核桃(Juglans regia L.)，胡桃科植物，含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素E、维生素B族以及镁、钾、铁等多种矿质元素，具有“长寿果”的美誉，与扁桃、腰果、榛子并称为世界“四大干果”[1-2]。同时，核桃仁尤其是核桃仁上包裹的内种皮富含酚类、黄酮类物质等抗氧化成分[3-4]。大量流行病学研究显示，经常食用核桃可以有效降低多种疾病的发生率，核桃中富含酚类物质是重要原因[5]。酚类物质具有抗氧化、抗炎、抗癌、提高免疫力等生物活性[6-7]。酚酸是酚类物质中的一类，约占植物源食品中酚类化合物的三分之一，多为苯甲酸和肉桂酸的羟基化衍生物，还有少量缩合酚酸[8]。研究表明酚酸与采后运输、贮藏、诱导抗性及果实色泽和风味等品质指标密切相关[9]。酚酸的种类和含量因地理环境、气候条件、栽培措施、提取方法等的不同有所差异[10-13]。
酚酸存在形式复杂，有可溶性游离态、可溶性酯化态和不溶性结合态3种不同的存在形式[14]。其中，可溶性酯化态和不溶性结合态酚酸大多通过酯键或醚键与多肽、蛋白质、纤维素和糖等其他大分子物质相结合，需经水解释放出来才能被测定[15]。不同植物中酚酸的种类和含量均有所不同。目前已有核桃中酚酸含量的报道，但研究多集中于可溶性游离型酚酸[16]。不同形态的酚酸在多种水果、谷物麸皮和核桃仁等中得到鉴定[8,17-19]，但对核桃内种皮中酚酸关注较少，尤其对于酯化态酚酸和结合态酚酸鲜见相关报道[20]。可溶性游离态酚酸在体内外实验中均被证明有较强的抗氧化活性[7,21]，另有研究表明可溶性酯化态和不溶性结合态酚酸可以与细胞壁相结合，作用于消化道，经酶解并释放出生物活性物质，可以预防结肠癌等慢性疾病[22]。因此，全面分析核桃内种皮中酚酸的形态分布具有重要意义。
酚类化合物常用的萃取溶剂为甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等，其中甲醇或乙醇水溶液被认为是提取核桃仁多酚的有效溶剂。由于氧原子电负性比氢原子大，电子云偏向氧，所以H表现出酸性。比较三者酸性强弱就是比较对H原子的束缚能力，也就是电子云偏向。比较三者结构，乙醇比甲醇多1个甲基，由于甲基的给电子效应，分散了原本偏向O原子的电子云密度，所以对H原子的束缚能力减弱，酸性降低。同理可得甲醇酸性比水低。水适合提取极性化合物，而甲醇、乙醇适合提取极性较小的化合物，不同比例的甲醇水溶液和乙醇水溶液是否也适用于从核桃内种皮中提取多酚，是我们要研究的问题。
酚酸化学结构相似，具有相似的物理化学性质，色谱保留时间相近，紫外可见及荧光光谱相似[14]。本研究利用超高效液相色谱-串联质谱法对核桃内种皮中的可溶性游离态、可溶性酯化态和不溶性结合态3种形态的羟基苯甲酸类、羟基肉桂酸类和缩合酚酸三类14种酚酸含量进行分析，以期为核桃和其他坚果内种皮中的酚酸类化合物的生物活性研究提供数据支持与理论依据。
1 材料与方法
1.1 仪器、材料与试剂
1.1.1 仪器
1290 Infinity-6460 QQQ液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，美国Agilent公司；FreeZone 6L真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；CPA225D十万分位分析天平，德国Sartorius公司；SB-5200 DTD大功率超声波水浴，宁波新芝生物科技公司；Biofuge Stratos高速冷冻离心机，美国Thermo公司。
1.1.2 试剂与材料
甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸(均为色谱纯)，德国Merck公司；超纯水(电阻率18～25 MΩ·cm)，实验室超纯水仪制备；14种酚酸标准品(表1，纯度均大于98%)，美国Sigma-Aldrich公司；核桃样品，新疆叶城。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理
核桃去掉青皮和外壳后，用液氮急冻将内种皮从核桃种仁表面分离出来，真空冷冻干燥12 h(含水量小于6%)，干燥后的核桃内种皮用粉碎机磨成细粉，过40目筛，并贮存于-20 ℃冰箱中，备用。
