我国从2015年开始推广大规模沼气工程，以解决农业废弃物及禽畜粪污带来的污染问题[1-2]。其中，纤维质原料来源广泛、收集、贮存便利，被很多沼气工程用作生产原料。纤维质原料主要由纤维素、半纤维素和木质素等组成，其中纤维素和半纤维素可以被微生物降解并转化为沼气。但是，纤维质原料的结构特点使其降解效率较低。为了解决这一问题，研究者开发出了多种预处理手段。其中，碱预处理被认为具有很好的应用潜力。NaOH是碱预处理中最常用、性价比最高的试剂，在多种纤维质原料的预处理中均取得了良好效果[3-4]。玉米秸秆是沼气工程最常用的原料之一。韩娅新等[5]报道，玉米秸秆中挥发性固形物比例较高，达到92.56%；其C/N比为31.88，基本处于厌氧消化的最佳C/N范围内(20～30∶1)，优于水稻秸秆的61.59和小麦秸秆的78.47。这也是沼气工程可以以玉米秸秆为唯一原料而稳定运行的原因[1]。
对于厌氧消化处理，除反应条件外，其性能主要取决于两方面因素，一是物料自身的物理化学特性，二是沼气发酵过程中的微生物菌群。研究表明，对纤维质原料进行碱预处理，可以达到解开交联、增大物料多孔性、增加比表面积、降低纤维素的聚合度和结晶度、破坏木质素结构并部分溶解木质素等目的，进而提升了纤维质底物的厌氧消化性能[5-7]。在微生物菌群方面，近年来的研究主要集中在厌氧条件(如底物浓度、温度等)及底物种类对微生物菌群的影响[8-14]。例如，蒋滔等[10]研究了玉米秸秆在固态及液态厌氧消化条件下微生物菌群的变化。青格尔等[14]研究了低温条件下，玉米秸秆降解过程中的微生物组成。DE FRANCISCI等[8]则报道了底物组成对微生物群落的影响。
目前为止，围绕预处理促进纤维质原料厌氧消化性能，以及研究厌氧消化过程中微生物群落动态变化的报道较多。但是，对比研究预处理组与对照组在菌群结构方面的差异报道较少[7]。本文重点分析了碱预处理对玉米秸秆固态厌氧消化过程中菌群变化的影响。
1 材料与方法
1.1 底物与接种物
玉米秸秆，耿忠生物技术有限公司，粉碎至40目以下；总固形物(total solids，TS)、挥发性固形物(volatile solids，VS)等组分见表1；厌氧污泥，某污水处理厂。
表1 玉米秸秆及厌氧消化污泥组分 单位：%
Table 1 Components of corn straw and AD sludge
原料TSVS/TS纤维素半纤维素酸溶性木质素酸不溶木质素玉米秸秆92.8±0.682.7±0.730.7±0.115.0±0.52.6±0.220.5±0.9厌氧污泥4.1±0.152.0±0.2未检测未检测未检测未检测
1.2 仪器与设备
SX-25-1马弗炉、101-1ES电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器有限公司；AMPTS II甲烷测定仪，瑞典碧普有限公司；BSA124S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 NaOH 预处理
用于玉米秸秆预处理的NaOH质量分数为6%(按玉米秸秆TS添加)，预处理过程含水量为90%，在30 ℃，100 r/min的条件下处理3 d。对照组不加NaOH，其余条件完全相同。
1.3.2 固态厌氧消化
处理后的玉米秸秆与污泥按质量比2.5∶1(以VS计)的比例进行混合接种，厌氧消化体系TS为15%，反应温度(35±1)℃。用500 mL血清瓶作为反应器，发酵开始前通氮气以保证厌氧环境。厌氧消化过程在AMPTS Ⅱ甲烷测定仪中进行。沼气用3 mol/L NaOH吸收二氧化碳等气体，获得的产气量即为甲烷产量。以未经NaOH预处理的玉米秸秆作为对照的原料，两组分别设置3个平行。
1.3.3 DNA提取方法
根据预实验选定取样时间，样品先用改进后的TENP buffer进行预处理[11]。具体步骤：取0.25 g样品加入到2 mL灭菌离心管，加1.5 mL TENP buffer，振荡3 min，室温下12 000 r/min离心5 min，弃去上清液。再重复上述步骤洗涤1次。接着用1 mL PBS buffer洗涤，在室温下12 000 r/min离心5 min，弃去上清液，再重复洗涤1次。然后加1 mL灭菌后的蒸馏水洗涤1次。最后用Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedicals，Shanghai，China)试剂盒，按说明书步骤提取菌群总DNA。
1.3.4 宏基因组测序
DNA 样品由诺赛基因组研究中心将检测合格的环境DNA样品经过片段化、片段筛选、建库并做相应的检测。检测合格的文库将采用Illumina Miseq/Hiseq高通量测序平台进行测序，测序得到的数据用于后期生物信息学分析。实验中对细菌及古菌均进行了测定。
1.3.5 取样点设计
根据日产气特性，将厌氧消化阶段分为产气高峰期、产气稳定期和产气末期3个阶段；对应的取样时间分别为第2、10、25天。为了更好地理解碱处理后厌氧消化过程的菌群变化，在产气高峰期增加了第1和第3天两个取样点。
2 结果与分析
2.1 NaOH预处理对玉米秸秆固态消化产气性能的影响
