慢性结肠炎的病因是多方面的,通常表现为反复和持续的腹痛以及血性或化脓性腹泻[1],发病早期肠上皮完整性被破坏,细菌及其产物穿过屏障渗漏,导致异常免疫反应和炎症[2]。葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的结肠炎是应用最广泛的化学诱导小鼠慢性肠道炎症模型,其操作简单,且和人类慢性结肠炎有相同的病理学[3]特性,包括结肠内膜上皮细胞的损伤,导致促炎性肠内容物扩散到潜在组织中[3-4]。近年来,研究人员发现慢性结肠炎和代谢紊乱之间存在相互作用,且它们的病理学具有共同的特征,包括代谢组织失调、炎症以及免疫反应不足[4]等。虽然目前有有效的药物来帮助控制结肠炎症状,如免疫调节剂、皮质类固醇、生物制剂和氨基水杨酸盐,但其中一些药物会导致严重的副作用[5]。因此,研究替代治疗慢性结肠炎的方法尤为重要。
根据慢性结肠炎影响肠道微生物群和结肠的方式,目前益生菌和营养干预以其安全有效性越来越受欢迎。DING等[6]研究发现,短乳杆菌可改善DSS诱导的结肠炎,适当施用可能对宿主产生有益的健康影响,有助于缓解结肠炎症状。
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) TK1501在进入人体后对机体的防御机制具有较强的耐受能力,可在人体肠道中大量存活并调节机体肠道菌群平衡,对人体的消化吸收功能有所增强。谢玉锋等[7-8]从传统发酵食品中分离筛选出L.paracasei TK1501,通过发酵豆浆验证得到产品具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用,且该菌有较强的耐受能力,可作为缓解糖尿病的食品;源于L.paracasei TK1501的β-葡萄糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷发挥了重要作用。姜岩世等[9]发现,经过灌胃副干酪乳杆菌,小鼠免疫细胞显著增殖,副干酪乳杆菌能够调节小鼠免疫力。据报道,热灭活微生物的制剂具有治疗腹泻、结肠炎、呼吸道疾病、肠道病变,以及对免疫系统的改变和改善肠道微生物群[10]的作用。经过灭活的微生物相较于活性微生物,保质期更长,且不易受温度的影响,在环境温度下便于储存和运输[11],因此热处理灭活后的益生菌具有较好的发展前景。灭活后的益生菌对宿主有益,其中热灭活的副干酪乳杆菌Lc19具有良好的润肠通便功能[12]。
红枣营养丰富,富含维生素C、B1和B2以及类黄酮。红枣不仅具有抗生育和抗糖尿病的作用[13],而且具有抗炎和止痛的特性。目前市场上所销售的红枣产品多以干制品以及粗加工为主,精加工枣产品种类较少。红枣由于含糖量较高,发酵之后不仅增加了红枣的营养价值,且口感良好,具有良好的市场前景。
本研究以DSS诱导的慢性结肠炎小鼠为模型,采用具有较强耐受能力且能够调节肠道微生态平衡的L.paracasei TK1501发酵灭活型红枣饮品,探究L.paracasei TK1501发酵的红枣饮品对结肠炎的改善作用,以期为益生菌发酵饮品治疗肠道疾病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验材料
副干酪乳杆菌TK1501(L.paracasei TK1501),保藏编号为CGMCC No.13130;宁夏同心圆枣干枣。
1.1.2 实验动物
40只SPF级健康雄性BALB/c小鼠,体质量(20±2) g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司;饲养条件：12 h光照/12 h黑夜循环,温度(22±2) ℃,湿度50%～60%,用固体普通鼠粮饲养,自由饮食饮水。实验动物获得动物实验管理委员会(IACUC-JKX-2008-1)的批准。
1.1.3 试剂及仪器
