中国白酒主要分为十二大香型,较为典型的代表为浓香型。浓香型白酒以高粱、大米等粮谷物为酿造原料,以中高温大曲为糖化发酵剂,原料与曲混合发酵形成酒醅,酒醅发酵后,取酒糟,经过缓火蒸馏、储存、勾兑等酿造工艺得到风味丰富、口感独特的浓香型白酒。白酒发酵过程中,风味微生物以酒醅为载体参与白酒酿造的糖化、产酒以及生香过程,进而影响成品酒的酒质[1-3]。近年来,酒醅的理化参数、微生物群落演替以及酒醅中挥发性香气成分受到研究者的关注[4-5]。任剑波等[6]通过对窖池不同层面酒醅中微生物的研究发现,酒醅微生物区系存在差异；李贺贺等[7]分析了古井贡酒酒醅中的风味物质,共定性出148种挥发性香气成分。随着固相微萃取技术在食品发酵领域的普及,酒醅中挥发性香气成分的研究愈加广泛,而针对酒醅风味成分变化的时空差异研究有待进一步完善。
本研究以浓香型酒醅作为研究对象,通过顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用法(headspace solid phase microextraction-GC-MS,HS-SPME-GC-MS)定性、定量分析酒醅不同空间层中的主要呈香物质,通过主成分分析探究影响酒醅的主要风味成分,并对其重要呈香物质及其前体物的时空迁移规律进行跟踪监测,以期为浓香型白酒酒醅发酵过程与白酒风味的联系提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
酒醅样品,取自川南某浓香型白酒厂。按窖池深度差异分为上、中、下3层,每层采用5点取样法取样,放入无菌袋密封,并置于4 ℃下保存,取回后样品及时处理[8]。
1.1.2 试剂
2-辛醇、乙酸正戊酯、无水乙醇(均为色谱纯)、NaCl(分析纯),成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
AR2140电子天平,梅特勒托利多仪器有限公司；7890A—5975B气相色谱-质谱联用仪,美国 Agilent 公司；KQ5200E超声波清洗仪,昆山市超声仪器有限公司；ZHBF-RE旋转蒸发仪,中环北方有限公司。
1.3 实验方法
采用HS-SPME-GC-MS,对浓香型白酒酒醅的挥发性风味物质进行分析。
1.3.1 样品前处理
称取酒醅样品10 g,加入50 mL无水乙醇20 ℃超声处理15 min,取浸提液进行蒸馏浓缩,蒸馏液经旋转蒸发再次浓缩至20 mL,最后使用氮吹浓缩至5 mL备用[9-10]。
1.3.2 HS-SPME-GC-MS测定条件
萃取条件：取氮吹后的浓缩液5 mL于顶空进样瓶。顶空进样样品中加入100 μL内标溶液,将进样瓶密封,于50 ℃恒温平衡样品20 min,同时使用老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头萃取40 min,手动进样分析。
色谱条件：DB-WAX(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱；载气为99.999%氦气,进样口温度230 ℃；分流比20∶1；程序升温为初始温度40 ℃,保持1 min,7 ℃/min升到180 ℃,保持3 min；10 ℃/min升到230 ℃,保持3 min；载气流速1 mL/min。
质谱条件：电离电压70 eV,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,电离方式为电子电离(electron ionization,EI),质谱扫描范围20～500 amu,溶剂延迟3 min。
定性分析：采用NIST05a.L标准谱库(美国 Agilent 公司)比对,通过GC-MS化学工作站进行数据分析。
定量分析：采用内标法,使用2-辛醇、乙酸正戊酯为内标物,通过预试验调整内标物浓度,确定2-辛醇质量浓度为16.944 7 mg/mL,乙酸正戊酯质量浓度为0.527 5 mg/mL,以2-辛醇内标检测酒醅中含量较多的风味物质,以乙酸正戊酯检测酒醅中含量较低的风味物质。
