鱼分离蛋白(fish protein isolates,FPI)是通过蛋白等电点絮凝原理制备而得,该制备原理是先将肌肉蛋白溶于极性酸碱环境中,再调节溶液pH至等电点使蛋白质沉淀,从而获得分离蛋白。在极性酸碱条件下蛋白质变性带有大量同种电荷,从而增加静电排斥,提高蛋白质亲水性可使之溶于极性酸碱溶液中[1]；当pH为5.0～6.0时,蛋白质的同种电荷消失,疏水性增强,从而发生聚沉[2]。分离蛋白具有回收率高、消化率高[3]、蛋白含量高[4]、脂肪含量低[5]、腥味小、白度大以及凝胶特性优良等优点[6]。与漂洗鱼糜相似之处是呈味物质(游离氨基酸、呈味核苷酸、水溶性无机离子等)大多为水溶性,会在漂洗或pH变换过程中流失,造成滋味品质的降低。与漂洗鱼糜不同的是,分离蛋白制备过程中会引入大量的NaCl,Na+和Cl-对水产食品的滋味特性影响较大[7],FPI中Na+的增多会使鱼糜特有的滋味特性改变。因此本研究通过测定蓝点马鲛鱼漂洗鱼糜和酸、碱分离蛋白呈味物质变化,探讨漂洗法、pH变换法对鱼蛋白滋味特性的影响,为分离蛋白滋味改良提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
蓝点马鲛鱼,购于上海市临港新城芦潮港海鲜市场,规格：体长(51.39±1.68)cm、质量(683.75±116.62)g,冰鲜运输至实验室后立刻去头、内脏和鳍,采肉后于-40 ℃冷藏备用。
1.2 主要仪器及设备
均质机,海标本模型厂；冷冻离心机,湖南湘仪有限公司；L-8800氨基酸全自动分析仪,日本Hitachi公司；W2690/5高效液相色谱仪,美国Waters公司；ASTREE电子舌,法国Alpha MOS公司；ZEEnit 700石墨炉原子吸收光谱仪,德国耶拿公司。
1.3 实验方法
1.3.1 蓝点马鲛鱼蛋白的溶解和回收
以鱼肉∶预冷去离子水=1∶9(g∶mL),混合均质2 min,匀浆体积记为V,用考马斯亮蓝测得总蛋白浓度为C,然后用1 mol/L HCl溶液或NaOH溶液调节pH至 1.5～13.0(pH相差0.5为1个梯度),离心(4 ℃、12 000×g、20 min),收集上清液并记录体积V1,蛋白浓度为C1,上清液分别用1 mol/L NaOH溶液或 HCl溶液调节pH至等电点(5.0、5.5、6.0),离心(4 ℃、12 000×g、20 min),收集上清液并记录体积V2,蛋白浓度为C2。溶解度、回收率计算分别如公式(1)、公式(2)所示：
蛋白质溶解度
(1)
蛋白质回收率
(2)
1.3.2 分离蛋白的制备
参照刘诗长等[8]的方法并修改,称取2份碎鱼肉60.0 g,分别与4 ℃超纯水按照料液比1∶9(g∶mL)混合,均质2 min,4 ℃静置15 min,单层纱布过滤以去掉筋膜等肌基质蛋白,1份用2 mol/L HCl溶液调节pH至2.5,另1份用2 mol/L NaOH溶液调节pH至12.5,离心(4 ℃、12 000×g、15 min),收集上清液,分别用2 mol/L HCl溶液或NaOH溶液调节上清液pH至5.5,离心(4 ℃、9 000×g、15 min),收集沉淀,再用0.5 mol/L NaOH溶液调节沉淀pH至7.0,离心(4 ℃、12 000×g、15 min),收集沉淀便得到酸碱分离蛋白。
1.3.3 漂洗鱼糜的制备
参照袁凯等[9]的方法略加修改。称取一定量的碎鱼肉,与4 ℃超纯水按照料液比1∶4(g∶mL)混合,恒温水浴槽中搅拌4 min,静置8 min,双层纱布过滤,漂洗2次,与分离蛋白在相同条件下脱水,取沉淀。
1.3.4 感官评价
参照WHITE等[10]的方法,4种样品分别称取40.0 g在隔水蒸制10 min后,选取8名感官员采用直线评估法对4种样品的鲜、甜、苦、咸、酸进行5点强度打分。5点强度分别是没感觉(0分)、弱(1分)、稍弱(2分)、中等(3分)、稍强(4分)、强(5分)。
1.3.5 电子舌检测
4种样品在隔水蒸制10 min后,分别称取2 g加25 mL 超纯水,均质2 min后超声5 min,静置30 min,冷冻离心(4 ℃,10 000×g,15 min)取上清液,沉淀重复上述操作,合并2次上清液后过滤,并定容至250 mL,将滤液倒入电子舌专用进样杯中在室温条件下进行测定,每个样品重复测定7次。
