凡纳滨对虾原肌球蛋白的纯化鉴定及生物信息学分析

食物过敏是指机体进食食物后，某些蛋白刺激免疫系统产生的异常反应[1]，表现在皮肤、呼吸道和胃肠道的一些不良反应，甚至引起过敏性休克以及死亡[2]。食物过敏是世界公认的食品安全问题之一，约影响全球3.5%～4.0%的人口[3]。在亚洲，约有40%的儿童和33%的成人对虾蟹等甲壳类食物过敏[4]。甲壳类动物被联合国粮农组织认定为八大类食物过敏原之一，虾及其制品是海鲜过敏的主要原因[5]。虾中过敏原包含有原肌球蛋白(tropomyosin, TM)、肌球蛋白轻链、丙酮酸激酶、精氨酸激酶和肌钙结合蛋白等。其中，TM引起的过敏可达80%，是虾中最主要的过敏原[6-8]。

TM分子质量为32～39 kDa[9]，是由2条相同的α-螺旋链互相缠绕组成的杆状结构，具有盐溶性和热稳定性[10]。TM是肌动蛋白动力学的调节剂，在肌肉收缩中具有调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用的功能，广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物肌肉组织中[11]。目前TM纯化方法主要有等电点沉淀法、硫酸铵盐析、柱层析和高效液相色谱技术等[8,12-14]，但纯化后的TM产量小、纯度低，且所用设备昂贵，因此操作简单、耗时短、纯度高且成本低的纯化方法的研究十分重要。

本研究以凡纳滨对虾为原料，根据TM的特性，采用经丙酮去脂，热处理除杂，硫酸铵沉淀盐析，采用柱层析进一步纯化以获得高纯度TM。通过LC-MS/MS结合Western blot对TM进行鉴定，并进行生物信息学研究，分析其理化性质并预测其空间结构，以期为TM致敏性的消减研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，30尾/kg，购于广东省湛江市东风水产市场，经冰猝死后2 h内运至实验室。

考马斯亮蓝染液、10×PBS(pH 7.4、0.1 mol/L)和Tris-HCl(pH 7、0.02 mol/L)，北京酷来搏科技有限公司；DEAE FF、XK16/100层析柱，美国GE公司；预染蛋白marker，SMOBIO公司；12%预制胶、蛋白上样缓冲液、10×变性电泳液、封闭液、转膜液，上海碧云天生物技术有限公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；硫酸铵、氯化钠、蔗糖，罗恩试剂；其他试剂均为分析纯，国药集团。

1.2 仪器与设备

低温高速离心机，美国sigma公司；AKTA purifier 100型制备型蛋白质纯化系统，美国GE；紫外分光光度计，岛津(中国)有限公司；垂直电泳仪，北京六一有限公司；电转仪、化学发光系统，上海天能科技有限公司；电喷雾-组合型离子阱Orbitrap 质谱仪、毛细管高效液相色谱仪，赛默飞(上海)有限公司；涡旋仪、脱色摇床，美国Scliogex公司。

1.3 实验方法

1.3.1 TM分离纯化

TM提取液的制备参考邵虎明[8]的方法并略作修改，虾去头尾和虾线后绞碎，加入过夜预冷的丙酮(1∶4, g∶mL)，磁力搅拌4 h。样品离心15 min(4 ℃, 8 500 r/min)，弃掉上清液，取沉淀，重复上述步骤，直到虾肉无色，虾肉于通风橱中挥干即得到虾肉粉。取100 g虾肉粉按照1∶6(g∶mL)加入PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)，磁力搅拌6 h，4 ℃离心10 min，10 000 r/min，取上清液，沉淀中加入PBS重复上述步骤，合并2次上清液得到蛋白粗提液。将粗提液置于沸水浴中加热6 min，取出后离心10 min(4 ℃, 8 500 r/min)，上清液中加入350 g/L硫酸铵，离心15 min(4 ℃, 8 500 r/min)，沉淀复溶于Tris-HCl(0.02 mol/L，pH 7)中，-80 ℃保存备用。

