发酵乳是牛乳经乳酸菌发酵制成的具有独特风味、均衡营养以及多重生理功能的乳制品[1]。近年来，随着人们对健康、营养型功能食品需求的不断增加，功能性发酵乳开发已成为食品行业的研究热点。目前，国内外许多学者开展了添加蛋白质和多肽的功能发酵乳研究，如添加蛋清蛋白[2]、乳清蛋白水解物[3]和大豆分离蛋白酶解物[4]等可以提高发酵乳的贮藏稳定性和益生菌活性；同时也有人研究将核桃粕多肽[5]、胶原蛋白肽[6]、小麦面筋蛋白肽[7]等用于功能性发酵乳的开发，结果发现不仅可以提高发酵乳的小分子肽含量，还可以提高发酵乳的抗氧化活性等功能。

火麻是一种重要的食品、医药和纤维植物，在我国广西、云南等地种植广泛[8]。火麻仁是火麻的成熟种仁，富含油脂、蛋白质和矿物质，是优质的植物油脂和蛋白资源[9]。火麻仁粕是火麻仁提取完油脂后的副产物，约含33%的蛋白质，不含蛋白酶抑制剂，且必需氨基酸和精氨酸含量较高，属高价值植物蛋白资源。但目前大多数火麻仁粕都被用于饲料或肥料，造成极大的资源浪费[10]。本试验从火麻仁粕中提取蛋白质，并利用碱性蛋白酶酶解不同时间后，得到不同水解度的火麻仁粕蛋白水解液(hemp seed meal protein hydrolysate, HP)。然后将HP添加到发酵乳中，研究不同酶解度的HP对发酵乳品质及抗氧化活性的影响，以期为开发新的功能发酵乳和提高资源利用率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

乳粉，扬大康源乳业有限公司；脱脂火麻仁粕，辽宁俏牌生物科技有限公司；白砂糖，扬州麦德龙超市采购；嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌，江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离保藏；碱性蛋白酶，浙江一诺生物科技有限公司；水杨酸、铁氰化钾，国药集团化学试剂有限公司；硫酸亚铁，天津科密欧试剂有限公司；DPPH，麦克林；三氯乙酸，上海山浦化工有限公司；NaOH、HCl、浓H2SO4及其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1510型酶标仪，美国Thermo公司；JF-SX-500全自动灭菌锅，日本TOMY公司；5804R高速冷冻离心机，德国EPPEENDORF公司；SPX-150BS生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；pH S-25 型数显pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；TMS-PRO质构仪，美国FTC公司；全自动凯氏定氮仪，北京盈盛恒泰科技有限责任公司；FREEZONE18L冷冻干燥机，美国LABCONCO公司。

1.3 试验方法

1.3.1 火麻仁粕蛋白的提取

参考林金莺[11]的方法提取火麻仁粕中的蛋白质，并将其冷冻干燥。

1.3.2 火麻仁粕蛋白水解

火麻仁粕蛋白与去离子水以质量比1∶25配制蛋白溶液，每克蛋白质加入2 000 U碱性蛋白酶，酶解温度45 ℃，酶解pH 8.5，分别水解4、8、12、16、20 h，沸水灭酶10 min，冷却，将溶液调至中性，离心收集上清液，得HP，分别记为H-4、H-8、H-12、H-16、H-20。

1.3.3 火麻仁粕蛋白水解度测定

参考陈霞等[12]的方法测定火麻仁粕蛋白水解度。

1.3.4 发酵乳样品制备工艺流程

发酵乳样品制备工艺流程如下：

12%全脂复原乳+7%白砂糖+6%HP→混合→均质(55 ℃，20 MPa)→灭菌(95 ℃，10 min)→冷却(42 ℃左右)→接种(3%)→发酵(42 ℃)→后熟(4 ℃，24 h)→成品

1.3.5 凝乳时间确定

参考胡凯丽等[13]的方法，待发酵乳滴定酸度至75 °T时记为发酵完成，记录时间。

1.3.6 质构特性测定

参考陈霞等[12]的方法，采用质地剖面分析(texture profile analysis,TPA)法，使用TMS-PRO 质构仪进行发酵乳质构的测定。测试条件：力量感应元的量程25 N；起始力0.01 N，检测速度1 cm/min，形变百分量60%。

1.3.7 pH值和滴定酸度测定

发酵乳的pH值参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》使用精密pH计进行测定；发酵乳的滴定酸度参考GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》进行测定。

1.3.8 持水率测定

参考陈霞等[12]的方法，称取7.00 g的发酵乳置于10 mL离心管中，6 000 r/min，30 min条件下离心，称量上清液质量。发酵乳的持水率计算如公式(1)所示：

持水率

(1)

1.3.9 活菌数测定

参考GB 4789.35—2016中的平板计数法测定发酵乳中的活菌数。

1.3.10 感官评价

感官评价标准参照GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》进行设定，参评人员为接受过感官评定培训的食品科学专业的10位学生(5男5女)，按照表1对发酵乳进行感官评分。