1.3.6 游离氨基酸测定
参考付娜等[11]的方法,称取0.5 g(精确到0.000 1 g)样品,用5%的三氯乙酸进行前处理后,用0.22 μm的水相滤膜过滤至进样瓶中,在全自动氨基酸分析仪中测定游离氨基酸。
1.3.7 5′-核苷酸的测定
参考邱伟强等[12]的方法,略有修改。
HPLC参数：ODS-3/C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱温30 ℃,流速1 mL/min,进样量10 μL,紫外检测器检测波长245 nm。
流动相A为CH4O溶液,B为20 mmol/L磷酸二氢钾与20 mmol/L磷酸氢二钾溶液,并用磷酸调节pH至5.75。梯度洗脱程序如下：0.00～6.00 min(100% 流动相B)；6.01～15.00 min(2%流动相A，98% 流动相B)；15.01～20.00 min(8%流动相A，92% 流动相B)；20.01～22.00 min(35%流动相A，65% 流动相B)；22.01～24.00 min(30%流动相A，70% 流动相B)；24.01～30.00 min(100% 流动相B)。
1.3.8 水溶性无机离子的测定
钾、钠的测定按照GB 5009.91—2017;钙的测定按照GB 5009.92—2016;镁的测定按照GB 5009.241—2017；锌的测定按照GB 5009.14—2017；铁的测定按照GB 5009.90—2016,检测4种样品中的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+浓度。
1.3.9 味道强度值及味精当量(equivalent umami concentration,EUC)
滋味物质的味道强度值(taste activity value,TAV)的计算如公式(3)所示：
(3)
式中：TAV,味道强度值；C,滋味物质的绝对浓度；T,滋味物质的阈值。
味精当量的计算如公式(4)所示：
(4)
式中：EUC,味精当量,g MSG/100 g；ai,鲜味氨基酸(Asp、Glu)的含量,g/100 g；bi,鲜味氨基酸相对于MSG的相对鲜度系数(Glu为1、Asp为0.077)；aj,呈味核普酸(IMP、AMP)的含量,g/100 g；bj,呈味核普酸相对于IMP的相对鲜度系数(IMP为1、AMP为0.18)；1 218,协同作用系数。
1.3.10 数据分析
数据由 Excel、SPSS 20.0 进行分析,结果以平均值±标准偏差(mean±SD,n=3)表示；主成分分析由Alpha Soft 14.0 进行分析。
2 结果与分析
2.1 蓝点马鲛鱼蛋白的溶解和回收
蓝点马鲛鱼蛋白的溶解度变化规律如图1-a所示,pH在1.5～13.0,溶解度曲线呈U字形,这与鳙鱼[13]、蓝圆鲹[14]、鲤鱼[5]等研究结果一致。在pH 2.0～3.0或12.0～13.0,蓝点马鲛鱼肉蛋白溶解度较大,由于在极端酸碱条件下,蛋白质分子带同种电荷,与水分子结合,具有强烈的静电排斥,溶解度相对较高；在pH 5.0～6.5,蓝点马鲛鱼肉蛋白的溶解度较低,可能是由于蛋白质等电点在pH 5.0～6.5,溶液中蛋白质净电荷为零,缺少静电排斥,蛋白溶解度相对较低[15]。
a-鱼肉在不同pH值下的蛋白溶解度；b-不同pH溶解后在等电点pH为5.5沉淀的蛋白回收率；c-在等电点pH 5.0、5.5、6.0沉淀的蛋白回收率
图1 蛋白的溶解度和回收率
Fig.1 Protein solubility and recovery
因此选择在溶解度较高的溶解pH(1.5、2.0、2.5、12.0、12.5、13.0),溶解度较低的沉淀pH(5.0、5.5、6.0)下,分别通过pH变换法收集蓝点马鲛鱼分离蛋白,结果如图1-b所示,极性酸碱环境除溶解pH为1.5外,其他溶解pH在沉淀pH为(5.0、5.5、6.0)下,回收率都较大,并且相同溶解pH的回收率在沉淀pH为5.5时均高于其他2个沉淀pH,但没有显著性差异(P>0.05),由此推断蓝点马鲛鱼肉蛋白的等电点在5.5附近；在极端酸性条件下,蛋白质分子会完全解离,在碱性条件下变性程度小,可能会造成极端碱溶条件下蛋白的回收率会高于极端酸溶条件[16]；同时发现回收率与溶解度呈现正相关,即溶解度越大,回收率越大。
