冷却肉以其独特的风味、色泽和营养价值,已成为我国当前肉类消费的热点[1]。冷却肉的储存周期长达7～14 d,但易腐败变质,货架期短且保水性差,而由以上原因导致的巨大经济损失高达30亿元人民币。微生物腐败和脂肪/蛋白质氧化是影响冷却肉品质的主要因素,其次不饱和脂肪酸含量较高也极易发生氧化[2]。脂类在接触空气时极易被氧化,例如在加工肉制品时的切丁、烹调和储存。脂类的氧化程度与猪肉的色泽、保水性和货架期密切相关,并且决定了冷藏猪肉的感官和营养特性[3]。先前的研究发现,脂质氧化会导致肉类和肉制品产生不良的风味(酸败)、质地变化和褐色素生成,以及有毒化合物如丙二醛(malonaldehyde,MDA)和胆固醇氧化产物的形成[3]。除了脂质氧化外,蛋白质的分解还会导致大量胺的释放,加速肉类的腐败。目前,最常见的保鲜方法是将猪肉冷藏在4 ℃左右,在短时间的低温冷藏下，可以在一定程度上抑制或减少微生物(包括肉制品中的致病菌、霉菌等[4])的生长，但仍有一些耐寒细菌会继续繁殖，进而会导致冷却肉腐败变质。
为避免冷却肉腐败变质所造成的健康威胁和经济损失,具有清除自由基能力的抗氧化剂被用来防止肉品质的变质。低浓度的抗氧化剂可以延缓易氧化生物分子(如肉制品中的脂类和蛋白质)的氧化,从而提高产品的保质期[5]。目前,合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)和山梨酸钾(potassium sorbate,PS)等因其化学稳定性好、抗氧化活性强、成本低,常被作为保鲜剂应用于食品保鲜领域[6]。然而,越来越多的研究显示,化合物对人体健康可能有一定危害[7],这使得天然抗氧化剂逐渐受到人们的关注与青睐。
近年来,研究者们陆续开展了含多酚类化合物的天然抗氧化剂对各类肉制品保鲜效果的研究[8-9]。研究发现,许多植物具有抗氧化活性,包括沙棘叶(Hippophae rhamnoides)[10]、槲寄生(Viscum album L.)[11]、樱桃(Prunus cerasus)[12]、迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)[13]等。植物提取物具有良好的抗氧化性及抗菌功能,这主要是由于其具有不饱和萜烯、醇类、醛类、酸类、酚类和不饱和脂肪族等生物活性物质[14]。并且,天然生物活性物质不仅具有很强的抗菌和抗氧化活性,还具有抵抗各种人类疾病的潜力[15]。总之,与合成抗氧化剂相比,天然植物抗氧化剂可能更有利于肉类保鲜。
枇杷隶属于蔷薇科枇杷属,原产于中国中南部的寒冷山区,也常见于韩国、日本、印度的丘陵地区以及巴基斯坦的山麓地区[16]。枇杷叶已经被列入《中国药典》(2010版),在中国和其他东亚国家中其常被用来治疗感冒、咳嗽、止痰等。研究表明,枇杷叶中含有大量的黄酮类化合物和酚类物质,并且它的乙醇提取物具有较强的抗氧化活性[17]。另外,枇杷叶提取物也具有较强的抗菌能力。因此,枇杷叶提取物(Eriobotrya japonica leaves extract,EJLE)是一种安全、健康的天然抗氧化剂。
目前,关于枇杷叶提取物对冷却肉或其他肉制品的保鲜效果的研究较少。因此,本实验对冷却肉在冷藏过程中脂质氧化、微生物的数量增长等情况进行了评估,并且研究了EJLE对冷却肉菌落总数(total plate count,APC)、pH值、过氧化值(peroxide value,POV)、硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)值、总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量等指标的影响。
1 材料与设备
1.1 材料与试剂
新鲜猪肉(里脊肉),重庆市沙坪坝区“新世纪”超市,当天屠宰后冷藏(4 ℃)保持其鲜活状态,并迅速运至实验室。本研究所用枇杷叶采自重庆师范大学,用高速万能粉碎机碾碎后过30目筛,最后储存在密封聚乙烯袋中。
没食子酸、2-硫代巴比妥酸、磷酸缓冲盐水(PBS)、乙醇,生工生物工程(上海)股份有限公司;无水碳酸钠,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;氯化亚铁、甲醇,川东化工(重庆)股份有限公司;蒸馏水、超纯水,密理博(Millipore)公司。
1.2 仪器与设备
