近年来水产养殖业蓬勃发展,养殖鱼类已成为全球食用鱼类的主要来源,罗非鱼是重要的世界性养殖鱼类之一[1],我国是全球主要的冻罗非鱼生产国[2],每年产生的加工副产物占原料鱼总量40%～60%[3-4],其合理利用的问题日益突出。对副产物进行高值化利用,开发多元产品,是罗非鱼产业的重要发展方向。
目前利用鱼副产物制备风味型营养食品已成为国际研究热点之一,水产调味料在保留一部分天然风味的同时富含蛋白质、矿物质以及维生素,应用前景广阔。罗非鱼加工副产物中的必需氨基酸占氨基酸总量的57.3%,组成模式符合FAO/WHO推荐的理想模式,是优良的水产调味料加工来源[5-6]。但水产调味料往往面临着风味较为单一的问题,制约着相关产品的发展。
美拉德(Maillard)反应是一种羰氨缩合的非酶褐变反应,是改善或增强食品风味的重要途径,主要是以还原糖类为主的羰基化合物和以氨基酸和蛋白质为主要类型的氨基化合物之间的复杂反应[7],一系列反应会生成包括不挥发性的香味物质前驱物,挥发性香味物质以及类黑精褐色含氮色素等复杂产物,赋予产品独特的风味和色泽[8-9]。冯婷婷等[10]采用木糖与杂色蛤蒸煮液混合进行美拉德反应,制备出一种天然海鲜调味料；王茵等[11]选用花蛤蒸煮液与木糖进行美拉德反应,得到的产物在色泽、香气上要优于使用葡萄糖、核糖。
本研究以罗非鱼熬煮液为原料,以美拉德反应的中间产物、褐变程度以及感官评分为指标,考察木糖添加量、反应时间、反应温度以及初始pH值对美拉德反应的影响,优化了美拉德增香工艺,并评价产物的氨基酸成分、挥发性成分、感官评定指标,以期为罗非鱼加工副产物高值化利用提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗非鱼购自国联水产,去除腮、内脏、尾、鳍及腹内黑膜,洗净取下鱼片后于-18 ℃保存；紫苏脱腥液(100%纯度),浙江世紫生物科技有限公司；海天牌食用白醋,广州市海珠区客村华润万家；香芹液,市售小香芹以质量比1∶2与蒸馏水榨汁破碎,浸泡30 min,沸水浴浸提30 min,趁热使用400目滤布过滤后稀释成70%的溶液；木糖、Na2HPO4(均为食品级),河南明瑞食品添加剂有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-S-3L恒温数显油浴锅,江苏科析仪器有限公司；UV2550紫外可见分光光度计、GCMS-Qp2010岛津气质联用仪,日本岛津公司；SQ510C立式压力蒸汽灭菌器,日本雅马拓公司；BS 224S电子天平,德国赛多利斯公司；EYELA N-1000旋转蒸发仪,日本东京理化器械株式会社；809 Titrando自动电位滴定仪,瑞士万通公司；DVB-pDMS65 μm固相微萃取头,美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 罗非鱼熬煮液制备
将洗净的罗非鱼加工副产物切碎后于室温下浸入复合脱腥液(紫苏液质量分数7%、香芹液70%、白醋5%,鱼肉与脱腥液料液比为1∶3[12])中60 min。沥干水分后匀浆,以料液比1∶7(g∶mL)与蒸馏水均匀混合后转入灭菌锅,根据前期实验设定熬煮时间为96 min,熬煮温度为118 ℃,熬煮结束后用200目滤布过滤,将得到的鱼汤进行真空浓缩(真空度0.95 MPa,浓缩温度65 ℃,转速100 r/min),浓缩至原有体积的20%,得到罗非鱼熬煮液。
1.3.2 美拉德反应产物制备
吸取10 mL罗非鱼熬煮液于消解管中,按比例加入木糖,调节初始pH值后密封,转入油浴锅中进行反应,反应结束后立即冰浴,降至室温后备用。
1.3.3 美拉德反应条件优化
考察木糖添加量(质量分数1%、1.5%、2%、2.5%、3%),反应时间(20、40、60、80、100 min),反应温度(110、115、120、125、130 ℃)以及初始pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8)对美拉德反应的影响,每项实验重复3次。
1.3.4 正交试验优化美拉德反应条件
在单因素试验的基础上,以感官评分为考察指标,选择木糖添加量、反应时间、反应温度、初始pH值为影响因素,设计正交试验,因素及水平如表1所示。
表1 正交因素水平表
Table 1 Orthogonal factor and level
水平因素A木糖添加量/%B反应时间/minC反应温度/℃D初始pH值11.540115622601206.532.5801257