因此选择沉淀pH为5.5,在溶解pH为1.5～13.0下,测定最高回收率下的溶解pH,结果如图1-c所示,在沉淀pH为5.5时,碱性溶解pH为12.5与溶解pH为13.0的蛋白回收率最高,但无显著差异,因此选择溶解pH为12.5,沉淀pH 5.5,制备碱分离蛋白；在沉淀pH为5.5时,酸溶解pH为2.5的蛋白回收率最高,因此选择溶解pH为2.5,沉淀pH为5.5,制备酸分离蛋白。
2.2 感官评价
感官评价结果见图2。结果表明,pH变换和漂洗法可使蓝点马鲛鱼的鲜、甜、苦、咸味降低。碱分离蛋白与其他2组样品相比,能够较好地保留甜味和鲜味。咸味结果显示,pH变换法与漂洗法相比,可有效降低样品的咸味。总体看来,漂洗鱼糜与分离蛋白的滋味都变差,但碱分离蛋白能够保留原料肉部分甜味与鲜味。
图2 四种样品的滋味感官图
Fig.2 Taste profiles of four kinds of samples
2.3 电子舌分析
主成分分析(principal component analysis,PCA)是通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量,按需选取几个综合指标,对研究对象进行简化和综合评价的一种多元统计分析方法。PCA图显示(图3),Discrimination index=82,说明电子舌可完全分开4种样品。PC1贡献率为62.538%、PC2贡献率为32.615%,主成分累计贡献率达到95.15%。说明主成分PC1、PC2包含了大量原始数据中的信息,因而该图能够有效反映4种样品的滋味轮廓差异。从图3可以看出,4种样品在PCA图中分布呈现一定的规律,与原料肉的二维截距大小依次为漂洗鱼糜>碱分离蛋白>酸分离蛋白,由此可得,经过漂洗和pH变换法均可使原料肉的滋味发生改变,且不同方法对原料肉滋味的影响程度不同,与漂洗相比,pH变换法可能会较好地保存原料肉部分滋味特征,进而需要通过游离氨基酸、呈味核苷酸进行定量分析。
图3 电子舌主成分分析图
Fig.3 Principal component analysis plot for electronic tongue data of four samples
2.4 水溶性无机离子分析
无机离子在水产品中的滋味中起到呈味辅助剂和鲜味增强剂的作用,尤其是正离子(Na+、K+)属于定位基并且易被味觉感受器吸附而呈现出咸味,对食品的滋味形成有关键的辅助作用[17-18]。原料肉中Na+、K+、Mg2+的TAV都大于1,说明这3种无机离子对蓝点马鲛鱼肉的滋味贡献较大。图4显示,经过漂洗和pH变换法处理后,漂洗鱼糜和酸碱分离蛋白中各无机离子都有不同程度的降低,K+降低程度最为显著,其中只有酸分离蛋白中Na+超过阈值,可能由于在调节pH的过程中会引入NaCl,造成Na+残留,说明这2种方法均可降低原料肉中的盐度,这与感官评价结果一致。但微量元素Fe3+、Zn2+的降低程度远小于K+和Mg2+,说明漂洗和pH变换法可在一定程度上保留部分微量元素,与总氨基酸一致,不会造成营养过多的损失[19]。无机离子含量的改变会造成滋味的差异,漂洗鱼糜和酸碱分离蛋白可能会因为Na+、K+的缺失造成咸味、鲜味的降低。
图4 四种样品的水溶性无机离子含量
Fig.4 Comparison of inorganic ion contents in four samples
2.5 游离氨基酸分析
游离氨基酸是食品中主要呈味物质之一,主要呈现鲜、甜、苦这3种味道,其种类和含量的不同会造成食品滋味的不同,且各游离氨基酸不仅有固有的呈味效果,还会与食品中其他物质发生协同作用呈现出不同的滋味[20]。
