海参属棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothurian),是一种重要的海洋无脊椎生物[1-2]。海参加工过程中会产生大量副产物如海参肠、海参卵等,此类副产物的营养价值极高,富含人体所需的蛋白质、多不饱和脂肪酸、微量元素等,具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、提高免疫力等功效[3],如直接丢弃会造成资源浪费和环境污染[4-5]。研究表明,酶解是一种可高效利用海参肠卵中营养成分的方法,得到易于吸收、具有保健及药用功能的蛋白多肽水解物,创造显著的经济和社会效益[5-7]。然而,海参肠卵经酶解后会产生一些醛类、醇类、酮类和烃类物质,使水解液具有较重腥味,难以加工利用[8-10],因此脱除腥味是实现海参肠卵酶解液高值化利用及产业化发展的技术关键。
近年来国内外对脱腥的研究有很多,主要脱腥方法有物理法(水洗、吸附、微胶囊脱腥、包埋、辐照、掩盖)、化学法(酸碱盐脱腥、抗氧化剂脱腥、有机溶剂萃取、臭氧法)、生物法(酵母发酵脱腥)和复合法等[11-12]。物理法中水洗法易破坏样品中水溶性成分;掩盖法工艺简单、易于推广;吸附法是最常用的方法。王小康等[13]研究证明活性炭法和减压蒸馏法均能脱除鱼皮胶原蛋白中的一些腥味,且活性炭脱除效果更好。ESHTIAGHI等[14]研究了活性炭对初榨椰子油的脱腥效果,结果表明脱腥效果较好,且成分基本保持不变。而生物发酵法与化学法相比,安全系数高,无化学物质残留,消费者更容易接受,还能产生特殊的风味。王晓君等[15]采用酸法、碱法和酵母法对兔腿肉进行了脱腥处理,得出酵母脱腥法效果最好的结论。
本研究选用生姜掩盖法、活性炭吸附法、大孔树脂吸附法、酵母发酵法和乳酸菌发酵脱腥法5种方法对海参肠卵酶解液进行脱腥处理,利用电子鼻、电子舌和顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用技术(headspace-solid phase micro-extraction/GC-MS,HS-SPME/GC-MS)结合感官评定分析,比较不同脱腥方法的脱腥效果。以期为海参肠卵资源的综合利用和深加工提供现实指导和理论依据,推动海参加工副产物产业的进一步发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海参肠卵,蓬莱深奥生物科技研究所；酵母菌,安琪酵母股份有限公司；乳酸菌,山东中科嘉亿股份有限公司；木瓜蛋白酶(80万 U/g),南宁东恒华道生物科技有限责任公司；中性蛋白酶(15万 U/g),山东隆科特酶制剂有限公司；生姜,市售；活性炭,天津市北联精细化学品开发有限公司；大孔树脂AB-8,天津波鸿树脂科技公司。
1.2 仪器与设备
超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司；电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司；电热恒温鼓风干燥箱,上海培因实验仪器有限公司；恒温摇床培养箱,上海天呈实验仪器制造公司；电子舌,法国Alpha MOS公司；电子鼻,德国AIRSENSE公司；QP-2020气相色谱质谱联用仪、Rtx-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),日本SHIMADZU公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品预处理
参照赵彦珺[16]的方法。取适量冷冻海参肠卵,用搅拌机打碎,1∶9料水比拌匀,中性蛋白酶加酶量为1 500 U/g(底物),木瓜蛋白酶加酶量为16 000 U/g(底物),55 ℃下酶解2 h,过滤取上清液,95～100 ℃灭酶10 min,得海参肠卵酶解液,冷藏备用。