TM纯化参考韩建勋[13]的方法，采用阴离子柱对蛋白粗提液进行分离纯化。层析柱经Tris-HCl(0.02 mol/L, pH 7)平衡后，用含有1 mol/L NaCl的Tris-HCl 线性洗脱，流速1.5 mL/min，洗脱峰溶液收集后进行SDS-PAGE实验，确定为目的蛋白后对洗脱液进行透析除盐，蛋白浓缩后于-80 ℃保存备用。

1.3.2 蛋白浓度测定与SDS-PAGE分析

以BSA标准品作为标准蛋白，96孔板中分别加入20 μL质量浓度为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mg/mL标准品和20 μL样品，加入200 μL G250染色液，595 nm下测其最大光密度值，绘制标准曲线，计算样品蛋白质含量。

将纯化的TM稀释至1 mg/mL，采用12%预制胶进行SDS-PAGE实验。Marker上样5 μL，样品上样15 μL。10 μL蛋白上样缓冲液(5×)与40 μL样品混合，沸水浴6 min。电泳条件为电压120 V，电流40 mA。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，采用脱色液进行脱色处理，至蛋白质条带清晰结束。

1.3.3.1 胰蛋白酶(trypsin)酶解

将目的条带切成1 mm×1 mm×1 mm胶粒，加入50% 乙腈50% mmol/L NH4HCO3进行脱色，加入10 μL质量浓度为15 ng/mL胰蛋白酶，4 ℃冰箱孵育40 min后加10 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液，37 ℃水浴酶切16 h，冷却后加入2 μL甲酸，混匀后上机分析。

1.3.3.2 质谱检测和蛋白鉴定

预柱：300 μm i.d×5 mm，Acclaim PepMap RPLC C18，5 μm，100Å，分析柱：150 μm i.d.× 150 mm，Acclaim PepMap RPLC C18，1.9 μm。流动相A为0.1%甲酸-2%乙腈，流动相B为0.1%甲酸-80%乙腈；流速：600 nL/min。采集信息数据，经过MaxQuant(1.6.2.10)数据库检索，对蛋白质进行鉴定。

1.3.3.3 Western blot分析

免疫印迹分析参照ZHANG等[15]的方法略作修改。将纯化好的蛋白调整质量浓度至100 μg/mL，按照1.3.2中进行SDS-PAGE后转移至预先活化好的PVDF膜，室温下用Western封闭液封闭，30 min后TBST洗膜5次，3 min/次。与稀释2 000倍兔抗虾TM免疫球蛋白G(immunoglobulin，IgG)抗体在4 ℃冰箱中摇晃孵育过夜，TBST洗膜5次，3 min/次。与稀释10 000倍的羊抗兔IgG抗体室温下孵育1 h，TBST洗膜5次，3 min/次。加入ECL显色，采用天能5200化学发光仪拍照并分析结果。

1.3.3.4 TM生物信息学分析

从NCBI检索得到凡纳滨对虾TM氨基酸序列(Gene ID:113820940)，采用Expasy和CamSol Intrinsic站点分析TM生物学信息、氨基酸组成、疏水性、溶解度；分别采用SOPMA、Jpred4、COR IV、Raptor X、S2D、NetSurfP-2.0预测TM二级结构；利用SWISS-MODEL站点进行三维结构同源建模，并对建模结果进行评估。

2 结果与分析

2.1 TM的分离纯化

凡纳滨对虾虾肉经丙酮去脂、PBS粗提、热处理除杂、硫酸铵沉淀、柱层析后进行SDS-PAGE，结果见图1。对虾肌肉组织成分复杂，至少含有19种蛋白质(图1-a)，相对分子质量最大可超180 kDa，大多数集中在35 kDa以上，在约36 kDa处有明显条带。经沸水浴后，大多数不耐热蛋白变性。硫酸铵沉淀富集后经柱层析，约36 kDa处有单一条带，经凝胶成像和灰度分析，纯度为98%(图1-b)。洗脱曲线出现单一洗脱峰(图1-c)，采用Western blot分析纯化后TM活性，结果显示在36 kDa处有阳性反应。

