益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，具有改善肠道功能、提高机体免疫力、促进代谢及神经系统发育等功能[1]。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是人体肠道内常见的益生菌，已经在食品中得到了广泛的应用。益生菌食品在我国的年平均增长率接近20%，放眼全球市场，预计到2022年将达到574亿美元[2]，具有巨大的经济价值和市场前景。发酵乳制品作为益生菌的最佳食品载体，具有营养丰富、口味多样化、老少皆宜等特点。但发酵乳中的益生菌在货架期的死亡率高达50%～80%[3]，因此，应针对性地添加益生元，以保护和促进益生菌生长。
益生元是一类不能被宿主机体消化、吸收和利用，但能选择性地促进体内有益菌的增殖和代谢，从而对机体产生有益作用的物质。常见的益生元有低聚果糖(fructo oligosaccharide，FOS)、菊粉(inulin)以及低聚木糖(xylooligosaccharide，XOS)等聚合度不一的植物性多糖。有研究显示，植物多糖能够促进肠道益生菌群(如乳酸杆菌和双歧杆菌)的增殖和产酸，具有与功能性低聚糖相似的益生元功效[4-6]，因此，植物多糖可作为新型益生元的主要来源，具有较大的研发价值。
黄参是伞形科迷果芹属(Sphallerocarpus gracilis)植物，有黄葑，野胡萝卜，加果(青海)，小叶山红萝卜(河北宛平)，达扭(四川德格)等别称[7]。其形似人参，通体金黄，有“小人参”之称，具有良好的药用效果及营养价值，食用历史悠久。黄参多糖(Sphallerocarpus gracilis polysaccharides，SGP)是黄参的主要功效成分，约占干重的3.5%，具有免疫调节[8]、抗氧化[9-10]、降血糖[11]、清除亚硝酸盐[12]等功效。目前，国内外对SGP的研究主要集中在多糖的提取、组成分析和生理功能等方面，尚无SGP对益生菌发酵、增殖影响的研究。因此，本研究以黄参粗多糖(crude Sphallerocarpus gracilis polysaccharides，CSGP)为原料，研究其单糖组成，在人工胃肠液中的水解度，以及对植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵乳中增殖的影响，对潜在的新型益生元——SGP的应用以及新型共生发酵乳的研制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄参，甘肃省张掖市山丹县；纤维素酶(7 000 U/g)，北京酷来搏科技有限公司；胰蛋白酶(4 000 U/g)、猪胆盐、木瓜蛋白酶(80 000 U/g)，北京索莱宝科技有限公司；纯牛乳(蛋白质5%，脂肪5%，非脂乳固体4.5%)，兰州庄园牧场股份有限公司；植物乳杆菌CGMCC-15801、鼠李糖乳杆菌CGMCC-16103，山东中科嘉亿生物工程有限公司；inulin、FOS，北京酷来搏科技有限公司(纯度>90%，DP<10)；葡萄糖(glucose,Glu)等单糖标准品，北京酷来搏科技有限公司(纯度>99%)；除氯仿、三氟乙酸等为色谱纯外，其他化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
5910R大容量高速冷冻离心机，Eppendorf；A-1000S旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；723 N可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HPX-150生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；6890-5973气相色谱-质普联用仪，美国安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 CSGP的提取
取适量黄参根，切块、粉碎、过80目筛，收集黄参粉，备用。
本实验采用超声波联合复合酶法[11]并加以改进提取CSGP。将干燥后的黄参粉溶于蒸馏水[料液比1∶40(g∶mL)]，调节溶液pH至5.8，加入1.6%(质量分数)木瓜蛋白酶和2.0%(质量分数)纤维素酶，超声(240 W，61 ℃，25 min)辅助酶解，然后95 ℃灭酶10 min。将酶解液离心(8 000 r/min，15 min)，取上清液，在65 ℃下减压浓缩，然后加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜。次日再次离心(10 000 r/min，10 min)，取沉淀物，最后真空冷冻干燥，即可得到CSGP。CSGP得率计算如公式(1)所示：