1.3.5 低分子质量香味中间体测定
美拉德反应产物中的低分子质量香味中间体可以用280 nm处紫外吸光度表示,吸光度越大,香味物质越多[13]。将美拉德反应产物抽滤后,稀释100倍,以去离子水为参比,于280 nm处测定其吸光度。
1.3.6 褐变程度的测定
美拉德反应的最后阶段,所产生的类黑精物质不断增加,使产物颜色加深。将美拉德反应产物稀释10倍,以去离子水为参比,于420 nm处测定吸光度,作为褐变程度的指标。
1.3.7 感官评定
将美拉德反应产物稀释10倍,对待测样品进行编号,由7名感官评定员(4男、3女)组成评价小组,根据表2中的感官评定标准对样品进行打分,主要从海鲜味、色泽、外观、甜味、腥味、焦苦味6个方向进行评分,每个评定方向5分,共30分,感官评分越高则表明可接受程度越高。
表2 感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standard
评价指标分值(分)1 2 3 4 5 海鲜味无海鲜味轻微海鲜味海鲜味较淡具有一定海鲜味海鲜味浓郁色泽颜色过深,接近黑色颜色不均匀,深褐色颜色均匀,深褐色褐色浅棕色外观非常浑浊,有大量沉淀较浑浊,有部分沉淀较浑浊,有少量沉淀较浑浊,有微少沉淀澄清且无沉淀甜味甜味过重,无法下咽甜味较重较甜中等甜味鲜甜适中腥味腥味过重,无法接受腥味较重有腥味,但能接受有轻微腥味无腥味焦苦味苦味过重,不能接受苦味较重,入口不适 有苦味,但能接受有轻微苦味无苦味
1.3.8 氨基酸分析
参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》测定16种氨基酸。
1.3.9 挥发性成分分析
分别称取5 mL样液于顶空瓶中,封口后于55 ℃平衡20 min,调整好位置插入萃取头后在60 ℃下萃取30 min。
气相色谱条件：进样口温度230 ℃,解析3 min；升温条件：色谱柱初温35 ℃,保持4 min,5 ℃/min 升至90 ℃保持4 min后,再以8 ℃/min 升至230 ℃保持5 min；载气He,流量1.0 mL/L。质谱条件：离子源(EI)温度200 ℃；电子能量70 eV；扫描质量范围35～500 amu。
结果采用计算机NIST 11普库数据库进行检索,选取匹配度>80(最大值为100)的化合物,按面积归一化法进行分析,得到各挥发性成分相对含量。
1.4 数据处理
采用SPSS 22.0 软件对相关数据进行方差分析；采用Excel 2019 整理数据及绘制图表。
2 结果与分析
2.1 木糖添加量的确定
美拉德反应是羰基与氨基间反应,还原糖的添加量对美拉德反应产物的风味以及色泽起到重要影响。如图1所示,随着木糖添加量的增加,A280 nm与A420 nm也随之增加,木糖添加量达到2%之后感官评分开始下降,结果表明还原糖的添加有益于美拉德反应体系的进行,让其生成了更多的低分子质量香味中间体,但也直接导致了反应最后阶段积累了更多的类黑精物质,使褐变程度增大。过高添加量的木糖在加剧反应程度的同时,自身也较难反应完全,感官上具有较重的甜味以及轻微的焦苦味,色泽较重,因此综合考虑,确定木糖的添加量为2%。
图1 木糖添加量对美拉德反应的影响
Fig.1 Effects of xylose addition on MRPs
2.2 反应时间的确定
添加2%木糖作为美拉德反应的还原糖,在美拉德反应过程中,还原糖可产生具有甜味和焦糖味的低分子质量香味中间体,但美拉德反应时间的不同,低分子质量香味中间体生成量也随之变化。因此美拉德反应的时间对产品的最终风味有着重要影响。由图2可知,随着反应时间上升,A280 nm与A420 nm均不断增加,表明美拉德反应程度也在不断增大,当反应时间达到60 min,A280 nm几乎不再增加,可能由于长时间反应,更多的中间产物转化为了最终产物,反应产物褐变程度不断增大,色泽变深,出现明显的焦苦味,风味变差,这也与感官评分结果相吻合。因此确定60 min为反应时间。
图2 反应时间对美拉德反应的影响
Fig.2 Effect of reaction time on MRPs
2.3 反应温度的确定
反应温度对美拉德反应的影响极为明显,温度较低时,反应难以完全进行,风味不会有太大改变,但温度较高时,反应速度会急剧加快,类黑精物质快速累积,产生焦苦味,风味也被严重破坏[14]。如图3所示,反应温度为120 ℃时,A280 nm和感官评分达到最高,但当温度达到125 ℃,褐变程度急剧上升,A280 nm也开始下降,出现焦苦味,色泽呈褐色,严重影响感官评分,因此选择120 ℃较为适宜。