由表1可知,4种样品游离氨基酸总量由大到小依次为原料肉(319.01 mg/100 g)>碱分离蛋白(165.91 mg/100 g)>漂洗鱼糜(160.27 mg/100 g)>酸分离蛋白(151.61 mg/100 g),可能由于漂洗和pH变换法都经过水洗的过程,造成水溶性的呈味游离氨基酸溶解到溶液中,造成游离氨基酸减少。
表1 四种样品中游离氨基酸含量及TAV 单位：mg/100 g
Table 1 Free amino acid content and TAV in four samples
滋味特征氨基酸阈值原料肉漂洗鱼糜酸分离蛋白碱分离蛋白含量TAV含量TAV含量TAV含量TAV鲜天冬氨酸Asp1004.60±0.05c0.0500.59±0.02a0.0100.72±0.03a0.0103.01±1.31b0.030谷氨酸Glu3035.70±0.23c1.1902.70±0.23a0.0903.30±0.21a0.11010.44±0.83b0.340甜苏氨酸Thr26010.43±0.23d0.0400.29±0.03a0.0011.45±0.14b0.0103.49±1.41c0.010丝氨酸Ser1507.90±0.08c0.0500.39±0.01a0.0034.40±0.27b0.0293.60±1.30b0.020甘氨酸Gly13014.79±0.98b0.1102.59±0.12a0.0202.22±0.14a0.01722.71±2.62c0.170丙氨酸Ala6022.21±0.13c0.37011.84±3.78b0.1906.94±0.25a0.11010.47±0.27b0.170缬氨酸Val4013.65±0.12d0.3400.30±0.02b0.0100.11±0.01a0.0030.59±0.03c0.010甜/苦蛋氨酸Met308.29±1.47b0.27012.44±3.19c0.41011.15±1.56c0.3706.89±1.92a0.220赖氨酸Lys5021.53±3.35c0.4306.39±0.62a0.12013.93±2.34b0.27010.81±2.39b0.210精氨酸Arg5034.69±4.97c0.69028.78±4.04b0.57017.77±3.01a0.35028.02±0.79b0.560苦异亮氨酸Ile9018.02±1.05d0.2000.31±0.01b0.0030.23±0.02a0.0033.52±0.22c0.040亮氨酸Leu19018.98±1.24ab0.09012.39±3.77a0.0605.93±0.580.03022.26±2.98b0.110酪氨酸Tyr-25.30±3.14-N.D.-N.D.-N.D.苯丙氨酸Phe9029.40±3.34a0.32088.62±6.62b0.98094.98±7.29b1.05022.25±2.08a0.240组氨酸His2053.61±8.14d2.6801.83±0.36a0.9204.62±1.00b0.23022.16±3.38c1.110氨基酸总量319.01±28.52160.27±24.03151.61±15.59165.91±21.27
注：-表示无相应数值;N.D.表示未检出;同一行不同字母表示组间有显著性差异(P<0.05)(下同)
由图5可知,原料肉经过漂洗或pH变换法处理,呈鲜、甜、甜/苦、苦味游离氨基酸总量都显著降低(P<0.05)。但其中碱分离蛋白呈鲜、甜味游离氨基酸总量都显著大于漂洗鱼糜与酸分离蛋白(P<0.05),甜/苦味的游离氨基酸总量与漂洗鱼糜和酸分离蛋白无显著性差异,但其呈苦味游离氨基酸总量显著小于漂洗鱼糜与酸分离蛋白(P<0.05),因此,碱分离蛋白的滋味会优于漂洗鱼糜与酸分离蛋白。
图5 四种样品中游离氨基酸含量
Fig.5 Free amino acid content in four samples