1.3.2 酶解液水解度(degree of hydrolysis,DH)的测定
DH是指蛋白质在水解过程中被断裂的肽键数占其总肽键数的百分比。DH计算如公式(1)所示：
(1)
式中：总氮含量的测定参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定 凯氏定氮法》；氨基酸态氮含量的测定参考GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定 酸度计法》。
1.3.3 生姜掩盖法脱腥
生姜去皮后,取适量搅碎,按照质量分数1%、2%、3%、4%、5%的添加量将生姜末加入酶解液中,混合后超声浸提1 h,过滤,冷藏备用。
1.3.4 吸附法脱腥
大孔树脂吸附法[4]：将大孔树脂用去离子水洗至无味,无细小树脂及其他杂质。用无水乙醇浸泡24 h,用去离子水反复清洗至无味。质量分数5% HCl溶液浸泡4 h,排去酸液,用去离子水洗至中性,以质量分数4% NaOH浸泡4 h,排去碱液,去离子水洗至中性。湿基保存,使用时干燥脱水。按照质量分数0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的添加量将大孔树脂加入酶解液中,混合后的样品置于转速150 r/min、30 ℃的恒温摇床中振荡1 h,过滤,冷藏备用。
活性炭吸附法[17]：按照质量分数0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的添加量将活性炭加入酶解液中,混合后置于转速150 r/min、40 ℃的恒温摇床中振荡1 h,过滤,冷藏备用。
1.3.5 生物发酵法脱腥
取2份海参肠卵酶解液,加入3%(质量分数)的葡萄糖,冷却至40 ℃,分别加入质量分数0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的乳酸菌和酵母菌,40 ℃下发酵10 h[18],灭菌后冷藏备用。
1.3.6 感官评定
感官评定是判断食物能否吸引消费者,制得理想风味食品的重要方法。感官评定小组由10名具有丰富感官评定经验的成员组成,按照表1的腥味评价标准对6组样品进行感官评定。以酶解液的腥味作为参比,分值为5。腥味越重,分值越高。成员可根据实际情况保留1位小数,打分后取平均值,进行数据分析。
表1 样品腥味的感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards for deodorizing effect of samples
评分标准分值腥味重5腥味较大4少量腥味3腥味很淡2无腥味1
1.3.7 电子舌、电子鼻分析
准确移取25 mL待测液加入电子舌样品杯中,测量前对电子舌进行自检、活化、校准和诊断等步骤,以确保采集数据的可靠性和稳定性。用30 mmol/L KCl溶液与0.3 mmol/L酒石酸溶液配成Ref Sol参比溶液,将传感器置于参比溶液中归零30 s,随后开始测定。测试时间为30 s,测试完毕后用参比溶液清洗3 s,再次进行回味测定,测试时间30 s。每个样品重复4次,取后3次作为测试结果。
准确移取15 mL样品置于25 mL电子鼻顶空瓶中,加盖密封,26 ℃下静置30 min后检测。测定参数：清洗时间120 s,归零时间5 s,预进样时间8 s,测定时间60 s,载气流速400 mL/min,每个样品测定3次。
1.3.8 HS-SPME/GC-MS
取5 mL样品于20 mL棕色顶空瓶内,65 ℃恒温水浴10 min,随后将65 μm PDMS/DVB萃取头插入棕色顶空瓶中继续水浴萃取30 min,萃取完成后立刻进入GC-MS进行检测,每组样品平行测定2次。
气相色谱条件：Rtx-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),进样口温度250 ℃,不分流模式进样,载气为He,流速为1.0 mL/min；程序升温：初温40 ℃,保持2 min,随后以4 ℃/min升至160 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min。
