香菇(Lentinus edodes)又名香覃、冬菇，分类学地位为担子菌亚门、伞菌纲、伞菌目、侧耳科，小香菇属[1-2]。我国香菇资源丰富，并且已有800多年的人工栽培历史，是世界上香菇生产第一大国[3]。随着产业化栽培技术的迅速发展，香菇已成为世界上第二大食用菌栽培品种，其独特的风味和广谱药理作用使其被大量的食用[4]。风味主要包含鲜味和香味两方面，香菇的鲜味，主要是由于存在谷氨酸，天冬氨酸和5′-核苷酸，尤其是5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP和5′-XMP等小分子物质[5]。香味则大部分由醇类、酮类、醛类、酯类、醚类、烷烃类和烯烃类等7种挥发性物质组成，其中醇类包括挥发性八碳化合物如1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等是香菇最重要的香味物质，典型的1-辛烯-3-醇具有浓郁的蘑菇特有风味[6]。醚类中含硫化合物如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚等也是香菇风味的重要组成成分，通常能影响香菇的整体风味[7]。此外，香菇的风味在感官属性和消费者接受度方面起着重要作用[8]。然而，食品中香味物质的含量非常低，一般在μg/L水平[9]，因此对分析和检测技术要求较高。顶空固相微萃取-气质联用(headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)技术是经过萃取、解析过程，再结合气相色谱-质谱联用仪，利用固相萃取吸附几何微区效应的一种提取分离检测技术，常用于检测食品香气或挥发性成分，并且在挥发性成分的分析和鉴定方面效果十分理想[10-11]。它集顶空固相微萃取、气相色谱安全、准确、分离能力强和质谱鉴定物质的优势于一体[12]。
安龙县是贵州省食用菌产业发展示范县，该县通过发展现代山地农业示范园区与易地扶贫搬迁相结合，致力于打造“中国最大优质夏菇生产基地”、“中国西南菌都”、“食用菌硅谷”和“中国香菇第一村”，以实现农村贫困人口脱贫致富。但是，安龙县食用菌产业在持续发展中存在着生产香菇品质不高等问题。培养料是生产香菇的物质基础，其对香菇的风味品质至关重要。菜籽饼营养丰富，其中粗蛋白含量较高，氨基酸组成均衡，是一种优质的植物蛋白，适量添加菜籽饼可以提高香菇的品质和产量[13-14]。本研究对添加不同含量菜籽饼的多效价复合配方栽培的香菇，采用固相微萃取法提取其子实体中挥发性物质，再用气相色谱和质谱进行风味物质分析，目的是为香菇品质的提高提供理论支持，促进该地区香菇产业链延伸和产品高质量发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选用香菇栽培种由贵州安庆菌农业科技有限公司提供。
1.2 仪器与设备
电子天平，上海菁海仪器有限公司；HP6890/5975C气相-质谱联用仪，美国Agilent公司；手动固相微萃取装置、2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头，美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 多效价复合配方香菇子实体栽培色谱条件
食用菌栽培基质最重要的2种成分为碳元素和氮元素，其中碳氮比对子实体的生长具有重要的调控作用[15]。食用菌对栽培料碳氮比的要求通常在营养生长阶段, 即菌丝体生长阶段，要求氮含量偏高, 碳氮比一般以20∶1为佳；子实体生长发育阶段，要求氮含量所占的比例偏低，碳氮比以30～40∶1较优[16]。本实验以企业常规栽培配方(木屑78%、麸皮20%、石膏1%、糖1%，质量分数)为对照，设置添加不同比例含量的菜籽饼代替麦麸栽培香菇，共设置5个配方，代替比例及各配方组成和配比见表1，每个栽培配方设3次重复，生产方法采用香菇常规生产方法。
生产流程：
备料→配料→装袋→灭菌→冷却→接种→菌丝培养→脱袋排场→转色管理→变温催菇→出菇管理→采收
表1 多效价菌棒复合配方
Table 1 Compound formulas of multi-titer fungus sticks
配方编号菜籽饼代替比例(质量分数)/%配方组成(质量分数)/%木屑麦麸菜籽饼石膏糖125781551121578173113107818211457819111527819.60.411
1.3.2 检测方法
提取方法：准确称取5 g鲜香菇丁(去除菇柄)，置于25 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在60 ℃的平板加热条件下顶空萃取60 min后，移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250 ℃)中，热解析7 min进样。