1.3.11 抗氧化能力测定

1.3.11.1 样品前处理

于10 mL离心管中加入3 g发酵乳样品和4 mL甲醇，超声1 h，8 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液。

1.3.11.2 DPPH自由基清除能力测定

参考LEE等[14]的方法，于517 nm处测定吸光度。

1.3.11.3 羟自由基清除能力测定

参考SHEN等[15]的方法，于510 nm处测定吸光度。

1.3.11.4 总还原能力测定

参考WANG 等[16]的方法，于700 nm测定吸光度。吸光值越高，还原能力越强。

1.4 数据分析

实验数据均采用SPSS 17.0和Origin 8.0软件进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 火麻仁粕蛋白酶解液的水解度分析

火麻仁粕蛋白经碱性蛋白酶酶解不同时间的水解度如表2所示。火麻仁粕蛋白酶解液的蛋白质含量、氨态氮含量和水解度均随着酶解时间的延长而不断升高，且在前12 h内水解度显著升高(P< 0.05)，12 h后水解度上升缓慢。说明在前12 h内绝大多数的火麻仁粕蛋白被酶解成短肽链，之后由于底物浓度和酶浓度的降低，且受酶解产物的抑制，酶解速率降低。为研究不同水解度HP对发酵乳品质的影响，选取低(H-4)、中(H-8)、高(H-12)3 个不同水解度的HP添加到发酵乳中，研究发酵乳品质及抗氧化活性的变化。

2.2 不同水解度HP对发酵乳品质的影响

由表3可知，添加HP能显著降低发酵乳的凝乳时间和胶黏性，提高发酵乳的内聚性、弹性和感官评分。空白组的凝乳时间为8.04 h，H-4、H-8和H-12组的凝乳时间分别比空白组缩短了1.44、1.80和1.99 h，说明水解度高的HP促发酵效果较好。原料奶里非蛋白氮含量较低，添加HP增加了发酵乳中小分子肽类和游离氨基酸的含量和种类，增加了乳酸菌可利用的氮源物质，可以促进乳酸菌生长代谢，使凝乳时间显著缩短。发酵乳的质构特性与酪蛋白的凝胶特性有直接的关系，HP含有的小分子肽可以增大发酵乳的黏度，同时可以促进乳酸菌生长产生胞外多糖，从而使发酵乳的内聚性和弹性增大[17]。赵强忠等[18]研究发现大豆分离蛋白经胰酶酶解24 h得到的酶解液对酸乳有较强的促发酵作用和增黏作用。添加了HP的3组发酵乳样品兼具发酵乳的香味和HP的香气，口感细腻，质地均匀，感官评分均显著高于空白组(P<0.05)，其中H-8组感官评分最高，为88.0分，产品的发酵乳香气和肽液的香气协调，口感最佳。

2.3 HP水解度对发酵乳贮藏特性的影响

2.3.1 发酵乳贮藏过程中滴定酸度的变化

由图1可知，随着贮藏时间延长，4组发酵乳的滴定酸度均不断升高，其中空白组升高的幅度最大，到第21天时达到92.0 °T，比第0天高了17.0 °T；而添加量HP的3组样品的滴定酸度增幅均明显低于对照组，其中H-8组在冷藏至21 d时的滴定酸度最低，为87.5 °T。这是因为在低温贮藏过程中，乳酸菌仍会利用发酵乳中的乳糖发酵产酸，造成发酵乳酸度的持续上升，酸度过高则会影响产品的可接受度。HP中的蛋白质具有一定的酸中和能力，对于延长发酵乳的保质期和储藏期间的稳定性有一定的效果。赵强忠等[4]研究发现，大豆分离蛋白酶解产物中的小分子组分可通过降低酸奶中的杆/球菌比值从而减缓酸奶的后酸化过程。

2.3.2 发酵乳贮藏过程中持水率的变化

持水率的高低可以反映发酵乳凝胶网络体系的稳定性。由图2可知，H-8组的持水率随贮藏时间延长一直保持上升趋势，到第21天时的持水率为33.87%；其余各组的持水率呈先上升后下降趋势；其中H-4和H-8组的持水率在贮藏期内一直保持较高状态，到第21天时的持水率均大于30.00%，而空白组和H-12组到此时已经降到25.00%以下，说明在贮藏后期发酵乳的凝胶网络结构不稳定。这是因为发酵乳在贮藏初期的凝胶结构紧实，随着贮藏时间的延长，酸度不断降低，会影响酪蛋白凝胶网络的稳定性，其中空白组和H-12组样品的酸度较低，使得发酵乳的持水率下降[19]。