1.4 数据处理
设置3组平行,每组样品测定3次,结果采用(x±S)表示,采用SPSS 22.0数据分析软件和NIST 8.0谱库检索,对呈香物质进行分析。
2 结果与分析
2.1 酒醅不同空间层的风味差异分析
酒醅的风味直接决定了浓香型白酒口感质量,原料的发酵方式决定了浓香型白酒窖香浓郁、绵甜爽净、回味悠长的酒质特点[11]。本试验通过顶空固相微萃取处理样品,对酒醅中主要酯类[12]、醇类[13]、酸类以及白酒有益风味因子进行分析,结果见表1。
表1 酒醅不同层面主要风味物质分析结果
Table 1 Analysis results of main flavor compounds in different layers of fermented grains
种类序号化合物名称相对含量/%质量浓度/(mg·L-1)上层中层下层上层中层下层酯类1乙酸乙酯4.72±0.32A4.79±0.15A5.74±0.54B44.21±0.11a159.93±0.23b132.79±0.35c2丁酸乙酯0.72±0.02A0.88±0.04A1.36±0.11B6.74±0.09a29.38±0.28b31.46±0.54b3戊酸乙酯1.77±0.02A0.87±0.11B1.08±0.01C16.58±0.21a29.05±0.01b24.98±0.08c4甲酸异戊酯-0.47±0.17--15.69±1.32-5己酸乙酯10.46±0.11A5.86±0.09B9.52±0.44A97.97±0.14a195.62±17.66b220.25±10.58b6乳酸乙酯16.76±0.33A14.23±0.63B11.96±0.33C156.97±25.21a475.06±41.33b276.67±16.11c7庚酸乙酯3.97±0.37A4.35±0.47B5.12±0.39C37.18±14.33a145.24±33.99b118.45±22.68b8己酸丁酯-0.21±15.770.38±0.02-7.01±0.318.79±1.229辛酸乙酯5.47±0.33A6.82±0.77A3.35±0.21B51.23±2.31a227.71±46.55b77.50±10.32a10己酸异戊酯-0.61±0.010.97±0.22-20.37±0.9922.44±1.6311壬酸乙酯-1.31±0.330.12±0.01-43.74±0.212.78±0.7512己酸己酯-1.25±0.642.02±0.32-41.74±10.3246.73±0.2213丁二酸二乙酯0.30±0.020.14±0.01-2.81±0.184.67±1.36-14苯乙酸乙酯-0.11±0.680.20±0.01-3.67±0.694.63±0.7115油酸乙酯-0.20±0.010.29±0.03-6.68±0.626.71±0.3416苯乙酸乙酯0.41±0.440.57±0.52-3.84±0.0619.03±0.07-17亚油酸乙酯0.73±0.060.79±0.75-6.84±0.6926.38±0.25-18十六酸乙酯1.58±1.22AB2.35±0.99A0.68±0.01B14.80±0.42a78.46±0.32b15.73±0.21a醇类1异丁醇0.07±0.210.61±0.33-0.66±0.2120.37±4.55-23-甲基-2-丁醇--0.02±0.32--0.46±0.0132-乙基己醇-1.41±0.23--47.19±0.03-4正丁醇-1.14±0.02--38.06±7.99-5异戊醇0.63±0.6A1.57±0.78A0.10±0.01B5.90±0.11a52.42±10.32b2.31±0.43c6十二醇0.09±0.031.14±0.11-0.84±0.0138.06±0.02-7(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇0.01±0.01AB1.23±0.32B0.02±0.01A0.09±0.01a