MRS培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;葡聚糖硫酸钠(MP级),百奥泰生物制药股份有限公司;甲醇(色谱纯),赛默飞世尔科技(中国)有限公司;ELISA试剂盒,南京建成生物技术有限公司;便潜血试剂盒,万马医疗器械有限公司;1500酶标仪,芬兰Thermo ELECTRON CORPORATION;Stepone Plus实时荧光定量PCR仪,ABI公司。
1.2 实验方法
1.2.1 L.paracasei TK1501枣浆发酵液的制备
料水比1∶4(g∶mL)的红枣匀浆后进行巴氏杀菌,备用。在MRS培养基中培养L.paracasei TK1501三级种子液,按体积分数为10%接种量接入红枣匀浆中,37 ℃密闭发酵24 h。发酵完成后再次进行巴氏杀菌。
1.2.2 动物分组及模型的构建
40只BALB/c小鼠适应性饲养1周后随机分组,分组采用随机数字表法,每组10只,共分为4组,分别是空白组、DSS模型组、实验组、对照实验组,具体分组如表1。
表1 实验分组
Table 1 Experimental grouping
组别饲养条件空白组正常饮水DSS模型组建模成功后正常饮水,给药期每天灌胃2 mL生理盐水实验组建模后正常饮水,给药期每天灌胃2 mL枣浆发酵饮品对照实验组建模后正常饮水,给药期每天灌胃2 mL未发酵枣浆液
本实验采用改良的自由饮用一定浓度的DSS溶液方法构建慢性UC模型。空白组小鼠实验期间均不予干预,其余3组小鼠自由饮用30 g/L的DSS溶液进行建模,每次饮用时间7 d。第8天起改为饮用蒸馏水,每次饮用蒸馏水时间7 d,以上14 d为1个周期,整个模型构建阶段共3个周期,合计42 d,实验前期适应性喂养5 d,共计47 d。最后1个周期给予相应发酵液灌胃干预,模型组用生理盐水进行对照灌胃,具体情况如表2所示。
表2 建模及给药时间表
Table 2 Modeling and dosing schedule
时间/d0～56～1213～1920～2627～3334～4041～47建模30 g/L水DSS水DSS水DSS水给药不给药给药
1.2.3 疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分的测定
实验期间每天记录小鼠体质量并观察小鼠情况和便质,化验便潜血。根据表3的评分标准进行各项评分,体质量下降率、便质、便潜血3项指标评分总和除以3即为小鼠DAI评分,参照公式(1)计算。
(1)
式中：a,体质量下降率评分;b,便质评分;c,便隐血评分。
表3 DAI评分标准
Table 3 DAI scoring standards
体质量下降率计分便质计分便潜血计分无下降0正常0阴性01%～5%1稀软便2阳性25%～10%2水样便4肉眼血便410%～15%3>15%4
1.2.4 炎症因子的测定及结肠长度测定和固定
实验终点采用眼球取血法收集血液标本,分离血清。严格按照酶联免疫吸附ELISA试剂盒说明书检测IL-4、IL-6、TNF-α、IL-1β细胞因子含量。取血后进行解剖,取出结直肠段,测量其长度,剪取0.5 cm左右的结肠组织放入40 g/L多聚甲醛中进行固定,送至津科生物科技有限公司进行切片制备。剩余结直肠冷冻备用。
1.2.5 蛋白表达量的检测
将结直肠取出,通过RT-PCR技术,检测结直肠中紧密连接蛋白ZO-1,Occludin,黏蛋白MUC2的表达量。
2 结果与分析
2.1 L.paracasei TK1501红枣发酵液对UC模型小鼠DAI评分的影响
DAI是一种用于评价小鼠疾病程度的评分,评分结果见表4。与空白组小鼠相比,经30 g/L DSS诱导的小鼠体质量显著降低,粪便为稀便或水便,粪便中的血液也肉眼可见。
表4 DAI评分记录表
Table 4 DAI score record
样品体质量下降率评分便隐血评分便质评分总DAI评分空白组0100.33DSS模型组12.642.53∗∗实验组11.921.63##对照实验组132.32.1##
注:**表示与空白组比较,P<0.01;##表示与模型组比较,P<0.01