图3 反应温度对美拉德反应的影响
Fig.3 Effect of reaction temperature on MRPs
2.4 初始pH值的确定
初始pH值对美拉德反应体系的影响极为明显,pH较低时,氨基的分离受到影响,风味不佳；pH过高时,美拉德反应产物色泽较深,同时感官上产生焦苦味[15]。罗非鱼熬煮液的pH值为(5.5±0.1),由图4可知,随着pH值的增加,熬煮液的褐变程度增大,pH 6.0～7.5时,低分子质量的香味中间体增加,pH>7.5时,香味中间体减少,美拉德反应的感官评分呈现先上升后下降的趋势,当pH>6.5时,随着pH值增加,熬煮液出现焦糊味,并且色泽加深,使感官评分降低,初始pH值为6.5时,其感官整体接受度较高,评分最佳,表明pH值对美拉德反应产物的褐变程度影响较大。综合考虑,初始pH值选为6.5比较合适。
图4 初始pH值对美拉德反应的影响
Fig.4 Effects of initial pH value on MRPs
2.5 正交试验结果
在单因素试验的基础上,以感官评分为考察指标,选择木糖添加量、反应时间、反应温度、初始pH值为影响因素,设计正交试验,试验结果如表3所示。极差分析结果表明,各因素对美拉德反应产物的影响为：初始pH值>木糖添加量>反应时间>反应温度；感官评分结果表明,美拉德反应最佳工艺参数为A2B1C2D2,即木糖添加量2.0%,反应时间60 min,反应温度120 ℃,初始pH值6.5。在此条件下进行验证试验感官评分为(25.6±0.33),所得美拉德反应产物风味较好,具有浓郁的海鲜风味。
表3正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal test design and result
试验号因素ABCD感官评分1111120.9±0.232122221.9±0.113133320.0±0.494212323.0±0.035223120.5±0.056231222.8±0.327313223.0±0.048321321.3±0.549332120.8±0.24K120.93322.321.66720.733K222.121.23321.922.567K321.721.221.16721.433R1.1671.10.7331.834
2.6 美拉德反应对氨基酸组成的影响
氨基酸对水产调味料的风味构成起到极其重要的作用,按呈味特性可将氨基酸归纳为以下几类：鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸)、甜味氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、苦味氨基酸(缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸)[16-17]。由表4可知,反应前后减少较为明显的氨基酸有：酪氨酸(25.00%)、赖氨酸(35.48%)、精氨酸(26.67%),表明发生交联反应的苦味氨基酸大于降解生成的,致使苦味氨基酸含量减少；鲜味、甜味的氨基酸含量均有所增加：天冬氨酸(5.26%)、丝氨酸(6.67%)、胱氨酸(4.67%)、脯氨酸(9.68%)、甘氨酸(6.84%)、丙氨酸(7.50%)含量增加,说明以上氨基酸均在反应过程中对风味的形成起到了重要的作用。研究表明,甘氨酸与丙氨酸同木糖反应可以产生酱香风味,使美拉德产物的风味得到进一步提升,此外,鲜味和甜味的氨基酸含量的增长也会为其带来更高的层次性、醇厚度以及更佳的整体滋味[18]。实验结果表明,美拉德反应可以降低熬煮液中的苦味氨基酸,增加鲜味、甜味氨基酸,使熬煮液的感官评分增加,有效改善罗非鱼熬煮液的风味,使其风味更佳整体和谐。
表4 美拉德反应前后氨基酸组成的变化
Table 4 Changes of the amino acids component in the Maillard reaction products