41.07±10.32b0.46±0.01a8糠醇0.04±0.01A0.12±0.12B0.08±0.02A0.37±0.21a4.01±0.21b1.85±0.01a9苯乙醇1.08±0.21A3.40±0.01B0.91±0.02A10.12±0.02a113.52±35.24b21.05±2.69c10六聚乙二醇0.06±0.01--0.56±0.02--酸类1异丁酸--0.11±0.32--2.54±0.032丁酸1.28±0.18A1.19±0.03A1.37±0.07A11.99±0.15a39.73±7.33b31.69±0.99b3己酸17.36±0.46A6.57±0.25B19.10±0.57C162.59±0.69a219.37±14.96b441.86±36.20c4乳酸25.24±4.45A22.65±2.36A28.64±3.99B236.40±12.65a756.27±44.36b662.55±36.22b5乙酸6.32±3.22A7.43±0.66B5.38±0.59C59.19±7.36a248.08±69.36b124.46±25.33c6辛酸-2.55±44.65--85.14±33.62-7正戊酸0.68±17.32A2.82±33.63B1.23±11.44C6.37±0.33a94.16±2.36b28.45±4.66c8庚酸-0.06±0.010.08±0.01-2.00±0.551.85±0.32酚类14-甲基愈创木酚0.02±0.01A0.15±0.01B0.01±0.01A0.19±0.11a5.01±1.33b0.23±0.66a24-乙基愈创木酚0.23±0.03A0.15±0.11B0.16±0.03B2.15±0.01a5.01±0.03b3.70±0.02c
注：-表示未检出；酒醅不同层共有物质相对含量差异显著用不同大写字母表示(P<0.05),含量差异显著用不同小写字母表示(P<0.05)
本试验针对酒醅中含量较高的醇类、酯类、酸类和酚类物质进行检测,共有38种物质,其中酯类18种、醇类10种、酸类8种和4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚2种白酒有益因子。
酒醅不同层均所检测到的物质分别有四大酯(己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯)、四大酸(己酸、丁酸、乙酸、乳酸)和戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯、异戊醇、正戊酸、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚等物质,这些风味物质对浓香型白酒的整体风味具有较大影响。酒醅上、中、下层主要呈香物质分别为20、32、26种,其中上、中、下层主要酯类数量分别为7、18、14种,主要醇类数量分别为7、8、5种,主要酸类数量分别为4、8、7种,以及共有的酚类物质各2种。
醇类物质在酒醅上、中、下层相对含量分别为1.98%、10.62%、1.13%,具体含量分别为18.54、354.70、26.14 mg/L,醇类物质突出表现在中层酒醅中,包括苯乙醇、十二醇、六聚乙二醇等高级醇成分,高级醇是酒类中最主要的香味和口味物质之一,适量的含量能使酒香味和口味协调、丰满,高级醇具有强烈的甜香、奶香[14-15],有学者提出,苯乙醇是玫瑰香葡萄酒的特征香气成分,具有清甜的玫瑰样花香,可增加酒体香味,使成品酒余味回香[16-17]。
酸类物质在酒醅上、中、下层相对含量分别为50.88%、43.27%、55.80%,具体含量分别为476.54、1 444.75、1 293.41 mg/L,酸类物质在酒醅上层风味中占比低于酸在中、下层中的占比,而实际含量却高于中层和下层,综合得出,酒醅中层无论是主要风味成分种类还是在总含量上皆更为丰富,而上层则表现得略为单调,酒醅下层中己酸及己酸乙酯含量最高,分别达220.25和441.86 mg/L,下层酒醅厌氧程度更高,更有利于己酸菌等厌氧菌在下层酒醅中代谢产生己酸及进一步合成浓香型白酒的主体风味物质己酸乙酯。