1.2.2 不同形态酚酸的提取制备
在本课题组前期核桃仁方法的基础上进行改进[23]。精确称取0.5 g核桃内种皮置于15 mL离心管里，加入10 mL溶剂，40 ℃超声提取30 min，10 000 r/min离心5 min。再分别用5 mL溶剂重复2次进行上述提取和离心操作。合并3次上清液，并蒸发掉有机溶剂。用6 mol/L HCl调节浓缩滤液pH值为2，用等体积乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，将乙酸乙酯相真空浓缩(30 ℃)，去除有机溶剂后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃内种皮可溶性游离态酚酸。
将上述萃余水相加入10 mL 4 mol/L NaOH，30 ℃水浴2 h，用6 mol/L HCl调节反应液pH值为2，用等体积乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，将乙酸乙酯相真空浓缩(30 ℃)，去除有机溶剂后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃内种皮可溶性酯化态酚酸。
离心后的残渣中加入10 mL 4 mol/L NaOH，30 ℃水浴2 h，用6 mol/L HCl调节反应液体pH值，用等体积乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，将乙酸乙酯相真空浓缩(30 ℃)，去除有机溶剂后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃内种皮不溶性结合态酚酸。
1.2.3 标准溶液的配制
精密称取酚酸标准品，用甲醇分别配成单标溶液，用于仪器建立各个酚酸的离子对信息；把单标配成质量浓度为10 μg/mL的混合标准储备液，再将储备液逐级稀释成质量浓度范围为0.01～1 μg/L的混合标准工作液。所有标准溶液均置于-20 ℃避光贮存，恢复到室温上机。
1.2.4 仪器工作条件
直接使用本课题组前期建立的仪器方法[23]。液相色谱条件：色谱柱为 Agilent Poroshell 120 EC-C18 column (100 mm × 2.1 mm, 1.9 μm)，柱温40 ℃；流动相A为0.05%(体积分数)甲酸水溶液，流动相B为甲醇-乙腈(体积比1∶4)，梯度洗脱程序为0 min 85% A，1 min 80% A，12 min 50% A，15 min 40% A，17 min 5% A(均为体积分数)。流速0.3 mL/min，进样量5 μL。
质谱条件：AJS电喷雾电离源(electrospray ionization，ESI)源，正负离子扫描模式(ESI+，ESI-)，动态多反应监测(dynamic multiple reaction monitoring，DMRM)模式，雾化器压力为45 psi，干燥气体流速为11 L/min，离子源温度为300 ℃，毛细管电压为3 500 V。各物质离子对优化后参数及其保留时间如表1所示。
表1 十四种酚酸的质谱分析条件
Table 1 MS /MS analysis conditions of 14 phenolic acids
酚酸保留时间/min离子对m/z碎裂电压/V碰撞能量/eV电离方式没食子酸0.778168.99/125∗, 168.99/79.112513,25ESI-对羟基苯甲酸0.929139.12/121∗, 139.12/95.18013, 25ESI+原儿茶酸1.210153.01/109∗, 155.01/53.21109, 21ESI-阔马酸1.228139.08/95, 139.08/51.2755,17ESI-绿原酸1.443355.01/163∗, 180.9/145.1909, 25ESI+丁香酸1.447196.99/182.1∗, 196.99/1238013, 25ESI+咖啡酸1.476179.2/135.1∗, 179.2/107.1∗11017,25ESI-鞣花酸1.848301.2/257∗, 301.22/27115525, 25ESI-香草酸1.927169.01/93.1∗, 169.01/65.2909, 25ESI+芥子酸2.126222.99/208.1∗, 222.99/149.1905, 17ESI-阿魏酸2.180192.99/134.1∗, 192.99/178.19517, 9ESI-对香豆酸2.652165.0/147∗, 165.0/91.1805, 17ESI+肉桂酸6.073149.01/131.1∗, 149.01/103.1905,17ESI+单宁酸15.282332.0/223∗, 332.0/196.112010,15ESI+
