阿维菌素是目前农业应用较多的微生物源杀虫、杀螨、杀菌剂的一种,属于土壤微生物阿维链霉菌的发酵代谢产物，近年来被大量用于农产品生产中，是种植业害虫防治体系中理想的生物农药[1-4]。然而，对于阿维菌素这类高毒农药，不合理的施药行为会导致环境中的农药污染以及农产品中农药残留超标，从而影响到人们的身体健康，甚至还可能会引起食物中毒现象[5-6]。因此，我国规定阿维菌素在番茄、韭菜、结球甘蓝等蔬菜以及柑橘类等水果中的最大残留量为0.010～0.50 mg/kg[7]。
在农残检测中用于检测蔬果中阿维菌素的标准方法虽多[8-10]，但标准方法的样品前处理涉及到的步骤较为繁琐，耗时较长，当需要进行大量样品检测时，将加大检测人员的任务量，影响检测时效。根据目前研究趋势，对阿维菌素的检测方法主要有：高效液相色谱紫外检测[11-12]、高效液相色谱荧光检测[13-14]、液相色谱-串联质谱检测[15-16]。其中，紫外和荧光法检出限欠佳，前处理复杂甚至需进行衍生。质谱法分析时间长，且研究大多数围绕电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)源展开，方法检出限高但不稳定，结果易受提取样品中钠含量的影响，线性不佳，故普适性不高[17-18]。
在越来越注重食品安全的当下，农产品中农药残留的监管力度在不断加强，建立一种简便、准确、快速的检测方法，以解决日常检测多种农药残留面临的基质干扰、检测时效低等问题显得极其重要。
前处理方法中，QuEChERS法高效便捷，适合大批量样品的筛查，同时，相关研究也发现，与ESI接口相比，大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)接口的基质效应较小[19]。因此本研究将二者结合，建立了一种新的阿维菌素检测方法。方法性能测试的结果显示，该方法检测稳定性好、基质效应低、回收率精密度符合相关标准规定。因此，本方法是一种适用于日常大批量蔬果中阿维菌素快速定量检测的方法，可满足农产品质量安全的快筛监测的需要。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验室用番茄，结球甘蓝，韭菜和橙子，是经实验检测后得到的空白样品，所选的样品均经匀浆机打浆装瓶贴标签后冷冻于-18 ℃条件下，备用。
阿维菌素农药标准物质(1 000 mg/L)，天津农业部环境质量监督检验检测中心；乙酸铵、甲酸(均为优级纯)，安谱科学仪器有限公司(上海)；固体氯化钠(分析纯)，西陇化工股份有限公司；甲醇、乙腈(均为4 L容量色谱纯)，德国默克公司；实验用水为实验室自制超纯水；丙基乙二胺(primary-secondary amine，PSA)粉(100 mg)，成分为N-丙基乙二胺固相吸附剂，美国安捷伦有限公司。
1.2 仪器与设备
Triple Quad 5500型液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(软件为Analyst)，可根据检测情况替换离子源，配有APCI等2种接口装置，美国AB SCIEX公司；N-EVAP 112型氮吹仪，美国Organomation Associates公司；Elix5型纯水机，美国Millipore公司；XH-B型旋涡混合仪，康健医疗器具有限公司；TG16G型台式高速离心机，凯达科学仪器有限公司；BS200S-WEI型电子天平，德国Sartorius公司；AS30600BDT型超声波清洗机，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；聚四氟乙烯滤膜(0.22 μm孔径)、棕色液相小瓶(规格：2 mL)，安捷伦科技有限公司；HY-5型回旋式振荡器，江苏省金坛市宏华仪器厂；KS4000i型控温摇床，德国IKA公司；AUTO-HOMOGEZER型自动匀浆机，Hestix Scientific公司。
1.3 实验方法
1.3.1 溶液的配制
标准储备液(20 mg/L)：准确移取阿维菌素标准物质1.00 mL于50.00 mL的容量瓶，使用甲醇(色谱纯)定容，标准储备溶液保存于-18 ℃条件下，备用。
标准工作溶液(0.080 mg/L)：准确移取上述配制的标准储备液(20 mg/L)0.10 mL于25.00 mL容量瓶中，使用配制的甲醇-水溶液(体积比1∶1)定容至刻度线，现配现用。
阿维菌素纯溶剂标准工作曲线：使用移液管准确移取一定量的标准储备液(20 mg/L)，使用配制的甲醇-水(体积比1∶1)溶液稀释至0.012 5、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40 mg/L，放置于0～4 ℃环境下待测。