酯类物质在酒醅上、中、下层相对含量分别为46.89%、45.81%、42.79%,具体含量分别为439.17、1 529.45、989.89 mg/L,作为白酒主体风味骨架的四大酯、四大酸在酒醅不同空间层面均有所分布,其中酒醅上、中、下层中四大酯相对含量占总酯69.65%、56.23%、66.79%,在酯类物质中占有绝对的主导地位,丁酸乙酯与己酸乙酯相对含量比值分别为0.07、0.15、0.14,有学者认为,四大酯占总酯比例较大,则酒质好,浓香型风格突出；丁酸乙酯与己酸乙酯比值低于0.1,则酒体协调,从这个角度分析,上层酒醅对白酒浓香型风格的形成和对整个酒体的品质贡献较大[18-19]。
此外,本研究也对愈创木酚等白酒有益风味因子进行了检测。酒醅不同空间层均检测到了4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚,酒醅中层含量略高,4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚含量约为5.01 mg/L,4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚具有呈香、呈味作用,在酱、浓、清、芝麻香等最具白酒代表的四大香型白酒研究中均有报道,具有普遍性,愈创木酚是白酒中的有益因子,具有较好的抗氧化、抗肿瘤和增强人体免疫力的作用[20-21]。
对酒醅上层、中层以及下层所检出的38种风味成分进行主成分分析作降维处理,以得到对酒醅影响较大的主要呈香物质,进而分析其发酵过程变化规律,分析结果见图1。
a-载荷散点图；b-重要风味物质
图1 酒醅风味主成分分析结果
Fig.1 PCA results of fermented grains flavor
变量的载荷系数反映了变量对各主成分的影响程度,载荷系数绝对值越大,则该变量对主成分的贡献也越大[22]。由图1-a可知,第一主成分(PC1)单独贡献率为91.90%,第二主成分(PC2)单独贡献率为6.56%,两者累计贡献率为98.46%(>85.00%),具有代表意义。图1-b为第一主成分和第二主成分综合分析结果,得到酒醅的重要风味物质,其代表有乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸己酯、丁酸、己酸、乳酸、乙酸等。
综合上述结果,决定对乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯及其前体酸的时空变化规律作进一步跟踪监测。
2.2 发酵过程酒醅风味成分变化规律反映的结果
酒醅不同层面的发酵过程受窖内温度、厌氧环境、微生物群落等众多因素影响,反映结果为酒醅的风味物质随发酵时间变化存在差异[23-24]。本试验监测了浓香型不同层面的酒醅发酵过程重要风味物质及其前体物(四大酯、四大酸)含量的变化,其结果如图2、图3所示。酒醅不同空间层重要呈香物质随时间变化存在差异,酒醅不同空间层的四大酯、四大酸整体上先增加较缓(0～15 d),中后期迅速增加至稳定趋势,其中,酒醅的中、下层变化较大,上层变化趋势较缓。
a-己酸乙酯；b-丁酸乙酯；c-乙酸乙酯；d-乳酸乙酯
图2 酒醅重要酯类物质含量变化结果
Fig.2 Content changes of important esters in fermented grains
a-己酸；b-丁酸；c-乙酸；d-乳酸
图3 酒醅重要酯类前体物质含量变化结果
Fig.3 Content changes of important ester precursors in fermented grains