注：*定量离子对
1.3 数据分析
所有实验处理重复3次，数据使用SPSS 17 Duncan进行显著性方差分析，P<0.05 表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著差异；采用Origin 2017进行绘图分析。
2 结果与分析
2.1 十四种酚酸的超高效液相色谱-串联质谱分析
14种酚酸在液相条件下有多处出峰时间发生重合，如原儿茶酸(1.210 min)和阔马酸(1.223 min)、绿原酸(1.443 min)、丁香酸(1.447 min)和咖啡酸(1.476 min)、芥子酸(2.128 min)和阿魏酸(2.180 min)。基于质谱选择优化，这些酚酸的离子对不同，具有各自的离子通道(图1)，即使出峰时间相同也不影响各自准确定量。
2.2 可溶性游离态酚酸
如图2所示，随着甲醇或者乙醇比例(体积比)的提高，可溶性游离态香草酸、绿原酸没食子酸和丁香酸提取率呈缓慢下降趋势，其中50%甲醇对可溶性游离态绿原酸和没食子酸提取率高于其他比例溶剂，甲醇组可溶性游离态绿原酸提取量为乙醇组的近2倍，50%甲醇达到提取峰值(30.67 μg/g)；50%乙醇对可溶性游离态香草酸和丁香酸提取率高于其他比例溶剂，且不同溶剂对可溶性游离态香草酸和绿原酸提取率差异显著(P<0.05)，对可溶性游离态丁香酸提取效率差异极显著(P<0.01)；而可溶性游离态原儿茶酸则相反，随着甲醇或者乙醇比例的提高，其提取率升高，纯乙醇提取率显著高于含水乙醇和不同比例甲醇。
1-没食子酸；2-对羟基苯甲酸；3-原儿茶酸；4-阔马酸；5-绿原酸；6-丁香酸；7-咖啡酸；8-鞣花酸；9-香草酸；10-芥子酸； 11-阿魏酸；12-对香豆酸；13-肉桂酸；14-单宁酸
图1 十四种酚酸的离子通道图
Fig.1 Ion channels graphics of 14 phenolic acids
随着甲醇或乙醇比例的提高，其余9种可溶性游离态酚酸均呈现先升后降的趋势，在70%或80%达到峰值，其中80%甲醇对可溶性游离态单宁酸(22.32 μg/g)和肉桂酸提取率显著高于其他比例溶剂(P<0.01)，70%乙醇对可溶性游离态对羟基苯甲酸提取率高于其他比例溶剂(P<0.05)；甲醇组对可溶性游离态肉桂酸的提取率显著高于乙醇组(P<0.01)，对可溶性游离态芥子酸提取率略高于乙醇组，对可溶性对羟基苯甲酸提取率略低于乙醇组，而对于可溶性游离态咖啡酸、阔马酸、鞣花酸和阿魏酸提取率与乙醇组无差异(P>0.05)，不同比例的甲醇组和乙醇组溶剂对于可溶性游离态鞣花酸的提取率接近，为402.27～471.90 μg/g。鞣花酸是没食子酸的二聚衍生物，对如结肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮肤肿瘤有明显的抑制作用[24]。由于鞣花酸含量占14种酚酸里的80%左右，所以不同比例溶剂对可溶性游离态酚酸总量的提取率表现为与可溶性游离态鞣花酸趋势一致。
图2 可溶性游离态酚酸的溶剂提取率比较
Fig.2 Comparison of solvent extraction efficiency of soluble free phenolic acids
2.3 可溶性酯化态酚酸
