食品在加工、运输、贮存等过程中有可能带入有害物质，如兽药残留、重金属残留、农药残留、致病菌等[1]，对食品质量安全造成威胁，因此有必要探索准确、高效、灵敏、经济的检测方法以保障消费者的食品安全。传统的食品安全检测方法如气相色谱法[2]、高效液相色谱法[3]等虽然准确性高，但是步骤繁琐、成本高、耗时长、需在实验室进行，不能实现高效、现场检测。近年来，随着纳米技术的发展，许多基于纳米材料的智能传感器在检测中得到广泛应用[4]。
金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNPs)是指粒径范围在1～100 nm的超细金微粒，也被称为金胶体(gold colloids)。由于具有独特的局域表面等离子体共振特性和较高的摩尔消光系数，AuNPs表现出与尺寸相关的颜色变化。随着AuNPs粒径的增加，表面等离子共振谱带从可见光区向近红外区移动，溶液颜色反映出从红色到蓝色的变化[5]。
除了具有良好的光学性质，AuNPs还具有类似天然酶的活性，如过氧化物酶、过氧化氢酶、氧化酶和超氧化物歧化酶等[6]。由于AuNPs具有类似过氧化物酶的性质，因此在H2O2存在的情况下，AuNPs可以催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)[7]、ABTS[8]、邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)[9]、Amplex Red(AR)[10]等底物发生显色或荧光反应，从而利用底物颜色变化构建传感器。此前AuNPs比色传感器大多基于调控距离的聚集比色而构建，近年来基于AuNPs酶活性构建的比色传感器应用越来越多，本文将重点讨论基于AuNPs过氧化物酶活性构建的比色传感器的传感原理及其在食品安全检测中的应用。
1 AuNPs的制备方法
AuNPs的经典合成方法是由TURKEVICH于1951年提出，然后由FRENS于1973年发展的Turkevich-Frens法[11]。将还原剂(如柠檬酸钠、硼氢化钠、抗坏血酸等)加入氯金酸溶液中，Au3+被还原成Au0，这种方法可合成粒径10～50 nm的球形AuNPs，过程简单，不需要高成本的专用设备。BRUST和SCHIFFRIN在1994年提出的Brust-Schiffrin法可以合成更小粒径的AuNPs，在正十二烷基硫醇存在下，用硼氢化钠在水-甲苯两相中还原氯金酸，从而制得粒径为1～8 nm内的热稳定AuNPs[12]。除了上述化学合成法外，还有晶种法[13]和生物合成法[14]等。
2 基于AuNPs过氧化物酶活性比色传感器 的检测原理
基于AuNPs的比色传感器主要有两种类型，一种依赖于AuNPs的表面等离子体共振特性，一种利用AuNPs能模拟天然酶发挥催化作用的性质。前者通过对AuNPs进行表面修饰，利用靶标和修饰基团之间的相互作用就可以调控AuNPs的分散状态，呈现出不同的颜色，来实现对靶标的检测[15]。不同的是，AuNPs酶活性比色传感器的颜色变化来自底物的显色反应，而不是AuNPs本身。与靶标的相互作用使AuNPs的酶活性发生变化，从而使反应底物呈现不同颜色，通过反应底物的颜色变化来检测靶标。目前报道的AuNPs酶活性比色传感器主要利用AuNPs的过氧化物酶性质，可分为以下两类：靶标吸附-AuNPs传感器、靶标-适配体-AuNPs传感器。
2.1 靶标吸附-AuNPs传感器的检测原理
AuNPs具有类似过氧化物酶活性，能打开H2O2的O—O化学键形成羟自由基，催化无色底物(如TMB)氧化生成显色产物(如蓝色的oxTMB)，产物的颜色深浅与AuNPs酶活性正相关[15]。靶标吸附在AuNPs表面，改变AuNPs表面性质，从而调节AuNPs的酶活性。如卡那霉素[7]、三聚氰胺[16]、亚砷酸盐[17]、Pb2+[18]、Hg2+[19-22]增强AuNPs的过氧化物酶活性，而多巴胺[23]、乐果农药[9]则减弱AuNPs的过氧化物酶活性。通过肉眼观察或仪器手段衡量显色产物的颜色变化，即可对靶标进行定性或定量检测。检测原理如图1所示。
图1 靶标吸附-AuNPs传感器的检测原理
Fig.1 Detection principle of the target-AuNPs sensors
2.2 靶标-适配体-AuNPs传感器的检测原理