FW100型高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;H01-2数显磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;V1800型可见分光光度计,尤尼科(上海)仪器有限公司;S220-K梅特勒S220-K台式酸度计离子计,梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;Eppendorf 5430 R离心机,德国艾本德股份公司;ZXFD-A5140全自动新型鼓风干燥箱,上海智城分析仪器制造有限公司;XHF-D型高速分散器,宁波新芝生物科技股份有限公司;RE-52AA上海亚荣旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;RaedMax—1800型可见光吸收型全波长酶标仪,上海闪谱生物科技公司。
2 实验方法
2.1 枇杷叶提取物的制备
参照张慧芸等[13]的方法并稍作改进,将枇杷叶粉按1∶10(g∶mL)的比例加入V(乙醇)∶V(水)=7∶3的混合物中,在4 ℃下恒温摇床(100 r/min)24 h。接着在磁力搅拌器中搅拌15 min后用沃特曼滤纸过滤,收集滤液。使用减压旋转蒸发器(50 ℃)直至除去乙醇/水混合物后得EJLE产物,置于4 ℃冰箱保存备用。
2.2 样品(猪肉)处理
将猪肉按照文献报道的方法[18]全部切成质量不超过(10±0.2)g的小块,随机分为4组,每组3个重复,每个重复包括10块猪肉。
按照FAN等[18]方法制备4种处理试剂：(1)阴性对照(不含抗氧化剂negative control,NC);(2)山梨酸钾(PS,2 mg/g);(3)EJLE,0.5%;(4)BHA/BHT(0.01% BHA + 0.01% BHT),以上均为质量分数。将猪肉在这4种溶液中浸泡30 s后,立即取出,用半透性聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)薄膜包裹,置于4 ℃冷藏。分别在贮藏第6、9、12、15、18天时取样测定其pH值、保水性(water holding capacity,WHC)、POV、TBARS、TVB-N和微生物含量。
2.3 含量测定
2.3.1 总酚含量
EJLE中总酚含量的测定按照文献报道的方法[19],并做适当的修改。将0.1 mL EJLE与1 mL ddH2O混合后添加0.5 mL福林酚试剂,在混合液中加入1.5 mL 20% Na2CO3和6.9 mL ddH2O,混匀,40 ℃反应30 min。反应液于765 nm处测定吸光值。没食子酸生成量的标准曲线为Y=0.001 7X+0.003 1,(R2=0.998)(线性范围：60×10-6～ 1 500×10-6),总酚含量以没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)/EJLE(mg/g)表示。
2.3.2 总黄酮含量
EJLE中总黄酮含量的测定按照文献报道的方法[19],并做适当的修改。取等量EJLE与质量浓度20 g/L AlCl3反应10 min,于415 nm处测定吸光值。按照同样的方法,以芦丁浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,获得标准曲线方程为Y=0.021X+0.036 3,(R2=0.989)(线性范围：25×10-6～600×10-6)。总黄酮含量用芦丁当量(rutin equivalent,RE)/EJLE(mg/g)表示。
2.3.3 pH值和WHC
准确称取10.0 g猪肉,加入100 mL蒸馏水(pH 7.00)进行均质处理,过滤后收集滤液,使用pH计测量每个样品滤液的pH值。
准确称量1 g冷藏猪肉(n=3),使用滤纸将3份猪肉分别放入1.5 mL试管中。4 ℃下13 000 r/min离心4 min。离心后置于70 ℃干燥箱中干燥12 h。称取干燥样品的质量,保水性按公式(1)计算:
(1)
式中：WHC,保水性,%;m0,初始样品质量,g;m1,离心后样品质量,g;m2,样品干重,g。
2.3.4 POV
POV的测定参考文献[20]所报道的方法,并做适当修改。准确称取10 g猪肉样品与甲醇和氯仿以1∶2∶1(g∶mL∶mL)的比例均匀混合,使用高速分散器均质2 min。分别加入90 mL氯仿和蒸馏水,接着继续均质30 s,过沃特曼1号滤纸。1 h后收集滤液的氯仿层,减压浓缩去除溶剂。得到的浓缩液用于POV值的测量,样品POV值以meq/kg表示。
2.3.5 TBARS