如图3所示，除了可溶性酯化态丁香酸和绿原酸外，其余12种可溶性酯化态酚酸的提取率随着甲醇或乙醇比例的提高呈现出先升后降，其中甲醇组对可溶性酯化态对羟基苯甲酸、阿魏酸、阔马酸、肉桂酸和咖啡酸均显著高于乙醇组(P < 0.01)，80%甲醇达到提取峰值[(1.12±0.099) ～ (17.13±2.03)μg/g]；60%乙醇和70%乙醇分别对可溶性酯化态没食子酸[(496.75±39.85) μg/g]和芥子酸[(7.22±0.68) μg/g]提取率达到峰值，极显著高于其他组(P<0.01)；70%乙醇和80%乙醇分别对可溶性酯化态香草酸[(19.15±2.12) μg/g]、原儿茶酸[(49.85±5.16) μg/g]、和单宁酸[(163.00±17.08) μg/g]提取率达到峰值，显著高于其他组(P<0.05)；可溶性酯化态丁香酸和绿原酸随着甲醇比例提高先升后降，而随着乙醇比例提高则显著下降，70%甲醇和80%甲醇分别对可溶性酯化态丁香酸和绿原酸的提取率最高，为(37.02±3.91) μg/g和(273.58±30.06) μg/g。同一比例的甲醇水溶液或乙醇水溶液，对可溶性酯化态对香豆酸的提取率差异不显著(P>0.05)。
可溶性酯化态酚酸以鞣花酸、没食子酸、绿原酸和单宁酸为主(占比总和90%)，绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用[24]。单宁酸能抑制蛇毒蛋白的活性，对眼镜蛇等毒素有很强的解毒作用，能治疗肠道细菌传染病，并可抑制突变，对防止UV诱发的皮肤癌和皮肤老化有效果[24]。14种可溶性酯化态酚酸的总量提取率为80%甲醇>70%甲醇>70%乙醇>80%乙醇>90%甲醇=60%乙醇>90%乙醇=100%甲醇>50%甲醇=100%乙醇，不同溶剂差异显著(P<0.05)。
2.4 不溶性结合态酚酸
如图4所示，甲醇和乙醇比例从50%提高到80%，不溶性结合态香草酸的提取率无显著变化，比例提高到90%和100%时提取率显著上升，乙醇组提取率为甲醇组的1.5倍；而其他13种不溶性结合态酚酸随着甲醇和乙醇比例的提高，其提取率均表现为先升后降；甲醇组对不溶性结合态芥子酸和肉桂酸的提取率极显著高于乙醇组(P<0.01)，而对于不溶性结合态香草酸、原儿茶酸、咖啡酸和丁香酸提取率显著低于乙醇组(P<0.05)；甲醇组对不溶性结合态对羟基苯甲酸、阿魏酸和单宁酸的提取率显著高于乙醇组(P<0.05)，80%甲醇达到提取率峰值，分别为(9.32±0.88) μg/g、(7.99±0.55) μg/g和(121.60±10.61) μg/g。
图3 可溶性酯化态酚酸的溶剂提取率比较
Fig.3 Comparison of solvent extraction efficiency of soluble esterified phenolic acids
图4 不溶性结合态酚酸的溶剂提取率比较
Fig.4 Comparison of solvent extraction efficiency of insoluble bound phenolic acids
不同比例的甲醇提取不溶性结合态没食子酸差异不显著[(381.80±40.12) ～ (618.37±60.17)μg/g]，而70%乙醇提取率最高[(1 070.26±99.36)μg/g]，且与其他比例乙醇的提取率差异极显著(P<0.01)。没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化、抗自由基等多种生物学活性，同时具有抗肿瘤作用，可以抑制肥大细胞瘤的转移[24]。不同比例的甲醇和乙醇对不溶性结合态对香豆酸、绿原酸、鞣花酸和阔马酸的提取率差异不显著(P>0.05)。不溶性结合态酚酸以没食子酸和鞣花酸为主，占比均大于40%，故70%乙醇对14种不溶性结合态酚酸的提取率高于甲醇组和其他比例乙醇(P < 0.05)，为(2 320.34±187.53)μg/g。
3 结论
综合以上，80%甲醇和70%乙醇适合提取核桃内种皮中大部分可溶性游离态酚酸、可溶性酯化态酚酸和不溶性结合态酚酸。可溶性游离态香草酸、绿原酸、没食子酸的提取率随着甲醇或乙醇比例的提高而降低；60%甲醇可以获得较高的不溶性结合态芥子酸；乙醇组溶液尤其是50%乙醇可以提取到更多的可溶性游离态丁香酸；60%乙醇能从核桃内种皮提取到较多的可溶性酯化态没食子酸；100%乙醇有利于提取可溶性游离态原儿茶酸和不溶性结合态香草酸。不同比例的甲醇和乙醇溶液对核桃内种皮中不同形态酚酸的提取率比较，可以直接应用于核桃内种皮各种酚酸的提取、纯化，不仅有利于核桃废弃物的综合开发利用，也完善了核桃内种皮次生代谢产物研究。
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