氨基酸名称风味特征反应前/[g·(100 mL)-1]反应后/[g·(100 mL)-1]变化率/%天冬氨酸鲜/酸(+)0.380.405.26苏氨酸甜(+)0.150.15丝氨酸甜(+)0.150.166.67谷氨酸鲜/酸(+)0.630.664.76脯氨酸苦/甜/硫(-)0.310.349.68甘氨酸甜(+)0.680.736.84丙氨酸甜(+)0.400.437.50胱氨酸苦/甜/硫(-)0.010.01缬氨酸甜/苦(+)0.140.14蛋氨酸苦/甜/硫(-)0.080.08异亮氨酸苦(-)0.110.11亮氨酸苦(-)0.250.25酪氨酸苦(-)0.040.0325.00苯丙氨酸苦(-)0.140.14赖氨酸甜/苦(-)0.310.2035.48组氨酸苦(-)0.080.08精氨酸甜/苦(+)0.300.2226.67氨基酸总量4.174.14
注：表中+、-代表味道程度
2.7 美拉德反应前后挥发性物质的变化
采用GC-MS技术对罗非鱼熬煮液以及美拉德反应产物进行挥发性物质分析,总离子流程图如图5、图6所示。结果采用NIST 11普库数据库进行检索,选取匹配度>80(最大值为100)的化合物,按面积归一化法进行分析,得到各挥发性成分相对含量,详见图7及表5。美拉德反应前后均检出50种挥发性物质,前后数量虽未发生变化,但化合物种类及相对含量皆有较大的改变,使整体风味得到了一定的提升。
表5 挥发性成分分析
Table 5 Volatile components before and after Maillard reaction
序号化合物名称相对含量/%反应前反应后序号化合物名称相对含量/%反应前反应后1三甲胺35.82.17453-己酮-0.292己醛4.250.33463-羟基-2-丁酮-1.483庚醛0.33-471-羟基-2-丁酮-0.624壬醛1.340.66485-甲基-3-亚甲基二氢-2(3H)-呋喃酮-0.1655-乙基-1-环戊烯-1-甲醛0.44-491-(1(4H)-吡啶基)乙酮-0.076苯甲醛0.62-50溴代三十五烷0.870.2972,5-(三甲基硅氧基)苯甲醛0.42-51三十二烷0.87-82-甲基丁醛-6.9552三氯甲烷5.16-9丙酮醛-0.52532,6-二甲基癸烷1.73-105-甲基己醛-0.3654十甲基环五硅氧烷0.990.5611糠醛-1.04552-氯庚烷4.51-121H-吡咯-2-甲醛-0.0656十二甲基环六硅氧烷0.77-132-正戊基呋喃2.060.62575-甲基茚烷0.22-142-甲基呋喃-4.7758十六烷基环八硅氧烷0.99-152-丙酰呋喃-0.08592,3,5-三甲基癸烷-0.316吡嗪-2.22605-(2-甲基丙基)壬烷-0.29172-甲基吡嗪-23.59615-(2-甲基丙基)壬烷-0.23182,5-二甲基吡嗪-3.05623,3,5-三甲基癸烷-0.09192,6-二甲基吡嗪-14.16635-(2-甲基丙基)壬烷-0.28202,3-二甲基吡嗪-0.3164十七烷-0.05212-乙基-6-甲基吡嗪-0.6865正三十一烷-0.09222-乙基-5-甲基吡嗪-0.37662,6,11-三甲基十二烷-0.27232,3,5-三甲基吡嗪-0.55674-甲基茚烷-0.0924乙酸乙酯9.76-681,3-二烯基吡咯烷-丁烷-0.1254-异丙烯基-1-环己烯-1-苯甲酸甲酯0.23-69二甲醚5.63-26E4乙烯酯1.61-70甲苯2.11-272-溴-2-丙烯基乙酸酯0.85-71对二甲苯0.1-28环己基丙酸甲酯0.7-724-异丙基甲苯0.28-29硅烷二醇二甲酯2.82-731,2,3,4-四甲苯0.24-30辛基亚硫酸二戊酯-0.53741,2,4,5-四甲苯0.12-314-羟基磷酸苯酯-0.0375二甲基二硫0.82-323-甲氧基-L-丙醇1.83-76双戊烯0.52-33正丁醇0.16-77苯乙烯0.05-341-戊醇3.07-78环戊环庚烯0.39-35硅烷二醇二甲酯2.82-793-乙烯-1,2-二甲基-1,4-环己二烯0.06-362-噻吩甲醇0.05-803-乙酰环己烯0.15-371-甲氧基-2-丙醇-0.15812-乙基对二甲苯0.16-382-丙基-1-戊醇-0.73825-乙基间二甲基苯0.36-39糠醇-6.08833,5-二羟基甲苯0.51-403-羟基-2-丁酮1.39-84甲氧基苯基肟1.49-41羟基丙酮2.6815.01852-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙基)苯酚0.051.5742甲基庚烯酮0.96-861-甲基吡咯-0.2743丁酮-2.7887吡咯-0.3544丁二酮-1.21884-甲基茚烷-0.1889中康酸-0.17