CSGP得率
(1)
1.3.2 CSGP中的还原糖、总糖以及蛋白质含量的测定
采用3,5-二硝基水杨酸法(3,5-dinitrosalicylic acid method，DNS)[13]测定CSGP中还原糖的含量；采用SN/T 4260—2015 《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口植物源类食品中粗多糖的测定-苯酚硫酸法》的方法测定CSGP中总糖的含量；采用SN/T 3926—2014 《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质的测定-考马斯亮蓝》的方法测定CSGP中蛋白质的含量。
1.3.3 CSGP的单糖组成测定
本实验采用GC-MS方法[11,14]测定CSGP的单糖组成。准确称取标准品[鼠李糖(rhamnose，Rha)、果糖(fructose，Fru)、阿拉伯糖(arabinose，Ara)、木糖(xylose，Xyl)、甘露糖(mannose，Man)、Glu和半乳糖(galactose，Gal)]各5.0 mg，分别加入8.0 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶，在90 ℃水浴中反应30 min，冷却至室温后加入0.5 mL乙酰氯，继续90 ℃水浴30 min。氮气吹干反应物，加入1.0 mL氯仿萃取，0.22 μm滤膜过滤后，收集滤液进行GC-MS分析。测定条件为：升温从120 ℃开始，维持5 min后，分阶段升温至250 ℃，维持5 min；流速1 mL/min，检测温度250 ℃，进样器温度220 ℃，分流比1∶50。质谱条件：电子电离(electron impact，EI)源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度250 ℃，扫描范围m/z 50～540。
准确称取CSGP 10.0 mg，在3.0 mL(2.0 mol/L)三氟乙酸中于110 ℃水解6 h后，用甲醇反复冲洗水解物，于60 ℃真空干燥，乙酰化反应处理方法同标准品。通过与标准品单糖比较，对CSGP进行了单糖组成分析，用面积归一化法计算相对摩尔比。
1.3.4 人工胃肠液消化实验
将CSGP、FOS(阳性对照1)和inulin(阳性对照2)分别配制成1 g/mL的溶液，备用。
采用MOHD NOR等[6]的方法配制人工胃液，并分别调节其pH至1～5。然后取5 mL不同pH的胃液添加到5 mL样品和阳性对照溶液中，于37 ℃反应6 h(振荡速率130 r/min)，于第1、2、4、6 h收集反应混合物，测定还原糖的含量。水解度计算如公式(2)所示：
水解度
(2)
式中：总糖含量、初始还原糖含量为水解前测得，还原糖释放量=某时间点的还原糖含量-初始还原糖含量。
采用AAR
N等[15]的方法配制人工肠液，并调节pH至6～7。取5 mL于人工胃液(pH=2)消化结束后的样品溶液和阳性对照溶液分别加入5 mL肠液中，于37 ℃反应6 h(振荡速率45 r/min)，于第1、2、4、6 h收集反应混合物，测定还原糖的含量。水解度计算公式如公式(2)所示。
1.3.5 发酵乳的制备
将巴氏消毒后的鲜牛乳冷却至37 ℃，以适当比例接种植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌，然后将接种后的牛乳均分为3组，分别设为实验组、阳性对照组和空白对照组。实验组分别添加1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/100mL的CSGP；阳性对照组分别添加同等比例的inulin或FOS，空白对照组不额外添加任何碳水化合物。将各组置于37 ℃培养3 h，然后置于4 ℃冰箱中冷藏，待检。
1.3.6 菌落计数的方法
于样品冷藏贮存的第1、7、14、21天，按照GB 4789.35—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验》的方法进行菌落计数。增殖率计算如公式(3)所示：