色谱条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：起始温度：38 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升温至176 ℃，以6 ℃/min升温至260 ℃；载气：He；流量：1.0 mL/min；不分流进样。
质谱条件：电子轰击离子源(electron impact，EI)；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；倍增器电压1 812 V；质量扫描范围29～500 u。
1.3.3 挥发性成分定性与定量方法
各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist 2017和Wiley275标准质谱图，对挥发性化学成分进行鉴定，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数[17]。
1.4 数据处理
所有数据均进行3次重复试验。采用Excel 2010软件对数据进行统计制表，SPSS 21.0对特征风味成分进行主成分分析和聚类分析，Origin 2018用于图形的绘制。
2 结果与分析
2.1 香菇挥发性风味成分鉴定及在不同复合配方中的差异
由图1、图2可知，通过HS-SPME-GC-MS从6种不同复合配方栽培香菇子实体中共检测出醇类、醛类、酮类、酯类、醚类、烷烃类、烯烃类等55种挥发性风味成分，其中包括13种醇类物质、13种醛类物质、5种酮类物质、5种酯类物质、4种醚类物质、10种烷烃类物质、5种烯烃类物质。不同复合配方栽培香菇子实体中相对含量最高的风味成分均为1-辛烯-3-醇，分别为52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。根据不同复合配方中对香菇风味重要的挥发性物质种类和含量相比较发现，由于菜籽饼营养丰富，适量的添加可使香菇的风味物质增加，复合配方3和复合配方4中挥发性成分均多于50种，高于常规配方的48种风味物质。其中，复合配方3栽培香菇子实体的挥发性风味成分含量最高，并且对香菇风味组成重要的醇类和醛类挥发性物质的含量也均为最高，分别为81.4%和2.2%。但菜籽饼含有硫甙、植酸等抗营养因子，且其油性较大，会影响香菇菌丝对培养基养料及水分的吸收，不利于挥发性风味成分的积累，复合配方1和复合配方2分别为40种和45种风味物质，重要的醇类和醛类物质分别为63.3%、0.9%和65.8%、1.0%，均比其他复合配方及常规配方的含量低。复合配方5与常规配方较为接近，菜籽饼代替比例仅为2%，因此2个配方所生产香菇子实体的重要的醇类和醛类挥发性物质种类和含量也较为接近，分别为47种、72.4%、1.8%和48种、72.9%、1.5%，说明菜籽饼添加量较少，对重要挥发性物质的影响也较小。
香菇的挥发性物质主要为八碳化合物和含硫化合物，其中，1-辛烯-3-醇是香菇最具代表性的八碳化合物，又称蘑菇醇；1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷，又称香菇精，是一种挥发性环状含硫化合物，香菇香味的主要呈味成分之一，香味强烈并且特征性强[18]。各配方香菇1-辛烯-3-醇的相对含量排序为：配方3>配方4>配方5>常规配方>配方2>配方1;1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷的相对含量排序为：配方2>常规配方>配方5>配方3>配方1>配方4。配方3中1-辛烯-3-醇的相对含量最高为59.1%，比常规配方提高了7.2%，但1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷的相对含量为0.6%，比常规配方降低了11.5%；配方1和配方2中1-辛烯-3-醇的相对含量分别为52.0%、53.7%，均低于其他复合配方及常规配方，然而配方2中1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷的相对含量最高为0.7%；配方4中1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷的相对含量最低为0.3%，低于常规配方的54.1%。如图3所示，综合2种挥发性物质的总含量来看，配方3挥发性物质含量相对较高，说明菜籽饼的替代比例为10%更利于香菇子实体风味物质的积累。
图1 不同复合配方栽培香菇挥发性风味成分种类及相对含量
Fig.1 Types and relative contents of volatile flavor components in Lentinus edodes cultivated with different compound formulations
图2 不同复合配方栽培香菇挥发性风味成分比较
