进行单因素方差分析(Fisher’s LSD检验)，对不符合正态分布的数据进行非参数检验(Kruskal-Wallis检验)，P<0.05为差异有统计学意义。*为与模型组比较，P<0.05；#为与空白组相比，P<0.05。
2 结果与分析
2.1 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠体重以及卵巢重量的影响
由表2和图2可知，与空白组相比，模型组、达英-35组及发酵豆乳组的大鼠最终体重增加并且体重增量也显著增加(P<0.05)。与模型组相比，达英-35组和LP5组大鼠体重增量显著下降(P<0.05)。以上数据表明植物乳杆菌LP5发酵豆乳具有降低PCOS大鼠体重增加的潜在作用。
如表2所示，与空白组相比，模型组、达英-35组以及发酵豆乳组大鼠卵巢质量均有所增加。这些结果表明植物乳杆菌发酵豆乳在减轻PCOS大鼠卵巢质量上几乎没有效果。
表2 各组大鼠体重以及卵巢质量变化
Table 2 Changes of body weight and ovarian weight of rats in each group
组别初始体重/g最终体重/g体重增加量/g卵巢质量/mg空白组218.85±5.59264.08±11.33∗45.23±8.10∗119.17±20.72模型组228.94±8.02366.73±15.07#137.79±8.59#169.22±19.19达英-35组226.22±12.47331.99±14.83∗#105.77±13.37∗#203.68±40.30#CCFM1019组226.93±10.03356.83±27.14#129.90±25.15#184.30±36.80#LP4组214.31±5.02353.39±11.85#139.08±7.69#152.43±71.34LP5组228.90±11.87347.18±14.86#118.28±16.96∗#178.85±16.22#P值0.129 4< 0.000 1< 0.000 10.033 5
注：*与模型组比较，P<0.05；#与空白组比较，P<0.05(下同)
2.2 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠糖耐量的影响
由图3-a可知，在给大鼠灌胃60 min后，空白组、模型组、达英-35组及发酵豆乳组血糖均迅速升高。图3-b中，与空白组相比，模型组糖耐量曲线下面积有增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。植物乳杆菌发酵豆乳干预后，LP4组大鼠的糖耐量曲线下面积有减小趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。因此，植物乳杆菌发酵豆乳在调控PCOS大鼠糖耐量上无明显效果。
图2 各组大鼠体重变化趋势
Fig.2 The trend of body weight of rats in each group
a-PCOS大鼠口服葡萄糖耐量测试；b-OGTT曲线下面积
图3 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠糖耐量的影响
Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum fermented soymilk on glucose tolerance of PCOS rats 注：*与模型组比较，P<0.05；#与空白组比较，P<0.05(下同)
2.3 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠卵巢病理形态学的影响
由图4-a可知，空白组大鼠卵巢表面色泽红润，可见黄体，无囊性卵泡，而模型组大鼠卵巢表面色泽变浅，黄体数减少，囊性卵泡数增加(图4-b)。由表3可知，CCFM1019组黄体数目有所增加，囊性卵泡数也有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05)；而LP4、LP5组卵巢中的黄体数并未有所增加，但囊性卵泡数有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。综上所述，CCFM1019发酵豆乳一定程度上可以减轻来曲唑引起的大鼠卵巢病变。