5 mmol/L乙酸铵(含体积分数为0.5%的甲酸)溶液：使用电子天平准确称取固体乙酸铵0.392 g，吸取0.50 mL甲酸溶液，加水稀释至1 000 mL刻度，经5 min超声脱气后作为样品上机时的流动相使用。
1.3.2 样品处理与净化
参照以往改良的QuEChERS法[20]，将冷冻的空白样品在常温下进行解冻后，充分搅拌均匀。使用电子天平准确称取各类果蔬样品(10±0.1) g，置于50 mL 的尖底塑料离心管中，管中添加20 mL的乙腈，设置匀浆机转速为12 000 r/min匀浆2 min后加入3 g氯化钠，充分振荡30 min，使氯化钠混合溶解。将该塑料离心管置于10 000 r/min高速离心机中离心3 min后，准确移取2 mL上清液于15 mL塑料离心管中，添加100 mg PSA粉充分混合净化1 min后，在转速为9 000 r/min的高速离心机上离心1 min。
移取上清液1 mL于氮吹仪上50 ℃条件下缓缓吹至近干，得到各类样品基质。整个实验检测过程中严格控制样品瓶保存温度为4 ℃，以此减少样品瓶中溶剂的挥发。
1.3.3 基质混合标准溶液的配制及相关标准曲线绘制
将选定的4种样品按1.3.2的方法处理后，得到4种空白基质。分别用1.3.1所配制的系列纯溶剂标准工作液定容至2.00 mL，依次配制得到0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的系列基质混合标准溶液。将以上系列基质标准溶液经孔径0.22 μm的有机滤膜过滤至2 mL容量的液相小瓶中，按照设定的仪器条件上机测定，以待测阿维菌素的峰面积作为纵坐标，选择相对应的添加浓度作为横坐标，以此绘制阿维菌素的标准曲线。
1.3.4 检测方法的稳定性
将1.3.1配制的标准工作溶液(0.080 mg/L)在APCI模式下按照标准工作液、基质标准溶液和样品的顺序进样，考虑该模式下的扫描时间，每间隔1 h对阿维菌素检测方法稳定性进行考察。
其中统计每间隔时间点连续进样2次的平均峰面积[20]，某时间段的稳定性计算如公式(1)所示：
某时间段的稳定性/%
(1)
1.3.5 方法的正确度及精密度
结合回收率研究正确度，分别将番茄、结球甘蓝、韭菜和橙子空白样品进行添加回收实验，考察检测方法的正确度和精密度。准确称取4种空白基质10 g(精确到0.001 g)至50 mL塑料离心管中，分成5个平行样，分别添加标准储备液(20 mg/L)0.050、0.100 mL，即添加水平为0.1、0.2 mg/kg，混匀后同1.3.2节方法进行样品处理后，甲醇-水(体积比1∶1)定容2.00 mL，过膜上机，计算上机所测定的加标回收数据和相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。
1.4 仪器分析条件
1.4.1 液相色谱条件
Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱温设置：40 ℃；进样量：10 μL；设定流速：0.60 mL/min；流动相管路A：水，流动相管路B：甲醇(色谱纯)；流动相梯度洗脱程序：0～1.5 min 20%B逐渐升至50%B；1.5～4.5 min 95%B；4.5～4.6 min 95%B逐渐下降至20%B；4.5～6.5 min 20%B。
1.4.2 质谱条件
离子监测模式：APCI-；气帘气：40 psi；碰撞气压力：8 psi；离子化电压：-4 500 V；源温：550 ℃；喷雾气：55 psi。
质谱检测参数详见表1。
表1 阿维菌素液质质多离子扫描检测参数(APCI)
Table 1 The LC-MS-MS multiple reaction monitoring parameters of avermectin(APCI)
分析物采集模式保留时间/min母离子子离子去簇电压DP/V碰撞能量CE/V阿维菌素[M-H]-2.34872.30 566.20*229.00-55-38;-30
注：*定量离子
2 结果与分析
2.1 方法的检测稳定性
为了确保结果的准确性，考察方法检测过程中的稳定性是确证方法的必要指标。在以往检测中，多采用甲醇、乙腈、乙腈-水和甲醇-水作为定容溶剂上机，但是研究表明，定容体系中使用甲醇-水(1∶1，体积比)时可以在长时间(11 h)的检测中展现出更高的稳定性[21]。故本文采用50%(体积分数)甲醇水进行置换溶剂再上机，以减少溶剂因素对检测稳定性的影响。
由图1可知，按1.3.1处理的阿维菌素标准工作溶液，在APCI上每隔1 h检测的前后2次峰面积的比值均在5%以下。这表明，阿维菌素在该方法上呈现出的稳定性高。
图1 APCI模式下阿维菌素检测稳定性(5 h内)