TBARS值的测定按照文献[21]报道的方法,并做适当的修改。准确称取1 g绞碎均匀的猪肉样品,分别加入5 mL 0.25 mol/L HCl、5 mL TCA质量浓度150 g/L和5 mL 质量浓度3.75 g/L TBA,混匀后呈粉红色。将混合物在100 ℃水浴中旋转并加热10 min,取出冷却后加入1 mL氯仿,5 500 r/min离心25 min。取上清液在532 nm处测定其吸光值,冷却肉样品的TBARS值用MDA含量表示(mg/kg)。
2.3.6 TVB-N
TVB-N含量的测定按照文献[22]报道的方法,并做适当的修改。准确称取2 g猪肉样品在50 mL蒸馏水中均质化,随后加入0.2 g MgO和1 mL 异丙醇。使用半微量蒸馏装置进行蒸馏,0.01 mol/L HCl滴定馏出物。TVB-N含量以每100 g猪肉中含TVB-N 的毫克数表示。
2.3.7 微生物检测
微生物检测采取好氧APC,参照国际食品微生物规范委员会(International Committee for Microbiological Standards in Food,ICMSF)的规定[23]。准确称取10 g猪肉样品在90 mL 0.1%无菌蛋白胨水中均质化。对匀浆连续进行10倍稀释,每90 mL蛋白胨水中加入1 mL匀浆。在平板计数琼脂(倾注平板法)上进行适当的稀释涂布,37 ℃培养箱中培养24 h后进行APC计数。
2.4 数据统计与分析
所有实验重复3次,采用SPSS统计软件22.0进行数据统计分析,差异显著性采用单因素方差分析(one-way ANOVA analysis),实验结果以平均值±标准差表示,P<0.05表示差异显著。
3 结果与分析
3.1 EJLE总酚和总黄酮含量测定
没食子酸标准曲线用于计算EJLE的总酚含量,约为(32.5±6.21)mg GAE/g。这与早期研究的结果一致[24],该研究表明肉桂可作为天然抗氧化剂含有大量酚类物质。芦丁标准曲线用于计算EJLE的总黄酮含量,约为(24.6±2.99)mgRE/g。常见抗氧化剂,如棕榈酸、9,12-十八二烯酰氯、亚麻酸等,具有较高含量的酚类化合物和黄酮类化合物,这表明EJLE也具有较高的抗氧化性。
3.2 pH值和WHC
表1显示了用4种不同方法处理冷却肉后,在冷藏期间其pH值的变化。结果显示,对照组和处理组的初始pH值均高于6.18。对照组(NC)中,冷藏15 d后的pH值由(6.22±0.15)下降到(4.87±0.08),冷藏18 d后的pH值为(5.99±0.11)。pH值的降低(P<0.05)反映了猪肉中游离氨基酸因蛋白质分解而变质的程度,从而会导致NH3和胺、碱性化合物的形成[9]。随后pH值呈上升趋势,这与其他文献的报道相似[25]。与对照组相比,EJLE处理后的样品其pH值存在显著差异。并且添加抗氧化剂对冷却肉的pH值有一定影响(P<0.05)。
脂质氧化会促进蛋白质氧化,反之亦然[26];因此,猪肉的保水性和剪切力可能会因脂质氧化程度而变化。如表1所示,4种不同方法处理冷却肉后,在冷藏期间其保水性差异并不显著(65%～75%)。与测得的脂质氧化相比,蛋白质氧化程度并不高。而就目前的研究来看,脂质氧化代谢产生的自由基是促进蛋白质氧化的唯一因素[27-28]。因此,EJLE可以延缓猪肉冷藏过程中pH值的升高以及保水性的降低。
表1 EJLE、BHT/BHA、PS对冷却肉在4 ℃贮藏过程中pH和WHC的影响
Table 1 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on pH and WHC of chilled pork during storage at 4 ℃
保存时间/d069121518pH NC6.22±0.05aA5.93±0.10aA5.33±0.11bA5.27±0.04bA4.87±0.08cA5.99±0.11aA EJLE6.19±0.04abA6.56±0.13bB6.30±0.11abB5.91±0.10acB5.5±0.24cB6.13±0.23abA BHT/BHA6.27±0.04aA6.21±0.09aAB6.10±0.17abB5.84±0.18abB5.58±0.16bB6.25±0.11aA PS6.21±0.06abA6.17±0.11abA5.96±0.14abB5.74±0.21bcAB5.41±0.08cB6.30±0.12bAWHC/% NC65.23±0.33aA67.42±0.60abA66.25±0.63abA67.65±0.53abA66.85±0.52abA67.97±0.50bA EJLE65.49±0.48aA67.35±0.26abcB66.25±0.24abB67.92±0.52bcB59.36±1.02dB68.79±0.63cA BHT/BHA65.29±0.48aA63.25±1.09abAB61.49±0.73bcB65.29±0.57aB59.15±0.54cB62.89±1.43abA PS65.89±0.30aA61.69±0.65bA67.26±0.91acB70.36±1.50cAB67.57±0.60acB70.18±0.91acA