2.3.3 发酵乳贮藏过程中活菌数的变化

在4 ℃贮藏21 d发酵乳的活菌数变化见图3。添加了HP的3组发酵乳的活菌数在21 d内均显著高于空白组，H-4和H-8组在21 d内活菌数呈上升趋势，而空白组在第7天后开始下降，第21天时的活菌数下降为8.92 lgCFU/g；H-12组的活菌数呈先上升后下降的趋势，在第14天时活菌数达最高值，为9.31 lgCFU/g。上述实验结果说明添加HP可以促进乳酸菌的增殖，HP中的小分子肽和非极性游离氨基酸是乳酸菌理想的氮源，具有促进乳酸菌的生长代谢的作用，而牛乳中的蛋白质因分子质量较大，需经过保加利亚乳杆菌水解成酪蛋白才能被嗜热链球菌利用，因而空白组在后期活菌数下降迅速。胡月等[20]将大豆肽加入凝固型酸奶，发现大豆肽可以显著提高其贮藏期内的活菌数和氨基酸含量，可能是因为大豆肽本身含有谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸等氨基酸有利于保持乳酸菌生长。

2.4 不同水解度的HP对发酵乳体外抗氧化活性的影响

由表4可知，添加了HP的3组样品的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和总还原能力均显著高于空白组(P<0.05)，其中H-8组和H-12组的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力显著高于H-4组，而H-4组的还原能力最高，为0.61%。上述结果说明，添加HP可显著提供发酵乳的抗氧化能力，这是因为蛋白质被蛋白酶水解后分子构象发生变化，一些具有抗氧化能力的氨基酸残基被暴露出来，如色氨酸、酪氨酸、组氨酸和苯丙氨酸等，是样品组抗氧化能力提高的原因[21]。戴梓茹等[22]研究发现添加牡蛎肽可以显著提高酸奶的总还原能力和DPPH自由基清除能力。伍亚龙等[23]利用胰蛋白酶将原料乳适度水解后再接入发酵剂发酵，制得的发酵乳抗氧化活性也显著提高。

3 结论

从火麻仁粕中提取蛋白质，经碱性蛋白酶酶解不同时间后，得到水解度分别为8.45%、13.24%和16.62%的HP。将HP添加到发酵乳中，发现不同水解度的HP均显著缩短了发酵乳的凝乳时间，降低了发酵乳的胶黏性，提高了发酵乳的内聚性、弹性和感官评分；对发酵乳贮藏特性的研究表明，添加HP能缓解发酵乳的后酸化，提高发酵乳的持水率和活菌数。发酵乳的抗氧化活性研究表明，添加HP显著提高了发酵乳的抗氧化活性，但H-8组和H-12组的抗氧化活性无显著差别。H-8组在贮藏末期酸度上升幅度较小，第21天时持水率最高，感官评分最高，活菌数含量和抗氧化活性也较高，为品质最佳的一组样品发酵乳。

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Effect of hemp seed meal protein hydrolysate on the quality and antioxidant activity of fermented milk

XIAO Xiao,WANG Peng,SHAO Tong,MA Xinyi,GU Ruixia,CHEN Xia*

(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control of Jiangsu Province (Yangzhou University), Yangzhou 225000, China)

ABSTRACT Proteins were extracted from hemp seed meal and hydrolyzed with alkaline protease for different times to obtain protein hydrolysates (HP) with hydrolysis degrees of 8.45%, 13.24% and 16.62%, respectively. The effects of different hydrolysis degrees of HP on the quality, storage characteristics and antioxidant activity of fermented milk were compared, to provide a reference for the development of functional fermented milk and the improvement of the utilization rate of hemp by-products. The results showed that the addition of HP could significantly shorten the coagulating time of fermented milk, improve the cohesion, elasticity, sensory quality, antioxidant activity and total viable count during storage, and reduce the adhesive property. During the storage period of 21 d at 4 ℃, HP could slow down the acidity increase of fermented milk at the later stage of storage, and the water holding capacity of groups H-4 and H-8 was significantly higher than that of the control group and H-12 group. The sensory score of the H-8 group was the highest (88.0), and the stability was good during the storage period. In conclusion, the addition of hemp meal protein hydrolysate with hydrolysis degree of 13.24% can better improve the quality and storage stability of fermented milk, and enhance the antioxidant activity of fermented milk.

Key words hemp seed meal;protein hydrolysate;fermented milk;quality;antioxidant

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.028370

引用格式:肖潇，王鹏，邵童，等.火麻仁粕蛋白水解液对发酵乳品质及抗氧化活性的影响[J].食品与发酵工业,2022,48(8):43-47.XIAO Xiao,WANG Peng,SHAO Tong, et al.Effect of hemp seed meal protein hydrolysate on the quality and antioxidant activity of fermented milk[J].Food and Fermentation Industries,2022,48(8):43-47.

第一作者：硕士研究生(陈霞教授为通信作者，E-mail:chenxia@yzu.edu.cn)

基金项目：市校合作共建科技创新平台(YZ2020265)；江苏省科技攻关计划-苏北专项(XZ-SZ202042)

收稿日期：2021-06-27，改回日期：2021-08-23