高盐稀态酱油中生物胺的差异性分析

生物胺(biogenic amines，BAs)是一类低分子质量含氮有机碱，由动植物及微生物产生，并且在自然界中普遍存在[1]。目前被发现的BAs共有3大类，主要有脂肪族的腐胺(putrescine，Put)、尸胺(cadaverine，Cad)、精胺(spermine，Spe)和亚精胺(spermidine，Spd)，芳香族的酪胺(tyramine，Tyr)和β-苯乙胺(β-Phenethylamine，β-Phe)，杂环族的组胺(histamine，His)和色胺[2](tryptamine，Try)，以及近些年在章鱼唾液中被发现的章鱼胺[3]。BAs本身在机体中发挥多种生理功能，是正常的活性物质，并在生命活动中起着重要作用[4]。然而，身体对BAs具有一定的耐受力，当含量过高身体就会出现偏头痛、胃部痉挛、呕吐、腹泻、过敏等中毒症状[5]。食品及药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)指出食物中His含量超过500 mg/kg就会对人体健康构成威胁，含量达到800 mg/kg的Tyr是有毒的，食物中总胺含量不应超过1 000 mg/kg[6]。BAs的形成主要与氨基酸的脱羧反应和醛的胺化反应有关[7]。食品发酵过程中微生物代谢的氨基酸脱羧酶作用于多种氨基酸，使其脱去羧基形成BAs，这是发酵食品中BAs的主要来源。因此，氨基酸、微生物以及氨基酸脱羧酶成为BAs产生的必备条件[8]。

调查发现，酱油、虾酱和干腌鱼等发酵食品中BAs水平较高[9]。酱油是以大豆、小麦、面粉或麦麸为原辅料，通过微生物发酵得到的液态调味品，氨基酸较丰富[10]。丰富的氨基酸为酱油提供独特鲜味的同时也为BAs的形成提供可能。再加上酱油发酵体系复杂，微生物种类繁多，不同微生物间的相互作用、代谢途径尚不完全明确，不能确切说明哪些参与了酱油发酵的微生物具有氨基酸脱羧酶分泌能力[11]。酱油中常见的BAs有8种：Try、β-Phe、Put、Cad、His、Tyr、Spd和Spe[12]，这使得酱油具有一定的健康风险，随着人们对健康生活的要求不断提高，酱油的食用安全性也得到了越来越多的关注。酱油在世界上占有重要地位并在我国市场上需求量大[13]，因此，为消费者提供安全可靠的可食用酱油意义重大。本文以华南地区生产的高盐稀态酱油为主要研究目标，研究了高盐稀态酱油中8种常见的BAs，并分析了相同品牌的不同等级间、相同等级的不同品牌间酱油中BAs组分的差异。为华南地区酱油的食用安全提供依据，为酱油工业中BAs调控技术的研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料部分购于广州市区各大小超市，部分取样于广州市如丰果子调味食品有限公司。

丹磺酰氯(纯度>99%)、BAs标准品、内标物(1,7-二氨基庚烷)，Simga公司；乙腈、甲醇(色谱纯)，迈瑞达公司；乙酸铵(色谱纯)，麦克林公司；谷氨酸钠，美国MYM公司；碳酸氢钠，天津百世化工有限公司；氢氧化钠，广东铭固化学科技有限公司；37%盐酸、硫酸铵，天津福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱仪(配有紫外检测器)，日本岛津公司；MD200型氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；涡旋振荡仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

采用丹磺酰氯柱前衍生法，ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，内标法定量。

1.3.1.1 溶液的配制

根据HAO等[14]的方法稍有改进，BAs标准混合使用液及标准系列溶液的配制：准确称取各BAs标品适量，于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，混匀，使质量浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L，现用现配。内标标准储备溶液及标准使用液的配制：准确称取内标标准品适量，用0.1 mol/L盐酸配制成内标使用液(100 mg/L)，临用现配。

丹磺酰氯衍生剂溶液：取适量丹磺酰氯，以丙酮为溶剂配制质量浓度为10 mg/mL的衍生剂使用液，置4 ℃冰箱，避光贮存。

1.3.1.2 样品及标准品的衍生

准确量取1.0 mL样品于15 mL离心管中，先后加入100 mg/L内标溶液250 μL、饱和碳酸氢钠溶液1 mL、1 mol/L氢氧化钠溶液100 μL、衍生试剂1 mL，涡旋振荡1 min后置于60 ℃恒温水浴锅中衍生15 min，取出，分别加入100 μL谷氨酸钠溶液，混匀，再置于60 ℃恒温反应15 min，取出冷却至室温，加入1 mL超纯水，涡旋振荡1 min，40 ℃氮气去丙酮(约1 mL)，加入0.5 g氯化钠，涡旋振荡至完全溶解，再加入5 mL乙醚，涡旋振荡2 min，静置分层，转移上层乙醚于15 mL离心管中，下层再次萃取，合并2次乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮气吹干。加入1 mL乙腈振荡混匀，使残留物溶解，0.22 μm滤膜针头滤器过滤，待测。相同方法衍生标准品溶液。