增殖率/%
(3)
1.3.7 数据处理
所有实验均重复3次，实验结果表示为平均值±标准差，实验中所有数据均采用Origin 2018(OriginLab，USA)软件绘图，SPSS 25.0(IBM，USA)软件进行ANOVA单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 CSGP的理化指标
实验发现，CSGP得率为(31.0±4.0)%；总糖质量分数为(65.5±4.32)%，其中还原糖质量分数为(18.43±2.19)%，蛋白质质量分数为(0.36±0.18)%。
2.2 CSGP的单糖组成
单糖标准品Rha、Ara、Xyl、Man、Gal、Fru、Glu和CSGP的气相色谱-质谱图如图1所示。对比可知，CSGP主要由6种单糖组成：Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal，其摩尔比为16.3∶15.5∶5.1∶8.2∶37.1∶17.8。
a-标准品GC-MS谱图；b-CSGP GC-MS谱图
图1 单糖标准品和CSGP单糖组成的GC-MS谱图
Fig.1 GC-MS chromatograms of monosaccharide standards and monosaccharide compositions of crude SGP
2.3 CSGP在人工胃肠液中的水解情况
CSGP在人工胃液中的水解度如图2-a～图2-e所示。CSGP与阳性对照的水解度随着pH的升高而降低，这可能是由于在较低pH环境中，糖苷键更容易发生断裂，从而导致多糖水解度增加；随着孵育时间延长，更多的多糖在酸性条件下水解为单糖和二糖[16]，从而水解度也逐渐增大。在同一pH条件下，CSGP的水解度都显著低于同一时间点的阳性对照(P<0.05)，说明CSGP比FOS和inulin更能抵抗胃酸的水解，这可能与其单糖组成、糖苷键类型不同有关。通过GC-MS分析了CSGP的单糖组分，发现其主要由Rha、Ara、Man、Xyl、Glu和Gal组成，而FOS和inulin主要由Glu、Fru组成。人体胃液的pH为0.9～1.8，进食后胃液pH为2～4，食物通常在胃中保留2 h左右，然后进入肠道。当CSGP在pH=2～4的人工胃液水解6 h后，CSGP的水解度分别为1.60%、1.10%、0.65%，表明至少能有98.40%的CSGP可耐受胃液的水解到达肠道。图2-f为CSGP与阳性对照在人工肠液中的水解情况。CSGP与阳性对照的水解度随着消化时间的延长而升高，3者之间的水解度无显著性差异。当水解6 h后，CSGP的水解度仅为0.11%。因此，可认为CSGP在人工胃肠液中几乎不水解。
2.4 植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌在货架期的数量变化
有研究[17]发现，中药中的多糖类成分，尤其是补益类中药对益生菌生长具有一定的促进作用，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在货架期的数量变化情况如图3所示。由图3-a和图3-d可知，在整个货架期期间，实验组的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌落总数均在108数量级以上，均高于空白对照(P<0.05)，随着CSGP添加量的变化，植物乳杆菌在第21天的菌落总数是第1天的1.51～2.80倍；鼠李糖乳杆菌在货架期第21天的菌落总数是第1天的2.04～5.04倍，这表明CSGP可有效促进植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的生长增殖，减缓植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的死亡。
a-人工胃液pH=1；b-人工胃液pH=2；c-人工胃液pH=3；d-人工胃液pH=4；e-人工胃液pH=5；f-人工肠液
图2 CSGP在人工胃肠液中的水解情况
Fig.2 Hydrolysis of CSGP in artificial human gastrointestinal fluid
a-植物乳杆菌/CSGP；b-植物乳杆菌/FOS；c-植物乳杆菌/inulin；d-鼠李糖乳杆菌/CSGP；e-鼠李糖乳杆菌/FOS；f-鼠李糖乳杆菌/inulin