注：同一行内小写字母不同表示差异显著(P<0.05);同一列中大写字母不同表示差异显著(P<0.05)(下同)
3.3 抗脂肪酸氧化
POV和TBARS可以反映肉制样品中一级氧化分解产物和二级氧化分解产物的含量。表2显示了4种不同方法处理冷却肉后,在冷藏期间其POVs和TBARS值的变化。冷藏第0天,POVs和TBARS值分别为0.49 ～ 0.54 meq/kg和0.020 ～ 0.025 mg/kg。冷藏第18天(储存结束)时,POVs值为1.93～2.64 meq/kg,而TBARS值为0.604～0.932 mg/kg。POV和TBARS明显升高代表脂质氧化程度减缓,即EJLE具有较强的抗脂质抗氧化活性。
整个贮藏期间,EJLE、BHT/BHA和PS处理后的猪肉样品其POV值均低于NC,在第15天的大小顺序为NC>PS>EJLE>BHA/BHT(P<0.05)。POV值的降低表明处理后的猪肉样品其初级氧化产物较对照组少,这可能是由于EJLE中存在酚类、黄酮类等可以阻断自由基链式反应,进而阻碍猪肉样品的脂质氧化。由表2可知,与处理组相比,NC在贮藏第6天其TBARS值达到冷却肉国家标准允许的最高值,即0.225 mg/kg(P<0.05)。另外,与NC相比,EJLE、BHT/BHA和PS处理后的猪肉样品其TBARS值均有所降低(26.3%～35.2%),大小顺序为NC>EJLE>PS>BHA/BHT(P<0.05)。较高的TBARS值可能是由于水活性值较低时脂质氧化有所增加所致[29]。据报道,在TBARS值大于1 mg/kg的肉制样品中会检测到酸味[30]。一般来说,在储存期间,猪肉样品的TBARS值升高(P<0.05)意味着醛不断产生。而抗氧化剂是通过酚基提供氢来破坏自由基氧化链,进而终止自由基链式反应并形成稳定的终产物。结果与文献中所报道的一致,合成和天然抗氧化剂对控制肉制品中的脂质氧化均有一定效应[31]。MCBRIDE等[32]发现迷迭香提取物(0.1%)在降低储存牛肉样品的脂质氧化方面比BHA/BHT或VE更有效。
表2 EJLE、BHT/BHA、PS对冷却肉4 ℃贮藏过程中POV和TBARS的影响
Table 2 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on POVs and TBARS in chilled pork during storage at 4 ℃
保存时间/d069121518POVs/(meq·kg-1) NC0.53±0.11aA0.75±0.11aA1.01±0.15aA2.12±0.11bA2.37±0.16bA2.64±0.11bA EJLE0.51±0.08aA0.54±0.10aAB0.91±0.10abA1.11±0.12bB1.74±0.18cB2.32±0.11dAB BHT/BHA0.54±0.06aA0.71±0.10aA0.84±0.12aAB1.31±0.14bB1.67±0.11bcB1.93±0.07cB PS0.49±0.07aA0.45±0.07aA0.60±0.09aB1.37±0.15bB1.95±0.17cB2.17±0.15cABTBARS/(mg·kg-1) NC0.021±0.003aA0.225±0.046bA0.395±0.044cA0.559±0.032dA0.726±0.030eA0.932±0.059fA EJLE0.025±0.003aA0.163±0.012abAB0.258±0.35bcB0.393±0.044cdB0.522±0.052dB0.687±0.055eB BHT/BHA0.020±0.003aA0.126±0.029abB0.359±0.048bB0.359±0.048cB0.496±0.036dB0.604±0.020dB PS0.021±0.004aA0.140±0.025abB0.326±0.034bcB0.326±0.034cB0.522±0.051dB0.612±0.051dB