适配体(aptamer)是一段单链DNA或RNA，可以与核酸、蛋白质、金属离子和小分子发生特异性结合[24]，具有亲和力高、体积小、易于合成和修饰等优点。ELLINGTON等[25]首次报道使用指数富集配体系统进化技术，从随机单链核酸序列库中分离合适的结合序列，然后进行PCR扩增，可以得到与靶标高度特异性亲和的适配体。单链DNA通过碱基的配位作用吸附到AuNPs表面[26]，影响AuNPs酶活性，从而构建适配体-AuNPs比色传感器。靶标通过与适配体的结合，间接调控AuNPs的过氧化物酶活性，实现比色检测。靶标对AuNPs过氧化物酶活性的调控表现为增强或抑制，关于其机理，有以下两种解释。
一种解释认为，适配体屏蔽了AuNPs表面的活性位点，使AuNPs酶活性被抑制。加入靶标后，由于适配体与靶标的高亲和力、特异性结合，导致适配体结构变化并从AuNPs表面解吸附，AuNPs活性位点重新暴露，从而恢复酶活性(图2-a)[27-31]。
另一种解释认为， DNA通过碱基吸附在AuNPs上，其带负电荷的磷酸骨架暴露在AuNPs表面，使DNA-AuNPs复合物的负电荷密度增加，与带负电荷的底物(如ABTS)相互作用减弱，表现为酶活性降低,与带正电荷的底物(如TMB)作用力更强，表现出明显的酶活性增强。当靶标存在时，靶标-适配体的结合使适配体从AuNPs上解吸附，AuNPs表面负电荷减少，相应地导致AuNPs的酶活性增强(负电荷底物)(图2-b)或减弱(正电荷底物)(图2-c)[8, 32-35]。
a- AuNPs酶活性增强;b-AuNPs酶活性增强;c- AuNPs酶活性减弱
图2 靶标-适配体-AuNPs传感器的检测原理
Fig.2 Detection principle of the target-aptamer-AuNPs sensors
3 基于AuNPs过氧化物酶活性的比色传感 器在食品安全检测中的应用
兽药、农药的残留，以及重金属、致病菌和其他非法添加成分是导致食品安全问题的主要来源，危害人类健康。基于AuNPs过氧化物酶活性构建的比色传感器已被应用于各类食品样品的安全检测，如表1所示。
表1 基于AuNPs过氧化物酶活性比色传感器的应用
Table 1 Application of colorimetric sensor based on AuNPs peroxidase activity
传感器类型检测原理AuNPs合成配体反应底物适配体靶标样品检测限检测时间/min参考文献靶标吸附-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠TMB无卡那霉素奶、肉0.1 nmol/L45[7]靶标吸附-AuNPs增强酶活性1-甲基-D-色氨酸TMB无诺氟沙星-0.2 μmol/L30[36]靶标吸附-AuNPs增强酶活性谷胱甘肽TMB无Pb2+水2 μmol/L-[18]靶标吸附-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠TMB无Hg2+-0.3 nmol/L-[19]靶标吸附-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠TMB无Hg2+水0.15 μmol/L10[20]靶标吸附-AuNPs增强酶活性β-环糊精TMB无Hg2+-0.06 μmol/L10[21]靶标吸附-AuNPs增强酶活性壳聚糖TMB无Hg2+水0.02 μmol/L10[22]靶标吸附-AuNPs增强酶活性硼氢化钠TMB无三聚氰胺奶、奶粉0.2 nmol/L10[16]靶标吸附-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠TMB无亚砷酸盐水0.01 mg/L 5[17]靶标吸附-AuNPs减弱酶活性柠檬酸钠OPD无乐果农药西红柿、黄瓜、卷心菜4.7 μg/L30[9]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性酪氨酸TMB有卡那霉素-1.49 nmol/L3～8[27]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性酪氨酸TMB有卡那霉素蜂蜜0.73 nmol/L20[28]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠ABTS有链霉素奶86 nmol/L10[8]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性酪氨酸TMB有啶虫脒-120 μg/L10[29]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠ABTS有啶虫脒西红柿1.02 μg/L-[34]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠TMB有铜绿假单胞菌水60 