实验首先分析了预处理对玉米秸秆固态消化产气性能的影响。预处理后，玉米秸秆的累积甲烷产率由101.8 mL/g TS提高到149.0 mL/g TS，提高约46.3%(图1)。该现象与其他研究者得到的结果类似[5]。从整个发酵过程看，NaOH预处理组和对照组的日产气趋势十分相似，都经历3个比较明显的阶段：产气高峰期(第1阶段)、产气稳定期(第2阶段)和产气末期(第3阶段)。与对照组相比，预处理组在阶段1产气高峰的峰值更高[30.2 mL/(g TS·d)]；而且每个阶段持续的时间都更短(图2)。根据产气规律，分别选择有代表性的时间点，第1、2、3、10、25天的菌群作为研究目标。
a-对照；b-碱处理
图1 碱处理对玉米秸秆固态厌氧消化中累积 甲烷产率的影响
Fig.1 Effect of alkali treatment on the cumulative methane yield in solid-state AD of corn straw
2.2 NaOH预处理对玉米秸秆固态厌氧消化过程中菌群变化的影响
2.2.1 碱处理后厌氧消化过程中门水平菌群结构的变化
初始菌群(即接种污泥)中，变形菌门(Proteobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetes)、放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)占据较大优势，且不同门之间的相对丰度差异较小。在整个厌氧消化过程中，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和广古菌门这4个门微生物的相对丰度始终占据主导位置，且丰度明显高于其他门的微生物(图3)。
a-对照；b-碱处理
图2 碱处理对玉米秸秆固态厌氧消化中日甲烷产率的影响
Fig.2 Effect of alkali treatment on the daily methane yield in solid-state AD of corn straw
L-菌群；S-固态；A-碱处理；0、1、2、3、10、25-取样时间
图3 碱处理玉米秸秆固态厌氧消化过程中菌群 门水平的动态变化
Fig.3 Dynamic changes of microbial community during solid-state AD of alkali treated corn straw at phylum level
发酵开始后，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度急剧上升至28%和18%；从发酵第3天起，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度有一些下降，然后基本保持稳定，维持在17%左右。厚壁菌门和拟杆菌门的微生物在厌氧消化反应器中广泛存在，主要与底物水解和产酸过程相关。初始菌群中占主导地位的变形菌门和广古菌门的相对丰度呈现了相反的规律，即先下降，后上升并维持稳定。发酵进行至第2天，变形菌门和广古菌门的相对丰度分别下降至10%和5%；随后它们的相对丰度开始上升，基本达到初始菌群中的水平。
初始菌群中，其他门的微生物数量较少，并呈现出不同的规律。Chloroflexi、Aminicenantes、热袍菌门(Thermotogae)的相对丰度在整个消化过程中持续下降，并最终维持稳定，说明这些微生物不适合秸秆为底物的厌氧消化系统；Actinobacteria在消化过程中，数量波动较大；浮霉菌门(Planctomycetes)在消化过程中，数量基本维持稳定；Spirochaetes先是持续下降，但到发酵末期有1个明显上升。
2.2.2 碱处理与对照组厌氧消化菌群门水平的结构差异
实验中比较了碱处理组与对照组的微生物差异，以观察碱处理对菌群变化的影响(图4)。2个实验组微生物菌群的差异主要体现在厚壁菌门和拟杆菌门上。厚壁菌门中有许多高效纤维素降解菌属[如梭菌属(Clostridium)]，它在碱处理组LS-A-2和LS-A-10中的丰度(29%和17%)远远高于对照组的LS-2和LS-10(9%和6%)。而Bacteroidetes的情况恰恰相反，它在对照组中更活跃，在LS-2和LS-10中相对丰度分别是32%和23%，而在碱处理组LS-A-2和LS-A-10中均为18%。
L-菌群；O-原始菌群；S-固态；A-碱处理；0、2、10、25-取样时间
图4 碱处理与对照组玉米秸秆固态发酵过程中菌群 在门水平的比较
Fig.4 Comparison of microbial community structure during solid-state AD of corn straw in alkali treatment and control group at phylum level
碱处理可以改变相同底物时厌氧消化系统中微生物在门水平的分布。厚壁菌门和拟杆菌门分别是碱处理组和对照组中最具优势的微生物。对照组的微生物呈现出了更好的多样性。两组实验中，数量最多的微生物门类依次为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和广古菌门。这与其他以纤维质原料为底物(或主要底物)时的菌群结构相似[13-16]。王旭辉等[13]报道，玉米秸秆与牛粪联合厌氧消化时，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是细菌中最具优势的门类。青格尔等[14]以玉米秸秆为底物，利用不同氮源对低温高效降解复合菌系GF-20进行了驯化。经过连续培养10代发现，变形菌门和拟杆菌门的微生物最具优势。FENG等[15]报道，玉米秸秆与鸡粪联合厌氧消化时，广古菌门、拟杆菌门、厚壁菌门是优势菌群。这些研究充分说明了厌氧消化底物种类对微生物菌群结构具有显著影响。