Fig.2 Comparison of volatile flavor components of Lentinus edodes
cultivated with different compound formulas
图3 不同复合配方栽培香菇2种主要挥发性风味物质比较
Fig.3 Comparison of two main volatile flavor compounds of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas
2.2 不同复合配方香菇挥发性风味成分主成分分析
成分分析是一种多元统计技术，将原始的相关变量转化为一组新的不相关变量，其目的是在降维空间中提取最大的数据方差，主成分分析累计贡献率越大，越能反映样品的信息[19-20]。本试验以6种不同复合配方香菇的7种关键挥发性风味成分进行主成分分析，综合评价不同复合配方香菇的风味品质差异[21-23]。
2.2.1 挥发性风味成分主成分评价模型的构建
以特征值大于1为标准，对7种风味成分降维进行主成分分析，得到各主成分特征值、贡献率及累计贡献率，如表2所示。选取前3个主成分，其累计方差贡献率达89.1%(>85%)，包含了不同复合配方香菇挥发性风味成分的绝大部分信息，符合主成分分析要求[24]。结合表3主成分特征向量与荷载矩阵可得，前3个主成分中，第一主成分的方差贡献率为43.1%，决定第一主成分的主要是醇类、醛类、酯类及烷烃类物质。第二主成分的方差贡献率为24.2%，决定第二主成分的主要是醇类、醛类、酮类、醚类及烷烃类物质。第三主成分的方差贡献率为21.8%，决定第三主成分的主要是醇类、酮类、酯类、醚类、烷烃类及烯烃类物质。此外，荷载还能反映各变量与主成分间的相关系数，且绝对值数值越大，相关性越强[25-26]。由于各主成分反映的变异信息存在重合性，因此结合各主成分间的变异信息与主成分间的相关性，将7类风味物质的变异信息分为3组，第一主成分主要反映醇类及醛类物质的变异信息，第二主成分主要反映酮类、醚类及烷烃类物质的变异信息，第三主成分主要反映酯类及烯烃类物质的变异信息
表2 主成分的特征值、贡献率及累计贡献率
Table 2 Eigenvalues, contribution rates and accumulative contribution rate of principal components
主成分特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/%13.01643.09243.09221.69324.18467.27531.52821.83589.11040.5798.26897.37950.1842.6211006-1.792×10-17-2.56×10-161007-5.094×10-16-7.278×10-15100
2.2.2 基于主成分评价模型的风味品质的比较
根据表2、表3，建立复合配方栽培香菇风味品质的评价模型，得出各主成分得分与各挥发性风味成分间的线性关系式为[27-29]：
F1=0.300X1+0.274X2-0.123X3+0.208X4-0.219X5+0.187X6-0.159X7
F2=0.051X1+0.160X2+0.502X3-0.171X4+0.306X5+0.360X6-0.240X7
F3=0.228X1-0.154X2+0.182X3+0.470X4+0.225X5+0.148X6+0.502X7
表3 主成分的特征向量与载荷矩阵
Table 3 Principal component eigenvectors and loading matrix
特征风味成分第一主成分第二主成分第三主成分特征向量载荷特征向量载荷特征向量载荷醇类(X1) 0.3000.9060.0510.0870.2280.348醛类(X2) 0.2740.8260.1600.271-0.154-0.236酮类(X3) -0.123-0.3700.5020.8510.1820.278酯类(X4) 0.2080.626-0.171-0.2890.4700.719醚类(X5) -0.219-0.6620.3060.5190.2250.344烷烃类(X6)0.1870.5630.3600.6090.1480.227烯烃类(X7)-0.159-0.478-0.240-0.4060.5020.767
可以利用前3个主成分新的综合指标来替代原始的多个指标进行分析。以不同特征值的方差贡献率βi (i=1，2，…，k)为加权系数，利用综合评价函数F=β1F1+β2F2+…+βkFk，建立不同复合配方栽培香菇综合风味品质的评价模型：F=0.430 92F1+0.241 84F2+0.218 35F3。其中F1为第一主成分得分，F2为第二主成分得分，F3为第三主成分得分，得分值越高，表示该主成分对不同复合配方栽培香菇的风味贡献越大。根据不同复合配方栽培香菇的风味评价综合得分值见表4，该得分值可反映不同复合配方栽培香风味品质的差异。