CFU/mL10[30]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠TMB有鼠伤寒沙门氏菌蛋1 CFU/mL3[37]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性牛血清白蛋白TMB有金黄色葡萄球菌猪肉、牛奶10 CFU/mL65[38]靶标-适配体-AuNPs增强酶活性柠檬酸钠TMB有玉米赤霉烯酮玉米、玉米油10 μg/L15[31]靶标-适配体-AuNPs减弱酶活性谷胱甘肽TMB有四环素奶46 nmol/L90[33]靶标-适配体-AuNPs减弱酶活性柠檬酸钠TMB有单增李斯特菌猪肉5 CFU/mL45[39]靶标-适配体-AuNPs减弱酶活性柠檬酸钠TMB有相思子毒素奶0.05 nmol/L10[35]靶标-适配体-AuNPs减弱酶活性柠檬酸钠TMB有孔雀石绿水1.8 nmol/L-[40]
注：“-”表示原文中未给出相关内容
3.1 食品中兽药残留的检测
可食用动物加工成食品后，在养殖过程中使用的兽药有可能会有残留，如抗生素、抗菌剂等。SHARMA等[27]利用AuNPs类过氧化物酶活性和Ky2适配体构建“turn-off/turn-on”传感器，实现了卡那霉素的高灵敏快速检测，检测限1.49 nmol/L，时间3～8 min，比传统的盐诱导AuNPs聚集方法灵敏15倍，速度快20倍。WANG等[7]发现卡那霉素通过—NH2吸附在柠檬酸盐封端的AuNPs上，改变AuNPs表面性质，从而增强AuNPs的过氧化物酶活性；基于此原理，开发了基于AuNPs过氧化物酶活性变化直接检测卡那霉素的方法，方法简便，不需要对AuNPs进行任何修饰，在奶、肉中检测限低至0.1 nmol/L。ZHAO等[8]以ABTS为显色底物构建AuNPs-适配体传感器检测牛奶中的链霉素，线性范围0.1～0.5 μmol/L，检测限86 nmol/L。类似地，SONG等[36]发现带负电的诺氟沙星通过静电相互作用吸附在带正电荷的1-Me-D-Trp@AuNCs(1-甲基-D-色氨酸修饰的纳米金簇)表面，提高1-Me-D-Trp@AuNCs的酶活性，无需适配体即可直接检测诺氟沙星，检测限0.2 μmol/L。ZHANG等[33]发现四环素的特异性适配体增强AuNPs酶活性，而加入四环素时，AuNPs酶活性降低，以此实现原料奶中四环素的高灵敏度检测，该方法检测限为46 nmol/L。
3.2 食品中重金属的检测
环境中的重金属元素可能通过食物链转移至人体，危害人类身体健康。LIAO等[18]利用Pb2+诱导AuNPs聚集，增强其过氧化物酶活性的原理，建立了一种简单可靠的比色方法，用于检测水中的Pb2+含量。LONG等[19]发现Hg2+可被AuNPs表面的柠檬酸钠还原为Hg0，Hg0分散在AuNPs表面，改变表面性质，提高AuNPs的过氧化物酶活性，从而无标记检测Hg2+。HAN等[20]的研究证实了LONG的观点，并且制成了AuNP比色试纸条，能同时执行多个样品检测，简单便携，可应用于现场检测。AN等[21]在LONG的比色传感体系的基础上，使用温度计作为信号读取器，当加入Hg2+时，AuNP@β-CD(β-环糊精修饰的纳米金)的催化活性显著提高，蓝色oxTMB的形成增强，从而导致温度升高，可以在10 min内快速检测，检测限0.06 μmol/L。JIANG等[22]用生物相容性更高的壳聚糖纳米金(CS-AuNPs)检测水中的Hg2+，检测限为0.04 μmol/L。
3.3 食品中农药残留的检测
蔬菜、水果、谷物等农作物表面易残留种植过程中施用的农药。HU等[9]发现乐果农药的分子结构中含有酰胺键，可能起着与巯基相似的作用，能螯合Au+来抑制AuNPs的酶活性，因此可用AuNPs检测黄瓜、西红柿、卷心菜等农产品中的乐果农药，检测限为4.7 μg/L。WEERATHUNGE等[29]和 YANG等[34]利用啶虫脒与适配体结合从而恢复AuNPs酶活性，分别以TMB和ABTS为显色底物，开发了检测啶虫脒的适配体-AuNPs传感器，各自的检测限分别为120、1.02 μg/L。
3.4 食品中致病菌的检测