a-空白组；b-模型组；c-达英-35组；d-CCFM1019组； e-LP4组；f-LP5组
图4 发酵豆乳对PCOS大鼠卵巢病理形态的影响(×40)
Fig.4 Effects of L.plantarum fermented soymilk on histopathology of the ovary in PCOS rats 注：标尺为600 μm
2.4 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠血清性激素水平的影响
由图5-a、图5-b及图5-d、图5-e可知，与空白组相比，模型组大鼠血清中T、LH及FSH的水平显著升高、P的水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比，LP4组大鼠血清中LH水平显著降低(P<0.05)，CCFM1019组大鼠血清中E2水平显著提高(P<0.05)。此外，达英-35以及3组植物乳杆菌发酵豆乳均可以显著降低PCOS大鼠血清中T的水平(P<0.05)，其中，LP4效果最好，达英-35以及LP5次之，CCFM1019效果略差。而由图5-f可知，各组大鼠血清中GnRH水平差异均无统计学意义(P>0.05)。这些结果表明CCFM1019发酵豆乳在调节PCOS大鼠血清中E2水平上优势，而LP4发酵豆乳更倾向于在调节T、LH水平上发挥作用。
表3 各组大鼠的黄体数及囊性卵泡数 单位：个
Table 3 Number of luteal bodies and cystic follicles in each group
组别黄体数囊性卵泡数空白组8.17±1.940.00±0.00∗模型组4.25±1.268.00±1.15#达英-35组4.83±1.336.33±2.94CCFM1019组6.60±2.303.60±1.67LP4组4.60±1.526.00±1.41LP5组4.33±0.82#6.33±1.21P值0.003 00.005 6
a-血清T水平；b-血清LH水平；c-血清E2水平；d-血清FSH水平；e-血清P水平；f-血清GnRH水平
图5 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠血清性激素水平的影响
Fig.5 Effects of L.plantarum fermented soymilk on serum sex hormone levels in PCOS rats
2.5 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠生化分析指标的影响
对PCOS大鼠生化分析指标进行分析，如表4所示，与空白组相比，PCOS大鼠血清中AST含量显著上升(P<0.05)。与模型组相比，CCFM1019组大鼠血清中的AST含量显著降低(P<0.05)。此外，植物乳杆菌LP4、LP5发酵豆乳干预后，显著降低了大鼠血清中ALT及AST含量(P<0.05)。与空白组相比，模型组大鼠血清中LDL-C含量显著增加(P<0.05)，HDL-C含量显著下降(P<0.05)。植物乳杆菌发酵豆乳干预后在一定程度上降低大鼠血清中TG、TC及LDL-C含量，其中，LP5显著降低TC及LDL-C含量(P<0.05)。此外，除了CCFM1019组，其余组别大鼠血清中HDL-C含量进一步降低。因此，植物乳杆菌发酵豆乳对提高PCOS大鼠血清中HDL-C含量无明显效果。这些结果表明CCFM1019发酵豆乳在调节PCOS大鼠血清中的AST水平上有优势，而LP4发酵豆乳在调节ALT、AST、TC水平上有优势，此外，LP5发酵豆乳更倾向于在调节ALT、AST、TC、LDL-C水平上发挥作用。
表4 植物乳杆菌发酵豆乳对PCOS大鼠生化指标的影响
Table 4 Effects of L.plantarum fermented soymilk on biochemical indexes of PCOS rats