由图1可知,DSS模型组的 DAI评分显著高于空白组(P<0.01),表明UC模型成功建立;实验组的DAI指数显著低于DSS模型组(P<0.01),对照组的DAI指数与DSS模型组无明显差异,说明副干酪TK1501发酵枣浆可以减轻结肠炎的疾病症状,对DSS诱导的结肠炎小鼠具有一定的保护作用。
BG-空白组;MG-DSS模型组;TG1-实验组;TG2-对照实验组(下同)
图1 小鼠DAI评分柱形图
Fig.1 Histogram of DAI score in mice
2.2 L.paracasei TK1501红枣发酵液对UC模型小鼠结直肠长度的影响
结肠长度与结肠炎疾病具有密切相关性,是对UC评价的重要指标之一,图2数据表明,本次试验中空白组小鼠结肠长度最长,模型组小鼠的结肠长度显著(P<0.01)短于空白组,而实验组小鼠的结肠长度显著(P<0.01)长于模型组。表明TK1501发酵的红枣浆可有效恢复由DSS诱导的UC模型小鼠结肠长度,对结肠炎症状有轻微改善作用。
图2 小鼠结肠长度柱形图
Fig.2 Histogram of colon length in mice
2.3 L.paracasei TK1501红枣发酵液对UC模型小鼠细胞因子影响
参与炎症反应的细胞炎症因子主要可分为促炎因子和抗炎因子两大类。当有炎症发生时,血液中的细胞因子会发生相应的变化,促炎因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等会大量释放,含量出现明显增加,抗炎因子白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、白介素-13(IL-13)的生成会被抑制,导致炎症加剧[14]。图3中模型组的IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著(P<0.01)高于空白组,其IL-4含量显著低于空白组。说明实验成功建立了UC模型,模型组的小鼠发生了炎症反应,实验组的IL-1β、IL-6、TNF-α显著(P<0.01)低于模型组,IL-4含量显著高于模型组。表明L.paracasei TK1501发酵的红枣浆可上调UC模型小鼠的抗炎因子,下调促炎因子,有效调节由DSS诱导的UC模型小鼠细胞因子含量,对结肠炎症状有一定改善作用。
2.4 L.paracasei TK1501红枣发酵液对UC模型小鼠结直肠蛋白表达量的影响
有研究表明,Occludin蛋白是最具有代表性的紧密连接蛋白之一,它能够封闭细胞旁路,使组织机构紧密连接。结直肠中的Occludin表达量过低容易导致肠的上皮屏障被破坏,引发一系列肠道疾病[15]。此外,肠道上皮中杯状细胞分泌的MUC-2也是屏障的重要组成部分,MUC-2是黏蛋白的一种,对肠屏障的完整性恢复肠道正常功能具有重要意义[16]。经发酵饮品干预后的UC模型小鼠蛋白表达量的结果如图4所示,模型组的Occludin、MUC-2蛋白表达量显著(P<0.01)低于空白组,说明UC模型已建立,模型组小鼠肠道中连接蛋白和黏蛋白表达量降低,出现炎症反应。实验组的Occludin、MUC-2蛋白表达量显著(P<0.01)高于模型组,表明经L.paracasei TK1501红枣发酵液干预后的UC小鼠结肠中链接蛋白和黏蛋白的表达量增加,肠道屏障功能有所恢复,结肠炎症状有效改善。
a-IL-4;b-IL-1β;c-IL-6;d-TNF-α
图3 小鼠细胞炎症因子柱形图
Fig.3 Histogram of mouse inflammatory cytokines
图4 小鼠结肠蛋白表达量柱形图
Fig.4 Histogram of protein expression in mouse colon
2.5 L.paracasei TK1501红枣发酵液对UC模型小鼠结肠组织病理影响
病理切片观察如图5所示,图5-a中杯状细胞排列紧密隐窝结构正常,无明显脱落现象和炎症细胞浸润现象;图5-b中上皮细胞有轻度的脱落现象,杯状细胞较为松散,隐窝结构轻度破坏,部分位置有少量炎症细胞浸润;图5-c中有轻度脱落现象,隐窝结构轻度破坏,无炎症细胞浸润。通过病理切片观察发现,TK1501红枣发酵液干预后的结肠炎小鼠病理切片的炎症现象有所改善,肠壁结构被破坏的现象也有所减轻。