食源性致病菌直接或间接污染食品及水源，是导致食品安全问题的重要来源。DAS等[30]利用铜绿假单胞菌与其适配体的结合恢复AuNPs的酶活性构建传感器，可以在10 min内完成快速检测，检测限为60 CFU/mL。CHEN等[37]也基于此原理建立了鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，在鸡蛋样品中检测限低至1 CFU/mL。YAO等[38]选择金黄色葡萄球菌免疫球蛋白Y作为适配体，适配体修饰抑制了AuNPs催化活性，金黄色葡萄球菌的结合恢复AuNPs酶活性，催化TMB底物显色。该方法对复杂食品基质中金黄色葡萄球菌的定量检测具有很强的抗干扰能力，在猪肉、牛奶中检测限为10 CFU/mL，但检测时间较长，需要65 min。陈威风等[39]发现单增李斯特菌的适配体增强AuNPs酶活性，单增李斯特菌与适配体特异性结合使AuNPs酶活性降低，从而检测猪肉中的单增李斯特菌，检出限约为5 CFU/mL。
3.5 食品中其他非法成分的检测
NI等[16]利用三聚氰胺使AuNPs过氧化物酶活性增强的原理简便快速地检测原料奶和奶粉中的三聚氰胺，检测限为0.2 nmol/L。基于相似的原理，XUE等[17]建立了亚砷酸盐的检测方法，检测限为0.01 mg/L。SUN等[31]报道了一种基于适配体的比色检测法玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)，适配体抑制AuNPs酶活性，在ZEN存在的情况下，适配体与ZEN结合，不再抑制AuNPs酶活性，此方法可在15 min内快速响应，检测限为10 ng/mL。而HU等[35]报道的相思子毒素(abrin)检测原理则刚好相反，abrin的适配体活化AuNPs表面提高酶活性，abrin结合导致适配体从AuNPs表面脱附，导致酶活性降低。ZHAO等[40]用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)修饰AuNPs，适配体抑制CATB-AuNPs的酶活性，加入孔雀石绿后，酶活性恢复，此方法检测限低至1.8 nmol/L。
4 存在的问题与展望
4.1 存在的问题
不难发现，目前基于酶活性的适配体-AuNPs比色传感器的核心原理是靶标结合适配体使其从AuNPs上解吸附，从而调控酶活性。这种解释基于一个假设前提：靶标与适配体结合的亲和力远大于适配体与AuNPs的结合力，只考虑到靶标与适配体的结合，而忽略了靶标与AuNPs之间潜在的相互作用。最近的一些研究表明，靶标仅能解吸下来极少的预先吸附的适配体(解吸率<5%)[41]，也就是说几乎不可能通过靶标-适配体结合从AuNPs表面解吸适配体；同时，靶标可以吸附在AuNPs上，并且抑制适配体的吸附[42-46]。因此AuNPs酶活性的调控可能不依赖于靶标-适配体的结合，而是取决于靶标与AuNPs的吸附。如前文所述，SHARMA等[27]用适配体-AuNPs检测卡那霉素，认为卡那霉素通过特异性结合使适配体解吸，从而增强AuNPs酶活性。但根据ZHOU等[47]的报道，卡那霉素很难使适配体从AuNPs表面解吸(卡那霉素浓度为10 μmol/L时，适配体几乎没有解吸，浓度高达0.1 mmol/L时只有12%适配体解吸，而浓度再升高并没有引起更多的适配体解吸)；同时，WANG等[7]发现卡那霉素通过静电吸引和氨基-羧基相互作用强吸附在柠檬酸盐包被的AuNPs表面。因此AuNPs酶活性的增强很可能归功于卡那霉素在AuNPs上的吸附，而不是适配体从AuNPs表面解吸[48]。
因此我们在讨论靶标-适配体-AuNPs比色传感的原理时，务必要考虑AuNPs对靶标的吸附情况。对于AuNPs弱吸附的靶标，如K+，可以用靶标-适配体结合使适配体从AuNPs解吸，从而调控AuNPs酶活性来解释[46]。但对于强吸附的靶标，如卡那霉素[27]、氯霉素[42]、亚砷酸盐[44]、ATP[45]、多巴胺[46]等，这种原理解释只有部分正确。为了更严谨地解释，可以引入一段适配体的非结合突变序列作为对照[42]，或者对AuNPs进行表面修饰使其对靶标的吸附力减小[49]。
4.2 展望
基于AuNPs过氧化物酶活性构建的比色传感器已经在应用方面取得了很多优秀的成果，但仍然面临一些亟待解决的问题，如下：
(1)吸附在AuNPs上的靶标分子如何调节AuNPs的酶活性，还有待系统地研究。
(2)提高AuNPs在中性条件下的酶活性。AuNPs的最佳催化活性一般发生在强酸性条件下(pH值在3～4左右)，中性条件下的过氧化物酶活性可以忽略不计[50]。这一缺点导致AuNPs无法应用于某些需要中性pH条件的靶标(如蛋白质)，因为蛋白质在强酸性环境中会发生构象变化，可能导致检测的准确性和灵敏度变差。
(3)基于AuNPs酶活性构建的比色传感器，绝大多数利用的是AuNPs过氧化物酶性质，其他酶性质的利用还有待开发，期待未来创造更多的响应信号类型。
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