2.2.3 碱处理后厌氧消化过程中菌群结构属水平的变化
微生物在门水平上的代谢特性差异较大，因此，在属水平上对微生物群落变化进行了分析。实验中主要鉴定出16个属的微生物，结果如图5所示。拟杆菌属(Bacteroides)、Clostridium、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Lachnoclostridium是实验条件下的主要微生物。除Methanosaeta外，其他属的微生物在消化过程中的丰度变化均十分显著(图5)。其中，Bacteroides和Clostridium在消化过程中显著增加了。
图5 碱处理玉米秸秆固态厌氧消化过程中菌群属水平的 动态变化
Fig.5 Dynamic changes of microbial community during solid-state AD of alkali treated corn straw at genus level
第1阶段，大部分属的生物量均显著增加。在第2天，Bacteroides和Clostridium的相对丰度分别从5%急剧上升到了17%和11%。Lachnoclostridium和Pseudomonas的丰度分别由0.65%和0.3%上升至2.8%和7%。Methanosaeta变化趋势较为特殊，发酵前2 d时，其相对丰度从13.5%降到8.7%，然后提升至26%。第2阶段时，厌氧消化菌群在属水平的组成结构非常接近，其中具备纤维素降解能力的微生物优势明显。例如，Bacteroides(7%～11%)、Clostridium(约4%)、Methanosaeta(22%～25%)、分支杆菌属(Mycobacterium)(约5%)和瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)(约3%)。Mycobacteria丰度变化与Methanosaeta的变化趋势高度一致。Methanosaeta在所有产甲烷菌中占绝对优势(约80%)，因此乙酸途径可能是此厌氧发酵过程中主要的产烷途径。第3阶段，微生物的总体数量下降更明显，丰度仍能保持甚至提高的菌属主要有Methanosaeta(约18%)，Clostridium(约5%)，Ruminiclostridium(约3%)和Lachnoclostridium(约2%)。除了Methanosaeta其他菌种基本都是具备纤维素降解能力的微生物。研究者对这些微生物降解纤维素的机制、关键基因识别和表达等方面，均进行了深入的研究[16-19]。
2.2.4 碱处理与对照组厌氧消化菌群属水平的结构差异
从属水平看(图6)，发酵第2天碱处理组中Clostridium、Lachnoclostridium和Cellulosilyticum等纤维素降解菌的丰度(分别为11%、3%和2%)远高于对照组LS-2(分别为2%、0.4%和0.6%)。产生这种差异的原因可能是碱处理后玉米秸秆中的纤维素更容易被纤维素降解菌降解，进而促进了纤维素降解菌的生长。第10天时，对照组与碱处理组的菌群结构差异缩小。碱处理组中，具备纤维素降解能力的微生物更具备丰度上的优势。另外，Methanosaeta的丰度在2个实验组中的差异被放大了，分别为21.7%(碱处理组)和9.4%(对照组)，这应该是由可利用底物的多寡不同引起的。第25天时，菌群结构差异进一步缩小。在这一阶段，能够利用的底物几乎被降解完全，碱处理对底物可降解性的促进作用减小。
图6 碱处理组与对照组玉米秸秆固态发酵菌群属水平比较
Fig.6 Comparison of microbial community structure during solid-state AD of corn straw in alkali treatment and control group at genus level
初始菌群中共鉴定出16个属的微生物。它们的丰度由初始的29%上升至51%～60%，在发酵末期下降至42%，但仍比初始相对丰度提高了43%。在厌氧消化过程中，Methanosaeta、Bacteroides、Clostridium均占据显著优势。两组实验中，能够利用纤维素的微生物均更具优势，碱预处理进一步强化了这些微生物的优势，这些微生物主要包括Bacteroides、Clostridium、Mycobacterium和Ruminiclostridium。
3 结论
底物种类可以显著改变菌群结构。采用玉米秸秆为底物时，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和广古菌门均是主要的微生物门类。碱预处理可以在门水平改变微生物的菌群结构。碱处理组及对照组中最具优势的微生物门类分别是厚壁菌门和拟杆菌门。从属水平上看，对照组鉴定出的各属的丰度相对较为平均，呈现出了多样性；从属水平看，碱处理后，厌氧消化过程中水解产酸菌和产甲烷菌的相对丰度都更高，包括Clostridium、Lachnoclostridium、Cellulosilyticum和Methanosaeta。甲烷菌中，Methanosaeta占据优势，这表明在本研究条件下，乙酸途径是产甲烷的主要途径。本文研究表明，在纤维质原料预处理方式选择上，不应只考虑物料本身的理化性质，更要从微生物菌群角度进行考虑。
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