1.3.1.3 色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，紫外检测波长：254 nm，进样量：20 μL，流动相A：90%乙腈/10%(含0.1%乙酸)0.01 moL/L乙酸铵溶液，流动相B：10%乙腈/90%(含0.1%乙酸)0.01 moL/L乙酸铵溶液，流速：1.0 mL/min。洗脱程序见表1。

1.3.1.4 标准样品图谱

标准品衍生物图谱如图1所示，在上述梯度洗脱条件下，8种BAs衍生物分离效果佳，峰形较好。按出峰时间先后顺序各峰分别为Try、β-Phe、Put、Cad、1,7-二氨基庚烷、His、Tyr、Spd和Spe的衍生物。

1.3.2 氨基酸态氮及总酸的测定

根据GB 5009.235—2016比色法测定样品中氨基酸态氮质量浓度；根据GB/T 12456—2008滴定法测定样品中总酸。

根据GB 18186—2000将被测酱油按照氨基酸态氮质含量为3个级别：Low(<0.4 g/100mL)、Moderate(0.4～0.8 g/100mL)、High(>0.8 g/100mL)，分别表示普通、一级、特级。

采用Spss Statistics17.0进行数据分析，采用Simca 14.1和TBtools软件绘图，所有数据均以平均数±标准差表示(n=3)。

2 结果与分析

2.1 广州市售酱油中BAs分布情况

本次调查包含有华南地区市售的6个不同品牌3个级别2种类型的酱油，酱油间各具特色，不同种酱油的生产工艺、环境和原料都存在一定差异，即使同一品牌的不同等级酱油都具有较为明显的差异。氨基酸态氮和总酸是衡量酱油品质的重要指标，结果如附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210705009)和表2所示。

结果表明，被调查样品氨基酸态氮含量在0.25～1.13 g/100mL，平均值和中位数分别为0.583、0.51 g/100mL；取样包含不同品牌的特级、一级、二级和三级酱油。根据氨基酸态氮含量范围可看出本次市售酱油取样具有代表。总酸在14.774～73.311 mg/L，平均值和中位数分别为36.769、36.655 mg/L。

对30个酱油样品中BAs的检测发现，总胺大部分在10～500 mg/L，其含量超过1 000 mg/L的有3个，占10%，500～1 000 mg/L的有4个，占13.33%，低于10 mg/L的有3个，占10%。研究人员指出食物中总胺含量范围不应超过1 000 mg/kg。这说明我国市面上酱油中BAs含量大多数是在安全范围的，但安全问题也不容忽视。

每个酱油样品中均有至少5种BAs检出，并且其含量在被测样品中具有较大差异。对数据进行简单统计，如表2所示，30个样品中检出His、Spd的均有26个样品，各占86.7%；Spe有25个，占83.3%；Put和Cad检出数各为29，占96.667%；Try、β-Phe和Tyr均有检出；其中8种BAs的总含量平均值为333.681 mg/L，范围在17.440～1156.243 mg/L；可以看出β-Phe、Put、Cad、Tyr、Spd和Spe是市售酱油中主要的BAs。

His和Tyr被认为是对人体毒性最强的BAs，LINARES等[15]经过体外细胞毒性试验(HT29肠道细胞)发现，Tyr比His对细胞的毒害作用更强更快，Tyr引起细胞坏死，His诱导细胞凋亡。特别的，His通常与其他BAs(如Cad、β-Phe和Tyr等)同时出现，并使其毒性增强[16]。有研究人员发现，食物中His含量超过500 mg/kg就会对人体健康构成威胁，食物中含量达到800 mg/kg的Tyr是有毒的。表3可以看出，30个被测样品中His含量绝大部分低于10 mg/L，在安全范围内；Tyr主要分布在0～500 mg/L，其中低于10 mg/L的有15个占50%，在10～40、40～500 mg/L的分别有9和6个，占30%和20%；虽然Tyr的含量在安全范围内，但酱油中Tyr的含量总体相对较高，需要引起重视。