图5 罗非鱼熬煮液挥发性成分总离子流程图
Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of tilapia-broth extraction
图6 美拉德反应产物挥发性成分总离子流程图
Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of MRPs
图7 美拉德反应前后挥发性物质种类及个数变化
Fig.7 Chemical classes and number of volatile compounds before and after Maillard reaction
羰基化合物是热加工过程中肉香成分的特征化合物,主要来源是脂类物质的热氧化降解以及氨基酸的降解[19-20],醛类物质的阈值较低,对食品的风味构成具有重要的贡献,研究表明带有6～10个碳的醛类物质对肉香味的形成起到关键作用[21]。罗非鱼熬煮液主要检测到的醛类物质有己醛(4.25%)、庚醛(0.33%)、壬醛(1.34%),反应后相对含量大幅减少,3种物质皆具有浓烈的脂肪香气,稀释后呈玫瑰及橙子的香味；另外,反应后也生成了新的醛类物质：2-甲基丁醛(6.95%),作为常用香料已广泛用于食品工业中,具有可可香气、水果香等风味,糠醛(1.04%)来源于糖类物质的降解,具有烤肉的香味。醛类物质的前后变化表明美拉德反应使熬煮液的肉香风味更加柔和、圆润,具有层次感。酮类物质具有一定的坚果香、水果香,其阈值高于醛类物质,可以使食品整体风味得到增强,醛酮类物质的交互作用在鱼、肉制品形成独特风味的过程中发挥了巨大的作用[22-23]。醇类物质同样来源于脂肪的氧化降解,阈值较高,除非以高浓度存在,否则对肉香味的形成贡献很小,但仍具有相当的协同作用[24],如反应产物中检测到的糠醇(6.08%),具有焦糖、酱香味,使特征风味进一步得到了增强。
氨基酸与还原糖在美拉德反应作用下产生呋喃、吡嗪等杂环类化合物,阈值极低,具有浓郁的坚果、烤肉等令人愉快的风味。呋喃类化合物及其衍生物对肉香的形成有较大的贡献,反应前后其总相对含量由2.06%增长至5.53%；吡嗪类物质是具有较强风味和气味的一大类物质[25],从罗非鱼熬煮液中未检出吡嗪类物质,而在美拉德反应产物中检出8种。羰-氨缩合具有pH依赖性,是吡嗪形成的先决条件,氨基在低pH体系中会质子化,不能进行亲核进攻,只有不带电的氨基能够与羰基缩合,因此酸性环境中羰-氨缩合速率较慢,难以生成吡嗪类物质[26]。罗非鱼熬煮液的pH值为(5.5±0.1),属于偏酸性环境,经工艺优化后调整至pH 6.5,实验结果与先前报道的相一致,表明反应体系初始pH值对吡嗪类物质的产生起决定性的作用。
此外,在罗非鱼熬煮液中也检测到了三甲胺(35.8 %),作为鱼腥味的标志性物质之一[27],反应过后相对含量仅为2.17 %,说明美拉德反应也具有一定的脱腥作用。酯类物质的相对含量也有所减少,主要是由于在美拉德反应的高温下其发生水解作用,对香味有一定损失,但整体风味的提升可以有效弥补酯类物质的损耗。其余所检测到的烯烃、烷烃、芳香族等化合物,阈值较高,对整体风味影响不大。
3 结论
经单因素试验及正交试验确定美拉德反应改良罗非鱼熬煮液风味的最佳工艺条件为：木糖添加量2.0%,反应时间60 min,反应温度120 ℃,初始pH值6.5,在此条件下进行验证试验所得感官评分为(25.6±0.33)；氨基酸分析结果表明,美拉德反应前后酪氨酸(25.00%)、赖氨酸(35.48%)、精氨酸(26.67%)等苦味氨基酸含量减少,天冬氨酸(5.26%)、丝氨酸(6.67%)、胱氨酸(4.67%)、脯氨酸(9.68%)、甘氨酸(6.84%)、丙氨酸(7.50%)等鲜味、甜味的氨基酸含量均有所增加,说明以上氨基酸均在反应过程中对风味的形成起到了重要的作用。挥发性物质分析表明,美拉德反应前后风味物质种类及数量均有所变化：醛类、醇类物质总相对含量减少,酮类物质有所增加,美拉德反应使羰基化合物间协同作用增强,形成更佳和谐、整体的风味,呋喃类、吡嗪类等杂环类化合物相对含量升高,进一步强化了特征风味。以上结果表明,美拉德反应大幅改善了罗非鱼熬煮液原本单一的风味,在感官上带来了浓郁的海鲜风味,此工艺具备开发天然水产调味料的相关条件,可为罗非鱼加工业及调味品制造业提供一定的理论参考。
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