3.4 TVB-N
TVB-N是衡量肉或肉制品新鲜度的重要指标,它也被认为是细菌生长和蛋白质变质分解的重要指示信号[33]。FIELD等[34]研究发现食物中的酶和微生物可以将蛋白质分解成肽和氨基酸。肉制品中的蛋白质在贮藏过程中的分解对挥发性化合物的形成有很大影响,最终会导致TVB-N值升高。如表3所示,整个贮藏期间,EJLE、BHT/BHA和PS处理后的猪肉样品其TVB-N值均有所增加。其中,NC组的TVB-N值最高(P<0.05),BHT/BHA组的TVB-N值最低。因此,与NC相比,其货架期延长了12 d。总之,以上结果显示出EJLE可以延缓猪肉在冷藏过程中TVB-N值的升高。
表3 EJLE、BHT/BHA、PS对冷却肉4 ℃贮藏过程中挥发性盐基氮的影响 单位：mg/g
Table 3 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on TVB-N in chilled pork during storage at 4 ℃
TVB-N在4 ℃下保存的时间/d 0 6 9 12 15 18 NC15.49±0.42aA17.86±0.56abA18.86±0.74abcA19.71±1.19bcAB21.87±1.40cA22.09±0.91cA EJLE15.67±0.56aA14.72±0.65aA16.56±1.07bA17.24±0.81bA18.47±0.74bAB19.93±0.70bA BHT/BHA15.29±1.06aA14.25±0.54aB15.23±0.52aB18.45±0.63bAB19.04±0.37bC19.47±0.43bB PS15.91±0.51aA13.13±0.73aB15.33±0.39aB19.08±0.91bB19.37±0.91bBC19.77±1.00bB
3.5 抑菌试验
如表4所示,随着冷藏时间的延长,各组冷却肉样品的菌落总数均显著增加(P<0.05)。从第6天开始，在相同的冷藏时间，EJLE处理组的微生物数量增长显著低于BHT/BHA和PS对照组(P<0.05),主要是由于高温下微生物的直接破坏[34]以及微生物的代谢损伤[35]。例如,BHT/BHA和PS处理组在其初期的总平板计数显著降低(P<0.01)。冷却肉在整个贮藏期间的微生物数量呈上升趋势,这可能与pH值、TBARS值的增加有关。KEMP等[36]也发现微生物数量有类似的增长趋势。有研究发现,当新鲜水牛肉中的细菌数量超过8 lg CFU/g时就会出现腐败[37]。然而,在冷却肉的加工和储存过程中,其细菌数量约在2～5 lg CFU/g时就会检测到腐败。总之,结果表明,EJLE具有长期有效的抗菌活性。
表4 EJLE、BHT/BHA、PS对冷却肉4 ℃贮藏过程中需氧细菌总数的影响 单位：lg CFU/g
Table 4 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on TVC of chilled pork during storage at 4 ℃
细菌总数在4 ℃下保存的时间/d 0 6 9 12 15 18NC1.75±0.12aA5.64±0.05bA5.77±0.04bcA5.86±0.06bcA6.00±0.03cA6.33±0.05dAEJLE1.86±0.20aA4.00±0.11bB4.18±0.07bB4.18±0.04bB4.30±0.03bB4.37±0.03bBBHT/BHA1.99±0.16aA4.45±0.04bC4.60±0.06bC4.95±0.03cC5.19±0.05cdC5.33±0.03dCPS1.68±0.36aA4.48±0.02bC4.54±0.04bC4.78±0.03bD5.02±0.05bcD5.40±0.02cC
4 结论
本实验研究了EJLE对冷却肉在冷藏期间品质变化的影响。结果表明,EJLE含有大量的酚类化合物,具有较强的清除自由基活性。与对照组相比,经EJLE处理后的猪肉在冷藏过程中对脂质氧化具有较强的抑制作用(P<0.05)。与BHT/BHA和PS相比,EJLE对冷却肉的pH值、WHC、POV值和TBARS值均有一定抑制作用。但是,与其他处理组相比,合成抗氧化剂BHT/BHA和PS对冷却肉TVB-N值的抑制效果最好。
综合各评价指标,天然草本植物EJLE可以作为潜在的抗氧化剂,减缓冷却肉的氧化酸败,并且不会对感官特性产生任何有害影响。
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