Fig.1 The stability of avermectin detection under APCI mode (in 5 h)
2.2 方法的线性方程及基质效应
本文测定过程前处理上选择采用分散固相萃取，为了避免仪器检测时引入更多基质，对样品进行稀释后上机，以降低基质带来的影响。
由表2可知,按照1.3.3方法处理，在空白基质混合标准曲线及其相应的纯溶剂标准曲线0.012 5～0.40 mg/L，4种基质添加阿维菌素质量浓度与对应的峰面积间的相关系数均在0.99以上，表现出良好的线性关系。
本文参考国内外研究中表示基质效应的方法，采用标准曲线及斜率比值法评价阿维菌素在各样品上的基质效应[22-25]。当纯溶剂标准曲线的斜率与各基质混合标准曲线的斜率比值为1.0±0.2时，表示所产生的基质效应在可接受范围内[26]。其中斜率比值越趋向1.0，表示所产生的基质效应越小；当比值大于1.0时，表示基质有增强作用；而比值小于这个范围时，则表示基质产生了抑制作用。
结果如表2所示，4种基质的基质效应在0.97～1.05，这意味着基质效应可忽略不计，同时解决了以往研究中检测阿维菌素的绝对基质效应低的问题[20]。因此，在此方法上不同的果蔬样品产生的基质效应总体较弱，影响较小，几乎可以用纯溶剂标准溶液直接进行测定。
表2 APCI上阿维菌素的线性回归方程、相关系数和基质效应(线性范围：0.012 5～0.40 mg/L)
Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and matrix effects of avermectin on APCI (0.012 5-0.40 mg/L)
分析物(离子源类型)基质线性回归方程相关系数斜率比溶剂 y=9.5×105x+7 2370.996 0-番茄 y=1.0×106x+3 8610.992 71.05阿维菌素(APCI)韭菜 y=1.0×106x+1 6400.999 31.05结球甘蓝y=1.0×106x-1 1230.997 41.05橙子 y=9.2×105x-8930.995 40.97
注：“-”表示无
2.3 四种基质在APCI中的添加回收试验
由表3可知，在0.01、0.1、0.2 mg/kg 3水平加标回收试验中，4种基质中添加的阿维菌素平均回收率均为93.3%～100.8%，得到RSD为1.8%～5.7%。通过分析各基质中阿维菌素的结果可知，该方法检测阿维菌素精密度高，回收率理想且稳定，满足阿维菌素农药残留分析测试的要求[27-28]。
3 结论
本文对测定果蔬中阿维菌素的大气压化学电离质谱法结合改良的样品前处理法(QuEChERS-LC-APCI-MS-MS)进行了可行性的研究，同时考察了检测过程中的稳定性、基质效应以及方法准确度等指标。结果表明，该方法在4种基质中添加3水平加标回收试验中，精密度高(1.8%～5.7%)，回收率稳定(93.3%～100.8%)，且5 h内检测阿维菌素标准溶液的稳定性良好(比值<5%)，以及在0.012 5～0.40 mg/L 表现出理想的线性关系(r2≥0.99)，几乎不存在基质效应(斜率比：0.97～1.05)，这意味着，在茄果、芸薹属、鳞茎和柑橘类四类农产品中阿维菌素残留检测过程中可省略相应基质配标的步骤，直接使用纯溶剂标准溶液进行定量。由于实验测算整个检测过程仅需0.48 h，还可同一时间处理多个样品进行检测。综上所述，该方法操作简便，基质影响小，方法稳定，准确快捷，不失为一种大批量农产品中阿维菌素的理想初筛方法。但是，本实验只进行了4种果蔬基质中阿维菌素的方法性能指标的研究，考虑到农产品基质类型的复杂性，本研究后续将对其他基质的结果进行验证，以考察方法的适用性范围。同时由于APCI接口有适合分析中等极性到弱极性化合物的特性，该方法能否作为多种农药的理想筛查方法还有待研究。
表3 阿维菌素在APCI中4种基质的添加回收率和RSD(n=5)
Table 3 Recoveries and RSDs of avermectin in four matrices at three spiked levels in APCI (n=5)
基质添加水平0.01 mg/kg0.1 mg/kg0.2 mg/kg回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%番茄 93.65.394.65.0100.11.8橙子 93.35.793.64.699.65.2韭菜 94.54.997.03.4100.43.2结球甘蓝95.65.0100.02.7100.84.4
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