2.2 TM鉴定

SDS-PAGE确定其分子质量为36 kDa，电泳胶粒经脱色、脱水、还原烷基化、酶切后获得肽段混合物，经LC-MS/MS鉴定，利用MaxQuant(1.6.2.10)数据库检索和物种筛选，发现目的蛋白与凡纳滨对虾中TM gi:1536079568匹配分值最高，为323.31分，鉴定为TM。

2.3 TM理化特性分析

利用ExPASY网站中ProtParam站点分析TM氨基酸组成(表1)，由284个氨基酸组成，含量最多的氨基酸是谷氨酸(Glu，19%)，其次是亮氨酸(Leu，11.6%)和丙氨酸(Ala，11.3%)。氨基酸组成中不含有半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、硒半胱氨酸(Sec)和吡咯赖氨酸(Pyl)，且不含天冬氨酸衍生物和谷氨酸衍生物。其中负电荷残基数Arg和Lys共49个占比17.25%，正电荷残基数Asp和Glu共72个占比25.35%，预测TM是细胞间蛋白[16]。TM分子式为C1387H2303N411O491S8，理论等电点4.72。脂肪指数79.12、不稳定系数39.00，预测TM在较广温度范围内为稳定蛋白[16-17]。

2.4 TM蛋白溶解度和亲水性分析

采用CamSol Intrinsic和ExPASY预测TM溶解度和疏水性，结果见图2。TM溶解度综合得分3.79，分数>1的区域表示高溶解度区域，而分数<-1的为难溶性区域(图2-a)，表明TM氨基酸在所有区域都是可溶的。通过ExPASY网站ProtScale站点分析TM疏水性，68位、215位天冬酰胺(Asn)分别得分1.222(max)，-3.067(min)(图2-b)，亲水性区域占77%，表明其为亲水蛋白。

构成抗原表位的多数氨基酸都带有电荷，并有极性。可及性、可塑性、识别性、亲水性和转角是抗原表位区域的理化参数，通过分析其参数并结合已有过敏原数据库可比较结合表位。蛋白质可及性和片段可塑性是预测抗原表位的重要特征[18]。可及性反映了抗原分子的空间结构，表示氨基酸残基和溶剂分子所接触的可能性，对TM氨基酸残基采用ProtScale分析(图3),第268残基赖氨酸(Lys)可及性最高，第92残基异亮氨酸(Ile)最低，平均值为6.16，26～41、72～83、108～136、158～166、184～190、202～219、222～236、246～252及261～276为可及性区域，高于平均值水平。FU等[19]和ZHANG等[18]通过BepiPred服务器分别预测中国对虾和斑节对虾TM抗原表位也证实了高可及性有利于形成抗原表位。分子可塑性表示抗原构象中多肽骨架的可活动性，平均值为0.45，第101残基精氨酸(Arg)最高为0.494，第172残基缬氨酸(Val)最低为0.403，24～41、55～60、92～106、119～141、159～164、177～199、207～223及246～273为可塑性区域，高于平均值水平。第132残基天冬酰胺(Asn)识别性最大为91.889，第238残基精氨酸(Arg)识别性最低为80.222，平均值为85.67，大于平均值的区域为30～33、35～38、41～53、59～68、75～79、87～94、101～111、124～138、185～190、199～214、225～231、244～249、265～273及277～280。