质谱条件：离子源采用电子电离(electron ionization,EI),GC-MS接口温度250 ℃,离子源温度230 ℃,检测器电压相对于调谐结果,质量扫描范围为m/z 30～550[19]。
1.4 数据处理
主成分分析(principal component analysis,PCA)绘图采用Origin处理,其余数据用Excel进行数据处理,用SPSS Statistics 26软件对数据进行显著性分析(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 酶解液DH
经测定,酶解液中总氮含量为0.66 g/100 g,氨基酸态氮含量为0.24 g/100 g,计算得出DH为36.36%,反应体系中的底物基本被完全酶解,水解程度较充分。
2.2 感官评定结果分析
如表2所示,生姜掩盖法总体腥味值较高,5%生姜添加量掩盖腥味的效果最好,但生姜气味较浓,对不喜生姜味道的消费者来说难以接受,存在局限性。大孔树脂吸附脱腥效果不佳,样品中的不良风味仅轻微降低,添加量为2%时腥味值较低,且大孔树脂原料预处理较麻烦,需进行长时间浸泡和反复清洗,若处理不当会引入大孔树脂的刺鼻气味。活性炭脱腥效果一般,添加量为2.5%时腥味较低,且有研究表明,活性炭在吸附腥味物质的同时,也吸附了其他风味成分和营养成分,会降低总体风味和营养价值[20],存在蛋白质回收率偏低的问题[21]。经酵母发酵处理后腥味较淡,但发酵不易控制,容易发酵过度,添加量为0.3%时腥味值最低,添加量过多会引入酵母味道,产生菌体不良风味,对产品风味带来负面影响。乳酸菌发酵法处理的样品腥味值较低,添加量为0.40%时感官评定结果较好。
表2 感官评价结果
Table 2 Sensory evaluation results
生姜添加量/%腥味值大孔树脂添加量/%腥味值活性炭添加量/%腥味值酵母添加量/%腥味值乳酸菌添加量/%腥味值0(参比)5.00±0.00a0(参比)5.00±0.00a0(参比)5.00±0.00a0(参比)5.00±0.00a0(参比)5.00±0.00a14.21±0.69b0.503.57±0.83b0.503.91±0.51b0.104.14±0.72b0.103.96±0.69b24.01±0.23b1.003.40±0.39b1.003.67±0.83b0.203.53±0.68c0.203.33±0.48c33.79±0.53c1.503.43±0.43b1.502.90±0.33c0.302.60±0.32d0.302.50±0.41c43.44±0.93c2.003.39±0.61b2.002.87±0.49b0.402.62±0.49b0.402.49±0.28c53.35±0.63c2.503.37±0.30b2.502.85±0.60b0.502.64±0.78b0.502.51±0.40c
注：每一行不同字母表示在P<0.05水平差异显著(下同)
2.3 电子舌检测结果分析
为了快速、直观地分析电子舌对不同样品的响应差异,采用PCA对电子舌数据进行总览。PCA是将多个变量转化为少数几个互不相关的综合变量的分析方法[22]。图1为6组样品的电子舌响应PCA得分图(PC1=67.58%,PC2=18.20%),主成分代表了样本中85.78%的信息,样品信息损失率<15%,表明PCA模型可以综合反映出电子舌数据。结果显示,经不同方法处理后的样品整体风味轮廓差异显著,无重叠,区分效果好。生姜和大孔树脂处理与脱腥前样品数据点较为接近,说明脱腥效果不大。活性炭处理后的样品与脱腥前样品的数据点差距较大,味道有一定差异。乳酸菌和酵母发酵脱腥后样品与脱腥前差距最大,可能是受酵母菌和乳酸菌自身或其代谢产物的影响,使得脱腥前后味道差异显著,这与感官评定结果基本一致。