表4 不同复合配方栽培香菇主成分综合得分
Table 4 Comprehensive scores of principal components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas
不同配方栽培香菇样品风味品质评价模型得分F1F2F3F排序配方118.699 8236.937 89115.830 25713.192 523 96配方218.100 27912.815 42918.652 23214.971 770 435配方321.578 56810.050 418.829 03615.840 545 271配方422.098 0239.037 68618.881 715.830 972 382配方521.756 2949.544 26418.300 5615.679 333 643常规21.866 8189.492 11618.613 04815.782 581 584
由表4可知，复合配方4栽培香菇的第一、第三主成分得分较其他复合配方和常规配方高，反映出醇类、醛类、酯类及烯烃类物质对该复合配方栽培香菇样品的风味物质贡献较大；复合配方2栽培香菇的第二主成分得分最高，充分反映出酮类、醚类及烷烃类物质对该复合配方栽培香菇样品的风味物质贡献较大。因此，复合配方4栽培香菇受醇类、醛类、酯类及烯烃类物质的影响较大，复合配方2栽培香菇受酮类、醚类及烷烃类物质的影响较大。6种不同复合配方栽培香菇风味品质从高到低综合排名依次为复合配方3(F=15.841)、复合配方4(F=15.831 0)、复合配方5(F=15.678 3)、常规配方(F=15.782 6)、复合配方2(F=14.971 8)、复合配方1(F=13.192 5)，表明在该主成分评价模型下，不同复合配方栽培香菇风味品质差异明显，且复合配方3栽培香菇风味品质最佳。
2.2 不同复合配方香菇挥发性风味成分聚类分析
聚类分析是将样品对象的集合分组为类似的对象组的多个类的分析过程。如图4所示，在欧式距离为5时，将5种复合配方和常规配方分为三类，各风味成分相对含量详见表5。复合配方1单独组成第一聚类，占总配方的16.67%，这一聚类的主要特点是风味品质适中。复合配方2单独组成第二聚类，其主要特点是酮类、醚类和烯烃类物质含量较高。复合配方3、复合配方4、复合配方5和常规配方共同组成第三聚类，占总配方的66.67%，这类群的醇类、醛类、酯类和烷烃类物质含量较高。复合配方1和复合配方2中重要挥发性物质低于其他配方，说明菜籽饼添加量过多会影响醇类和醛类等重要挥发性风味物质的积累。
图4 不同复合配方栽培香菇风味成分系统聚类分析
Fig.4 Systematic cluster analysis of the flavor components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas
表5 复合配方栽培香菇3个聚类的7种风味物质平均值
Table 5 Average values of seven flavor substances in three clusters of Lentinus edodes cultivated with compound formulas
聚类醇类醛类酮类酯类醚类烷烃类烯烃类Ⅰ63.330.935.040.031.251.870.09Ⅱ65.770.9814.830.032.772.890.09Ⅲ73.211.958.040.071.203.080.08
3 结论
本研究运用顶空固相微萃取-气质联用技术对香菇子实体风味成分进行检测，共鉴定出55种挥发性风味物质，且各配方中1-辛烯-3-醇含量均最高，分别为52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。不同比例的菜籽饼替代麸皮的多效价复合配方对栽培的香菇子实体风味成分均有影响，综合1-辛烯-3-醇和1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷的总含量来看，配方3挥发性物质含量相对较高；主成分分析选出3个代表89.1%样品信息的主成分来说明样品之间的差异，其中代替比例为10%、5%的多效价复合配方风味成分种类和含量比常规配方高；聚类分析也发现配方1和配方2中醇类、醛类、酯类和烷烃类物质低于其他复合配方和常规配方。对于替代比例仅为2%的配方5，香菇子实体的重要挥发性物质种类和含量为47种和86.3%，与常规配方的48种和86.9%相接近。综合比较后得出复合配方3整体风味品质最佳。本实验通过分析比较不同多效价复合配方和常规配方栽培香菇子实体的风味成分，为香菇栽培配方的改良和品质的提高提供理论基础，对安龙县食用菌产业的发展具有重要意义。
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