发酵0～15 d,酒醅中己酸乙酯含量增加缓慢,15 d后中、下层己酸乙酯含量迅速增加,发酵进行到50 d后,增加趋势放缓,酒醅上层较酒醅中下层相比,增加趋势和中、下层相近,但增加程度明显低于中、下层,发酵到63 d时,上层己酸乙酯含量为59.25 mg/L,中、下层质量浓度分别为136.77和162.77 mg/L。酒醅中、下层在发酵前期乙酸乙酯含量大致趋于一致,随后上、下层含量增加趋势放缓,趋于稳定,直至发酵后期,而中层乙酸乙酯含量继续增加,至35 d达到峰值,为82.79 mg/L,随后有所降低,发酵进行到50 d后趋于稳定。整体上,丁酸乙酯在同一发酵过程在四大酯含量中最少,丁酸乙酯的生成和己酸乙酯的生成在前63 d呈正相关,63 d后,下层中的丁酸乙酯含量有所降低。在发酵中期,乳酸乙酯含量处于较快的增加水平,35 d后,中、下层增加趋势放缓,而上层酒醅在35～56 d乳酸乙酯含量迅速增加,随后呈明显下降趋势。发酵初期,酒醅内微生物主要起糖化作用,所需的碳源和能源物质需要不断补充,此时酯主要起分解作用,酯类合成较少。沈怡方[25]认为,酯的形成有3条途径：一是酵母菌在酒精发酵时的副产物；二是酒醅中过量的酸经微生物酯化形成；三是其他微生物发酵的代谢物。因此发酵前期(0～15 d),窖内酒精含量较低,发酵中期微生物主要起产酒的作用,且酸类物质含量也较低,故酒醅中酯的生成量较少,酯类的生成较缓,到发酵中后期,发酵进入产酯阶段,微生物代谢产物增多,醇类以及乙酸、丁酸等合成己酸乙酯、丁酸乙酯等的前体物质大量增多,酯类物质开始大量生成,为白酒发酵过程提供“产香”作用。
酒醅不同空间层中,随发酵时间增加，酒醅上层己酸的含量增加明显,63 d时达到峰值,最高达366.70 mg/L和上、中层存在明显差异,上层己酸含量在前45 d左右略高于中层,随后下层己酸含量开始降低至平缓,中层继续增加至发酵后期趋于稳定,酒醅中层的乙酸、乳酸、丁酸含量进入主发酵期后,在不同发酵时间段,其三大酸含量皆高于上层和下层,其乙酸、乳酸含量分别在49 d和63 d达到峰值,分别为266.55、665.51 mg/L。有机酸的生成受到产酸微生物生理活动影响,随发酵时间的进行,环境对产酸微生物表征为协同作用,有利于产酸微生物的代谢活动,促使有机酸含量上升,并进一步促使酯类合成[26-27]。窖内微生物群落主要为乳酸菌群,故酒醅中乳酸菌代谢所产生的乳酸含量及合成的乳酸乙酯含量较其他有机酸及酯类物质高,窖内中、下层厌氧程度更高,且黄水渗透中、下层,赋予了中、下层酒醅更多的营养物质,更加适于己酸菌、丁酸菌等厌氧菌群的代谢繁殖,合成的酯类最终也高于酒醅上层,而在发酵前45 d,上层酒醅己酸含量累计速度较中层略高,可能是由于发酵中期中层酒醅中己酸累计量还较低,己酸主要用于合成己酸乙酯,消耗了己酸,导致发酵前、中期酒醅中层己酸含量较低,后期己酸累计量增多,满足己酸乙酯的合成需要,故累计量继续增加,而上层酒醅中的己酸含量随发酵的继续进行趋于平缓；发酵过程中,丁酸含量在四大酯中最低,可能有2种原因,一是产丁酸菌的繁殖代谢需要厌氧生态因子,生存条件相对苛刻;二是丁酸作为己酸代谢途径的中间物,合成己酸消耗了丁酸,加上丁酸也被丁酸乙酯的合成所消耗,故含量处于较低水平。
3 结论
本研究采用HS-SPME-GC-MS法对浓香型白酒酒醅不同层面的主要风味物质和发酵过程四大酯、四大酸的变化规律进行了分析。检测分析了酒醅不同层面相对含量较高的风味物质38种,包括酯类物质18种、醇类物质10种、酸类物质8种以及2种白酒有益因子愈创木酚。
酒醅上、中、下层的酯类数量分别为7、18、14种,醇类数量分别为7、8、5种,酸类数量分别为4、8、7种。酒醅上层的风味物质种类较少,但上层酒醅对白酒浓香型风格的形成和对整个酒体的品质贡献较大；酒醅中层无论是主要风味成分种类还是在总含量聚集了更为丰富的香气成分；酒醅中、下层的酸和酯类物质含量较高。
酒醅不同空间层的四大酯、四大酸整体上呈现先较缓增加(0～15 d),中后期呈迅速增加至稳定的趋势,其中,酒醅的中、下层变化趋势较大,上层变化趋势较缓。本研究解析了浓香型白酒发酵过程中酒醅不同层面的主要风味物质在时间层面和空间层面的变化规律,为进一步研究固态发酵过程提供了理论依据。
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