a-空白组;b-DSS模型组;c-实验组
图5 小鼠结肠病理切片图
Fig.5 Pathological section of mouse colon
3 结论与讨论
慢性结肠炎在中国的发病率约0.12%,并且呈指数上升趋势。近些年,随着UC发病率的增加,其有效的预防和治疗已成为慢性结肠炎研究重点。由于结肠炎的病因尚不明确,所以临床上没有针对此病症的特效药。目前用于治疗慢性结肠炎的药物均有维持效果不佳的缺点,一旦患有结肠炎除手术外很难痊愈,所以肠炎患者日常的饮食应多加注意。
副干酪乳杆菌代谢过程中会分泌或释放对宿主产生有益影响的可溶性因子[17],包括胞外多糖、核糖体产生的多肽或蛋白质等具有免疫特性的物质,即后生素。在易感染患者和新生儿[18]等患者群体中,由于细菌要从肠道转移到体循环,使用活菌会出现一定的安全问题,因此人们对使用热灭活益生菌的兴趣有所增加。细菌经过热处理灭活后,作为益生菌的乳酸菌细胞表面的肽聚糖、磷酸壁、蛋白等成分对宿主具有有益作用。而且乳杆菌菌株分泌的代谢产物的有益效果更为显著,其中包括蛋白质、肽、有机酸和其他小分子,由活细菌分泌或在细菌裂解后释放到宿主环境中,并赋予宿主各种生理益处。目前关于热灭活细菌对健康有益的现有证据表明,它们可以是脆弱人群(如新生儿)活益生菌的安全替代品[19],并且在儿童和成人胃肠疾病的管理中也有作用,包括腹胀和腹泻[20]。乳杆菌属物种通过分泌聚集促因子蛋白,即胞外蛋白,使乳杆菌菌株能够在胃肠道定殖,并通过竞争排斥或与病原体共聚集来抑制病原体的黏附[21]。细菌素是一类核糖体合成的抗菌肽,具有杀菌或抑菌功能。YE等[22]报道了来自副干酪乳杆菌的细菌素具有耐高温和耐酸的特性,对于许多食源性病原体具有广谱抑制作用。
副干酪乳杆菌的代谢产物具有保护上皮屏障、抗肿瘤、免疫调节和对病原体的拮抗作用等有益功能[23],相较于菌体本身具有更长的保质期、清晰的化学结构和安全剂量参数等优势。因此,使用益生菌代谢产物可能是活菌的有效和更安全的替代物,而且显示出替代益生菌的良好潜力。目前,益生菌代谢产物在人类食品、动物饲料和制药工业中的应用越来越多,几种来源于乳酸菌代谢产物的产品可用于预防或治疗某些疾病[23]。总言之,益生菌代谢产物作为人类或动物使用的预防或治疗剂以及功能性食品或饲料添加剂具有良好的潜力。
本研究中通过L.paracasei TK1501发酵的红枣饮品具有改善结肠炎这一功能性。本研究的数据显示,经L.paracasei TK1501发酵的红枣饮品可以显著降低结肠炎小鼠的DAI,同时缓解结肠炎所造成的结肠萎缩。结肠炎模型小鼠细胞中促炎因子IL-1β、IL-6水平较高,抗炎因子IL-4水平较低,相关连接蛋白的表达量下降;L.paracasei TK1501发酵的红枣饮品的干预使促炎因子IL-1β、IL-6有所下调,抗炎因子IL-4有所上调。此外,L.paracasei TK1501发酵红枣饮品可以使结肠炎小鼠结肠中Occludin、MUC-2两种蛋白mRNA相对表达量显著升高,同时减轻结肠炎小鼠的病理学改变。这些结果表明L.paracasei TK1501发酵的红枣饮品具有改善慢性结肠炎的作用,是一款功能性饮品。此外,大量研究发现副干酪乳杆菌及其发酵产物可以调节肠道菌群,对肠道疾病有明显的改善作用[24]。L.paracasei TK1501发酵红枣饮品还可能对肠道菌群及其代谢产物的含量有所影响,如短链脂肪酸等,此项研究工作目前正在开展,以期进一步阐述L.paracasei TK1501发酵红枣饮品对结肠炎的改善作用。
本文研究结果为红枣发酵饮品的开发及营养应用提供了理论支持。红枣中含有的抗氧化活性物质对人体有益,经发酵后的饮品经过巴氏杀菌后不含活菌,可以避免活菌摄入引起肠道菌群的改变。此饮品的研发具有积极的意义和应用价值。
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