2.2 不同品牌酱油样品中BAs含量分析

对30个被测样品进行整理统计并绘制成热点图，如图2所示。热点图可更加直观的展现出样品间含量的差别，颜色越深点越大表示含量越高(冷色到暖色分别为0～12)。

BAs的产生要具备3个条件：游离氨基酸、能够产生氨基酸脱羧酶的微生物以及适合微生物代谢产生氨基酸脱羧酶的条件。影响发酵酱油中BAs含量的主要因素有微生物的数量种类、酱醪的pH、发酵温度、含盐量和原料[17]，可能不同品牌酱油的发酵工艺、环境、微生物种类和数量都存在一定差异，导致不同品牌酱油间各BAs含量存在较大差异[18]。总胺含量在WES、WTS2和WYS中最高，总胺含量均超过1 000 mg/L，3个样品均来自于W牌，W牌酱油发酵工艺有待改进。

2.3 酱油样品中BAs组分差异性分析

为了分析酱油中8种BAs之间的差异，利用正交偏较小二乘法(orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA)得到被测高盐稀态酱油中BAs的S-plot载荷图和差异变量(variable importance，VIP)得分图(图3～图6)。其中，S-plot图在中轴线附近的为相近组分，而远离原点的为差异组分。

以W牌为例，如图3-a～图3-c、图4-a所示，W牌的普通和一级酱油中差异性BAs为：Put、β-Phe、Tyr和Spe；普通和特级酱油中差异性BAs为：Spd、Put、β-Phe和Spe；特级和一级酱油中差异性BAs为：Spd、Tyr、Put和Try。图3-b～图3-d、图4-b显示这些组分的VIP>1(P<0.05)，可以得知同一品牌的不同等级酱油中BAs组分有显著性差异，说明不同等级对酱油中BAs有显著影响。

图5和图6中，展示了相同等级下的不同品牌酱油中BAs的差异组分。如图5-a、图5-c，H和Z牌的普通酱油中差异BAs为β-Phe、Cad，L和Z牌的普通酱油中差异性BAs为Cad、Put、Spd和Spe；图6-a、图6-c所示，L和Z牌的一级酱油中差异性BAs为Cad、Spd、Put和Spe，H和R牌的特级酱油中差异性BAs为Try、Spe、Tyr、Cad和β-Phe。图5-b～图5-d和图6-b、图6-d显示这些差异组分的VIP>1(P<0.05)，可以得知相同等级下的不同品牌酱油间的BAs组分有显著性差异，说明不同品牌对酱油中的BAs有显著影响。

综上所述，同品牌不同等级的酱油中BAs的显著差异组分为Put、β-Phe、Try、Spe、Spd和Tyr，而同等级不同品牌的酱油中BAs的显著差异组分为β-Phe、Cad、Spe、Spd、Try和Tyr。可看出β-Phe、Try、Spe、Spd和Tyr是不同等级和品牌酱油的共同差异组分。因此，β-Phe、Try、Spe、Spd和Tyr对不同等级和品牌酱油中BAs的组成具有重要影响。

同一品牌下，酱油的等级往往是由淋油次数不同造成的，首次淋取为头抽，营养价值较高，其余依次分级。虽然同一品牌的酱油有等级之分，但是原料、工艺和发酵环境却差别不大或相同，仅是淋取次数的差异就导致了同品牌酱油中的BAs含量和种类出现较大的差异，一定程度上，再次说明了影响BAs在酱油中富集的因素较多，形成机理复杂，值得深入研究。

3 结论

本次研究包含产自于华南地区的6个不同品牌的高盐稀态酱油，结果表明：

(1)30份酱油样品中β-Phe、Put、Cad、Tyr、Spd和Spe是市售酱油中主要的BAs。总胺大部分在10～500 mg/L，其含量超过1 000 mg/L的有3个，占10%，500～1 000 mg/L的有4个，占13.33%，低于10 mg/L的有3个，占10%。含量超过1 000 mg/L的占10%，说明我国市面上酱油中BAs含量大多数是在安全范围的，但安全问题也不容忽视。

(2)同一品牌的不同等级酱油中BAs组分有显著性差异，相同等级的不同品牌酱油中BAs组分也有显著差异，说明品牌和等级对BAs在市售酱油中的富集具有显著影响。β-Phe、Try、Spe、Spd和Tyr是不同等级和品牌酱油的共同差异组分，对不同等级和品牌酱油中BAs的组成具有重要影响。

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