图1 不同方法处理样品的电子舌检测PCA图
Fig.1 PCA plot of E-tongue detection of samples treated by different methods
2.4 电子鼻检测结果分析
电子鼻是一种可以获取挥发性化合物整体轮廓的仪器,能够避免人体自身嗅觉的缺陷,增强对气味辨别的稳定性和重复性[23]。表3中R1～R10分别是电子鼻不同传感器检测到的不同物质种类。
表3 电子鼻传感器代表种类
Table 3 Electronic nose sensors represent types
阵列序号传感器名称代表的物质种类敏感气体举例/(mg·L-1)R1W1C芳香成分,苯类甲苯,10R2W5S对氮氧化合物很灵敏NO2,1R3W3C芳香成分灵敏,氨类苯,19R4W6S主要对氢化物有选择性H2,100R5W5C短链烷烃芳香成分丙烷,100R6W1S对甲基类灵敏CH4,100R7W1 W对硫化物灵敏H2S,1R8W2S对醇类、醛酮类灵敏CO,100R9W2 W芳香成分,对有机硫化物灵敏H2S,1R10W3S对长链烷烃灵敏CH3,100
表4为电子鼻检测数据,数值大小代表传感器对该类物质的响应强度。数值越小,说明响应强度越弱,反之越强。生姜掩蔽法和酵母菌发酵法处理的样品检测到的气味响应数据均较脱腥前有所升高,可能是由于生姜和酵母菌本身及代谢产物的挥发性成分较高,使脱腥后样品气味更加丰富。酵母发酵脱腥后醇类物质(W2S)的含量明显高于其他方法,是因为酵母在发酵脱腥的过程中产生了小分子醇类物质,或原来的腥味大分子物质转化成了小分子醇类。大孔树脂对部分气味的响应强度降低,部分升高。采用活性炭吸附法和乳酸菌发酵法处理后的样品各项气体检测指标均有所降低,W2S传感器测得的与腥味有关的醇类和醛酮类物质有所降低。
表4 脱腥前酶解液与脱腥处理后样品的电子鼻检测数据
Table 4 Electronic nose test data of the enzymatic hydrolysate before deodorization and the sample after deodorization
传感器脱腥前酶解液生姜掩盖脱腥大孔树脂吸附脱腥活性炭吸附脱腥酵母发酵脱腥乳酸菌发酵脱腥W1C1.29±0.11c1.96±0.07b1.35±0.03c1.06±0.00c19.56±0.95a1.20±0.01cW5S1.56±0.05b3.25±0.26b1.60±0.06b1.35±0.01b70.26±15.26a1.57±0.01bW3C1.15±0.06c1.46±0.03b1.19±0.01c1.03±0.00d6.41±0.12a1.10±0.00cW6S1.03±0.02c1.07±0.01b1.05±0.01bc1.05±0.00bc1.59±0.07a1.06±0.00bcW5C1.05±0.01c1.14±0.01b1.03±0.00d1.01±0.00e3.07±0.03a1.04±0.00cdW1S2.52±0.34c4.99±0.32b2.44±0.13c1.51±0.00c59.24±3.00a2.29±0.05cW1 W2.75±0.24c10.79±1.18b2.41±0.19cd1.82±0.13d38.41±1.07a2.78±0.04cW2S2.24±0.26bc4.05±0.18b1.95±0.11c1.32±0.00c54.12±4.60a2.09±0.04bcW2 W2.12±0.15c5.74±0.64b1.75±0.09cd1.46±0.01d30.21±0.78a2.12±0.04cW3S1.26±0.00b1.27±0.01b1.25±0.01b1.20±0.01b3.66±0.27a1.25±0.00b
2.5 GC-MS检测结果分析