亲水性残基位于分子表面，其最高峰成为抗原表位的可能性较大[20]，采用HPLC/retention pH 7.4分析亲水性，第68残基天冬酰胺(Asn)最大为4.4，第100残基谷氨酸(Glu)最小为-9.1，亲水性均值为-2.0，大于平均值的区域为5～15、19～22、46～51、61～79、87～95、106～117、126～133、149～152、164～173、189～207、223～235、245～249、266～275及277～280，TM空间结构高亲水性的存在是其致敏的理论依据[18]。极性最大11.244为第215残基天冬酰胺(Asn)，第68残基天冬酰胺(Asn)极性最小为7.478，平均值为9.514，大于平均值的区域为16～20、23～45、54～59、77～80、99～106、118～124、134～143、157～164、176～186、211～234及254～269。XU等[21]通过DNAStar和AntheProt Protean软件以氨基酸亲水性、可塑性等参数预测了凡纳滨对虾、大黄鱼和菲律宾蛤仔TM的抗原表位，并以高亲水性、可塑性、极性区域合成表位进行了Dot bolt和ELISA实验发现虾TM合成表位有明显的阳性反应。转角多位于蛋白分子的表面，有利于结合抗体，较大可能成为抗原表位，其最大值1.097为第279残基丝氨酸(Ser)，第168残基赖氨酸(Lys)和169残基亮氨酸(Leu)转角最小为0.7，均值为0.92，大于平均值的区域为16～21、23～39、54～60、76～83、98～108、117～125、132～143、158～164、181～190、202～207、209～220、254～256及265～280。

2.5 TM二级结构预测

将凡纳滨对虾TM(gi:1536079568)氨基酸序列导入SOPMA中分析二级结构(图4-a)，在284个氨基酸中，α螺旋氨基酸有280个，占98.59%；无规则卷曲氨基酸4个，占比1.4%。JPred4分析结果见图4-b，TM中含有大量的α-螺旋和少量无规则卷曲，不含β-折叠，与SOPMA结果一致。COR IV预测结果见图4-c，TM结构组成包括α螺旋(89.08%)、延伸链(2.11%)和无规则卷曲(8.8%)。RaptorX软件预测结果见图4-d，TM中279个氨基酸形成α-螺旋(98.23%)，5个氨基酸形成无规则卷曲(1.76%)。S2D软件预测TM中54个氨基酸形成无规则卷曲(19.01%)，230个氨基酸形成α-螺旋(80.99%)(图4-e)。NetSurfP-2.0软件预测TM中6个氨基酸为无规则卷曲(2.11%)，278个氨基酸为α-螺旋(97.89%)(图4-f)。预测结果表明TM二级结构以α-螺旋为主，可能含有β-折叠，含有少量无规则卷曲。

2.6 三级结构预测

使用SWISS-MODEL站点对TM三级结构同源建模，选取相似度达55.99%的1c1 g.2.A蛋白B链为模板构建TM三级结构，并对模型进行评估，结果见图5，其中98.05%位于拉氏图可靠区域，表明预测模型可行。

3 结论

凡纳滨对虾肌肉经过丙酮去脂、PBS粗提和热处理除杂后，采用硫酸铵沉淀结合柱层析纯化，得到了纯度为98%的TM。SDS-PAGE显示TM分子质量36 kDa，胶粒经LC-MS/MS鉴定后，肽段覆盖率可达75%。进一步采用生物信息学分析，TM为热稳定蛋白，属于亲水性蛋白。对其二级结构进行预测，发现TM以α-螺旋为主，可能含有β-折叠，含有少量无规则卷曲，其三级结构简单，无复杂的四级结构。

由于TM具有耐酸碱、耐高温的特性，常规的热处理方式无法破坏其抗原表位，达到消减致敏性的作用。目前诸多学者采用美拉德反应、酶促交联、酶水解等化学法和超声、高静压、辐照、等离子体等物理法消减TM致敏性[7,13,22-23]，虽然会一定程度上降低致敏性，但是长时间的处理会带来一些负面影响。如：化学法会引起食品风味和质构的改变并产生有害物质，而且过程无法精准控制；物理法产生的消减程度不一，且长时间的物理场对食品质地会产生一定的影响[1,24]。采用单一加工方式消减效果并不理想，采用联合方法消减过敏原致敏性正逐渐兴起，LIU等[25]采用美拉德反应结合热处理TM，与单独热处理和美拉德反应相比，其消化率有所提高且IgG/IgE结合活性降低。

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