图3 植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在货架期的菌落数量变化情况
Fig.3 Viable cell counts of L.plantarum and L.rhamnosus during shelf life 注：组间多重比较采用LSD法；同一柱状图上方不同的小写英文字母，表示差异显著(P<0.05)
由图3-a～图3-c可知，与空白对照组对比，实验组和阳性对照组中的植物乳杆菌菌落总数在货架期第1～14天逐渐增多，第14～21天逐渐减少，呈先增后减的趋势(P<0.05)；菌落总数增加可能与其耐受低pH有关；此外，其代谢产物如小分子酸、细菌素以及过氧化氢等活性物质会形成化学屏障，保护自身免受外界干扰[18]；后期减少可能与环境pH过低有关，长期处于低pH环境，会使乳杆菌的膜电荷发生改变，影响细胞通透性，进而影响乳杆菌对营养物质的吸收和胞内酶的活性，使乳杆菌生长受到抑制，甚至死亡[19]。由图3-d～图3-f可知，实验组中的鼠李糖乳杆菌的菌落数量在货架期内呈持续增加趋势，在1～7 d，菌落数量增加迅速，7～21 d，菌落数量增加相对缓慢，空白对照和阳性对照组的变化趋势与其基本一致，但在整个货架期的菌落数量增加相对缓慢。植物乳杆菌主要发酵Glu、Xyl、Man和Gal，鼠李糖乳杆菌主要发酵Glu、Rha和Gal，而CSGP中的Rha、Ara、Man、Glu和Gal含量相对较高，有利于促进这两株菌的增殖。
由图3可知，以整个货架期内植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活菌总数为考察指标，对植物乳杆菌增殖具有最强促进作用的CSGP、FOS和inulin添加量分别是2.5、3.5、3.0 g/100mL；对鼠李糖乳杆菌具有最强促进作用的CSGP、FOS和inulin的添加量分别3.0、2.5、3.0 g/mL，比较CSGP和阳性对照物在各自最适添加量下对乳杆菌增殖率的影响，可进一步评价CSGP的潜在益生元效用。
图4反映了乳杆菌在各碳水化合物的最适添加量下的增殖率。由图4-a～图4-c可知，当CSGP和阳性对照的添加量均为2.5、3.0或3.5 g/100mL时，植物乳杆菌增殖率先增后减，第14天达到最大值，CSGP组的增殖率分别是258%、386%、410%，分别是同期FOS组增殖率的4.65、6.71、5.09倍，是同期inulin组增殖率的7.45、9.63、8.99倍；由图4-d和图4-e可知，当CSGP和阳性对照的添加量均为2.5、3.0 g/100mL时，鼠李糖乳杆菌增殖率随时间持续增加，在第21天达到最大值，CSGP组的增殖率分别是260%和405%，分别是同期FOS组增殖率的11.35、36.52倍，是同期inulin组增殖率的12.15、11.67倍。综上所述，实验组增殖率明显高于阳性对照组，表明CSGP对促进植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的增殖效果显著优于FOS和inulin，可以推测CSGP可能是潜在的益生元，其益生性能比FOS和inulin更好。
a-植物乳杆菌/2.5 g/100mL添加量；b-植物乳杆菌/3 g/100mL添加量；c-植物乳杆菌/3.5 g/100mL添加量；d-鼠李糖乳杆菌/ 2.5 g/100mL添加量；e-鼠李糖乳杆菌/3 g/100mL添加量
图4 在CSGP、FOS及inulin的最适添加量下，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在货架期的增殖率
Fig.4 The proliferation rate of L.plantarum and L.rhamnosus during shelf life with the optimal addition amount of CSGP, FOS and inulin
3 结论
CSGP在人工胃液中的水解度仅为2.0%，当CSGP的添加量分别为3.5、3.0 g/100mL时，货架期中的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的增殖率分别高达410%和405%，说明CSGP能显著促进这两种益生菌在货架期的增殖，提高益生菌的活性。因此，可以推测CSGP是一种潜在的益生元，然而其益生元特性还需要结合体内实验进一步验证。
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