如表5所示,通过HS-SPME-GC-MS技术,海参肠卵酶解液中共检测出37种挥发性成分,经生姜掩盖处理后挥发性成分有28种,经活性炭吸附后挥发性成分有21种,大孔树脂吸附后检出22种,酵母发酵法共检出25种,乳酸菌发酵法检出20种。
表5 样品中挥发性物质种类及个数
Table 5 Types and numbers of volatile substances in samples
挥发性物质种类脱腥前生姜掩蔽法活性炭吸附法大孔树脂吸附法酵母发酵法乳酸菌发酵法醛类730410醇类766282酮类120010酯类513145有机酸类118810611烯烃类150311烷烃类202120芳香族类211110其他121011总计372821222520
海参肠卵酶解液中的主要挥发性成分有醛类、酮类、醇类、酯类、有机酸类、烃类、芳香类物质等,腥味成分主要是庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、反,顺-2,6-壬二烯醛、辛醇等醛醇类物质(见附表)。脱腥前醛醇类物质共有14种,生姜处理后为9种,大孔树脂和活性炭处理后有6种,酵母处理后有9种,乳酸菌发酵后有2种。脱腥后挥发性腥味物质均有所减少,其中乳酸菌发酵法效果最佳,这与感官评定、电子鼻和电子舌的检测结果基本一致。
2.5.1 羰基化合物
羰基化合物主要包括醛类和酮类物质,醛类对水产品中的挥发性气味有重要贡献作用,尤其是一些相对分子质量较低的醛类物质,阈值低,易产生刺激性气味[11]。脱腥前,有多种醛类物质被检出,如壬醛、庚醛、辛醛、癸醛等呈强烈和不愉快脂肪气味,具有刺激性腥味[24];壬二烯醛呈强烈油脂香气,经脱腥处理后,醛类物质均明显减少或被完全脱除。酮类物质的阈值较高,但对腥味有增强作用[11],脱腥后酮类物质的含量均显著减少。
2.5.2 醇、酸类物质
醇类包括饱和醇和不饱和醇。饱和醇的阈值一般比较高,对风味贡献不大。饱和醇中,C1～C3有轻快香味(如乙醇),C4～C6的醇类近似麻醉性的气味,C7～C10则显示出芳香气味(如辛醇)。不饱和醇的气味阈值低,气味贡献度较大,茨醇有似樟脑气味,雪松醇具有温和的杉木芳香。经酵母发酵处理后,醇类物质有所增加,原因可能是酵母在发酵脱腥的过程中产生了醇类物质。发酵法脱腥的原理就是利用微生物的新陈代谢和微生物酶的作用,使腥味物质被分解或修饰成没有腥味的物质,如将醛、酮类物质转化成相应的酸,从而达到脱腥的目的[20]。经乳酸菌发酵后,酸类物质含量有大幅度提升,乙酸等短链脂肪酸具有强烈的酸味和奶酪味且阈值较低,会使海参肠卵酶解液带有特有的酸味和奶酪香味。
2.5.3 其他物质
烯烃类化合物在一定条件下会形成醛和酮,对风味有增强作用,是产生腥味的潜在因素[19],酵母发酵后产生了较多烯烃类物质,对风味有一定负面影响,例如(角)鲨烯不稳定,在空气中易氧化,产生特殊臭气。乳酸菌发酵法较其他方法处理后的烯烃类物质含量最少。酯类物质是由酸与醇通过酯化反应生成的,易挥发,有悦人的甜香和果实香味。烷烃类物质的阈值较高,因此对整体的风味贡献不大[25]。另外,苯(异硫氰酸酯)具有刺激性臭味,经脱腥后含量显著减少。
3 结论
采用生姜掩盖法、大孔树脂吸附法、活性炭吸附法、酵母发酵法、乳酸菌发酵法对海参肠卵酶解液进行脱腥处理,以电子舌、电子鼻、GC-MS数据协同感官评定腥味值为评价依据,综合比较分析得出乳酸菌发酵法的脱腥效果较好。生姜掩盖法对腥味有少许的遮盖作用,但会使酶解液带有较重生姜味。活性炭和大孔树脂吸附法的脱腥效果不佳。酵母发酵法处理后的样品酵母味和发酵后的酸味较重,对产品风味带来负面影响。乳酸菌发酵法与其他方法相比安全系数较高,更适用于海参肠卵酶解液的脱腥,可降低腥味成分,未引入不良风味,蛋白损失少,无化学物质残留,是一种绿色有发展前景的脱腥方法,消费者更容易接受,在去除腥味物质的同时还能产生悦人风味的酯类物质等,具有一定的应用潜力及价值。
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