组别ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)空白组32.77±5.08105.35±11.78∗2.02±0.530.25±0.071.72±0.45∗0.16±0.03∗模型组32.60±3.25144.00±41.88#2.04±0.250.27±0.051.30±0.29#0.24±0.07#达英-35组40.92±13.21117.97±28.501.83±0.270.29±0.091.54±0.190.20±0.06CCFM1019组33.00±2.61104.47±18.62∗1.80±0.330.25±0.071.47±0.270.19±0.03LP4组27.32±6.45∗#97.40±21.49∗1.48±0.34∗#0.25±0.081.20±0.27#0.22±0.05LP5组21.02±4.04∗#63.55±6.34∗#1.03±0.10∗#0.24±0.070.87±0.08∗#0.11±0.03∗P值0.0010.000 30.000 60.856 70.001 20.004 4
3 结论与讨论
临床上，血清T、LH常作为PCOS患者的一项敏感性指标。研究表明[16]，乳酸双歧杆菌V9通过在宿主肠道的有效定植调节了PCOS患者的肠道微生物群，并恢复了他们体内的性激素水平。此外，研究表明植物乳杆菌HL2对PCOS大鼠体内卵巢病变有保护作用，并能恢复T、LH和FSH水平[14]。在本研究中，3株植物乳杆菌发酵豆乳和达英-35均显著降低了PCOS大鼠血清中T的水平，而植物乳杆菌LP4显著降低了大鼠血清中LH的水平。此外，植物乳杆菌CCFM1019发酵豆乳干预后大鼠血清E2水平显著提高，在临床实践中，PCOS患者由于卵泡发育更加活跃，可能会出现E2水平升高[17]。发酵豆乳干预后使E2升高，这一现象对于PCOS本身而言是否有利仍不清楚。同时，该影响是由益生菌本身造成，还是由豆乳中的雌激素类似物大豆异黄酮造成，还有待于进一步研究。糖代谢紊乱是PCOS患者代谢异常的显著表现症状之一。研究表明[18]，PCOS胰岛素抵抗患者体内摄取与利用葡萄糖的能力下降，使得葡萄糖耐量发生异常。此外，血脂异常也是PCOS患者的临床症状之一，主要以血清中TC、TG、LDL-C升高和HDL-C降低为特征[19]。本研究中，植物乳杆菌发酵豆乳干预后，在调节PCOS大鼠OGGT、TG等指标上无明显效果，与本研究结果相反的是，RASHAD等[20]证明，PCOS患者长期服用益生菌可以调节体内TG含量。原因可能是本研究周期仅为4周，远远少于RASHAD等12周的研究周期；同时本研究发酵豆乳活菌数为1×108CFU/mL，远远小于RASHAD等研究中的活菌数(1×1010 CFU/mL)；此外，本研究选用的是单菌株干预，而RASHAD等选用的是复配菌株干预(德氏乳杆菌和发酵乳杆菌)，也可能是造成本研究中发酵豆乳在调节PCOS大鼠OGGT、TG等指标上无明显效果的原因。
在本团队之前的研究中，植物乳杆菌CCFM1019在降低PCOS大鼠血清中E2水平上无显著效果[14]。而在本研究中，经过豆乳发酵后，植物乳杆菌CCFM1019可以显著升高PCOS大鼠血清中E2水平。此外，植物乳杆菌LP5在缓解PCOS大鼠的典型病理学表现上无显著效果，而在本研究中，经过豆乳发酵后，植物乳杆菌LP5可以显著降低PCOS大鼠体重增加量和血清中T、AST、ALT、TC以及LDL-C含量。这可能是因为发酵豆乳里面含有大豆异黄酮。研究表明[21]，大豆异黄酮可以降低PCOS大鼠体重。此外，本研究采用的是灌胃来曲唑进行PCOS大鼠造模，模型激素呈现高雄激素和低雌激素特点，发酵豆乳干预后，其中的大豆异黄酮可能发挥雌激素样作用，补充PCOS大鼠体内的雌激素，使得血清中的T水平下降。因此，植物乳杆菌发酵豆乳在一定程度上可能比单独使用植物乳杆菌(等量CFU)干预更能有效缓解PCOS大鼠症状。
在本研究中，3种植物乳杆菌发酵豆乳均可以在一定程度上缓解PCOS大鼠的典型病理学表现。其中，3株植物乳杆菌发酵豆乳均能显著下调PCOS大鼠血清中T、AST 水平。而CCFM1019发酵豆乳能够显著升高PCOS大鼠血清中E2含量，在一定程度上也减轻了PCOS大鼠卵巢病变。相比之下，LP4发酵豆乳可以降低PCOS大鼠血清中LH、ALT以及TC含量，此外，LP5发酵豆乳显著降低PCOS大鼠体重增加量以及血清中T、ALT、TC以及LDL-C含量。
综上所述，不仅特定植物乳杆菌菌株具有改善PCOS症状的能力，其发酵豆乳同样具有缓解PCOS的潜力。然而，发酵豆乳的功能性是否依赖于菌株活性并没有在本研究中得以验证。灭菌发酵豆乳是否依然具有缓解PCOS的潜力有待于进一步研究。
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