原料肉中Glu的TAV>1,对原料肉的滋味贡献较大,而漂洗鱼糜、酸分离蛋白、碱分离蛋白分别降低了91.83%、90.02%、66.62%,由此可知,这2种方法都降低了原料的鲜味,与漂洗鱼糜和酸分离蛋白相比,碱分离蛋白的鲜味较强,这与感官评价结果一致；Gly和Ala为水产品中主要的呈甜味氨基酸,原料肉中Gly含量较少,且Gly阈值较高,因此Ala为蓝点马鲛鱼呈甜味的主要物质,经过漂洗和pH变换法处理后,漂洗鱼糜、酸分离蛋白、碱分离蛋白中Ala分别降低了46.69%，68.75%，52.85%，降低程度远小于Glu，由此可得,漂洗和pH变换法可有限的保留原料肉的甜味；呈甜/苦味氨基酸,在经过漂洗和pH变换法处理后,均有不同程度的降低,且原料肉中呈苦味氨基酸Tyr在其他3种样品中并未检测出,可能因为低于检测限,但是Phe在酸分离蛋白和漂洗鱼糜中含量增高,可能是由于蛋白质变性使得Phe堆积,从而会造成苦味增加[21-22]。呈苦味氨基酸His阈值较低,为样品中主要呈苦味物质,含量分析显示,漂洗鱼糜和酸碱分离蛋白中该物质均显著降低(P<0.05)。综上,漂洗鱼糜和酸碱分离蛋白,鲜味、甜味、苦味都有所降低,但碱分离蛋白与漂洗鱼糜和酸分离蛋白相比,能够较好地保留一部分鲜、甜味,较大程度地降低苦味。
2.6 核苷酸分析
核苷酸及其降解产物在水产品中是对滋味贡献较大的呈鲜味物质之一,并且与呈味氨基酸有协同作用,主要包括4种核苷酸(5′-AMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP)[23],有较多研究表明5′-GMP在鱼类中含量较少[24],5′-XMP由5′-IMP在鱼体死后发生氧化反应产生,本实验在低温条件下取肉后立即处理,并未产生大量5′-XMP,因此对5′-GMP、5′-XMP不做研究,BREMNER等[25]研究表明次黄嘌呤(hypoxanthine,HX)会呈现苦味,造成滋味变差,因此通过5′-AMP、5′-IMP、HX含量的变化,研究原料肉、漂洗鱼糜和分离蛋白的滋味差异。
表2显示,在经过漂洗和pH变换法处理原料肉后,5′-AMP、5′-IMP、HX都有不同程度的降低,由此可得,与原料肉相比,漂洗鱼糜和酸碱分离蛋白的鲜味有不同程度的降低,只在碱分离蛋白中保留较多的5′-AMP和HX,施文正等[26]研究表明,当IMP与AMP低含量共存时,依旧可以呈现出鲜味,并且甜味增加,因此碱分离蛋白能够呈现出一定量的鲜味和甜味。YAMAGUCHI等[27]提出5′-核苷酸会与呈鲜味游离氨基酸(Glu、Asp)产生协同作用,即使含量非常低的5′-IMP也可极大的提高氨基酸的呈鲜味效果,并且会增加甜味效果,因此利用EUC值对该协同效应进行评价,如表2所示,碱分离蛋白的EUC值是漂洗鱼糜和酸分离蛋白的5倍左右,综上,漂洗鱼糜和酸碱分离蛋白,鲜味都有所降低,与游离氨基酸结果显示一致,但碱分离蛋白能够较好地保留一部分鲜味。
表2 呈味核苷酸含量及EUC值
Table 2 Taste nucleotide content and EUC value
核苷酸阈值原料肉漂洗鱼糜酸分离蛋白碱分离蛋白5′-AMP/[mg·(100 g)-1]5011.82±2.69c0.33±0.01a0.71±0.01a4.64±1.07b5′-IMP/[mg·(100 g)-1]255.46±0.62b0.20±0.01a0.75±0.01a0.42±0.02aHX/[mg·(100 g)-1]-57.45±2.97c0.14±0.01a0.18±0.03a6.21±0.84bEUC/[g MSG·(100 g)-1]0.3700.0040.0070.023
3 结论
根据实验结果,可以得到以下结论：电子舌能够有效区分4种样品,漂洗和pH变换法都可造成蓝点马鲛鱼肉滋味轮廓发生改变,但酸分离蛋白与碱分离蛋白较为相似；漂洗鱼糜与pH变换法均可降低盐度,而且还可以在一定程度上保留一部分微量元素,但会因Na+、K+的缺失造成咸味、鲜味的降低；漂洗和pH变换法都会造成蓝点马鲛鱼呈味氨基酸、呈味核苷酸不同程度的流失,造成滋味变差,但与漂洗鱼糜和酸分离蛋白相比,碱分离蛋白能够较大程度地保留部分呈味物质。综合可知,漂洗和pH变换法都造成呈味物质的损失,同时也降低了原料肉中的盐度,其中碱分离蛋白能够在降低盐度的同时较多地保留部分呈味物质,可利用碱分离蛋白的方法制备低盐的蛋白配料,并为分离蛋白滋味改良提供理论基础。
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