玉竹(Polygonatum odoratum)为百合科黄精属玉竹的根茎，又名葳蕤、铃铛菜、尾参，是我国重要的药食同源大宗药材，具有滋阴润燥、生津止咳的功效。现代药理学研究表明，玉竹具有抗氧化、调节免疫力、降糖、降血压等作用[1]。玉竹含有丰富的多糖、黄酮、多酚等成分[2]，其中，多糖是其主要活性成分，在医药、食品、化妆品行业具有广阔的应用前景[3]。

低共熔溶剂(deep eutectic solvents, DESs)自ABBOTT等[4]2003年首次提出之后，由于其具有成本低、易合成、高溶解度、微毒甚至无毒等优点[5]，在生物活性成分提取领域受到广泛关注。其中，由氯化胆碱作为氢键受体(hydrogen-bond acceptor，HBA)与其他氢键供体(hydrogen-bond donor，HBD)组成的DESs在黄酮、多酚等生物活性物质的提取方面[3]研究较多。也有文献报道用于植物活性多糖的提取方面，如梁静[6]采用氯化胆碱与甘油组合DESs提取铁皮石斛多糖，提取率高达44.35%，显著高于传统提取方式。唐兰芳[7]采用氯化胆碱与1,4-丁二醇组合提取黄精多糖(Polygonatum sibiricunm polysaccharide extracted by deep eutectic solvents， DPsP)，最终提取率可达33.81%，约为热水浸提法的4倍。DESs自身的极性、黏度等对多糖提取率起决定性作用；除此之外，提取过程中的温度、时间与液料比等也对多糖的提取率有影响[8]，所以在利用DESs提取植物活性多糖时，对提取条件进行优化以获得最优提取条件至关重要。

大多数关于玉竹的研究，均是热水提取[1]，鲜有采用DESs提取玉竹多糖(Polygonatum odoratum polysaccharide extracted by deep eutectic solvents， DPoP)的研究报道。本研究采用DESs提取玉竹中的活性多糖，比较不同DESs组合，研究DESs摩尔比、DESs含水量、提取温度、提取时间、液料比等因素对多糖提取率的影响，通过响应面优化工艺参数，采用DPPH法、ABTS法、氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法对其进行抗氧化活性测定，并测定DPoP对糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)生成的抑制作用，旨在建立一种玉竹多糖的高效提取方法，并为玉竹多糖的开发利用提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉竹(品种：猪屎尾)，产自湖南郴州桂阳；葡萄糖(纯度≥99%)，上海麦克林生化科技有限公司；DPPH(纯度>97%)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；ABTS(纯度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ，纯度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；氨基胍(纯度≥98%)，美国Sigma公司；乙醇(含量≥99.7%)，成都市科隆化学品有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)、无水葡糖糖、氯化胆碱、尿素、硫酸、甲醇等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；BJ-100型高速多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司；101A-3ET电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司；SCIENTZ-18 N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL16M冷冻离心机，长沙英泰仪器有限公司；RE-2000B旋转蒸发器，巩义市予华有限责任公司；SHZ-D(I)W循环水式多用真空泵，上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV1901G/UV1901PCS紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；H-8数显恒温水浴锅，上海浦东物理光学仪器厂；VarioskanFlash多功能读数仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；IRAffinity-1傅立叶红外光谱仪，日本岛津有限公司；F-7000荧光分光光度计，日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

新鲜玉竹洗净、去须、切片，放入烘箱中，60 ℃烘干至水分含量10%以下，使用高速多功能粉碎机粉碎，过70目筛得玉竹粗粉，低温密封保存备用。

1.3.2 玉竹多糖提取

(1)热水浸提法(Polygonatum odoratum polysaccharide extracted by hot water,HW)：根据《国家药典》第三部(2015版)，称取1 g玉竹粗粉置于圆底烧瓶内，加入蒸馏水100 mL，加热回流1 h，脱脂棉过滤，重复提取2次，滤液合并浓缩置100 mL容量瓶定容，得水提多糖溶液(HWPoP)。

(2)DESs提取法：称取1 g玉竹粗粉置于三角瓶中，以一定比例加入DESs，热水浴提取，提取结束冷却后加入4倍体积无水乙醇，4 ℃醇沉12 h后离心、复溶于100 mL蒸馏水，得DESs提取多糖溶液(DPoP)[9]。

1.3.3 玉竹多糖提取率计算

葡萄糖标准曲线制备：采用苯酚-硫酸法制作标准曲线，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为y=26.337x-0.003 9，R2=0.999 5。

按照1.3.2提取操作各重复3组，采用苯酚-硫酸法比对标准曲线测定多糖含量，按照公式(1)计算多糖提取率：

提取率

(1)

式中：C，通过标准曲线计算得多糖质量浓度，mg/mL；V，样品体积，mL；N，稀释倍数；m，称取玉竹粗粉质量，g。

1.3.4 不同组合DESs对玉竹多糖提取率的影响

以多糖提取率为指标，选取酰胺(尿素)、羧酸(丁二酸、柠檬酸)和多元醇(1,4-丁二醇、乙二醇)作HBD，氯化胆碱作HBA，以摩尔比2∶1的比例配成5种不同组合的均匀稳定的DESs溶液[10]，在温度90 ℃、液料比30∶1、提取时间40 min，按照1.3.2(2)提取方法提取玉竹多糖，并计算提取率。5种DESs组合见表1。

1.3.5 单因素实验设计

从1.3.4提取结果中选择提取率最高的DESs组合，在本实验室的研究基础上选取DESs摩尔比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)、提取温度(50、60、70、80、90、100 ℃)、提取时间(20、30、40、50、60、70 min)、溶剂含水量(0%、10%、20%、30%、40%、50%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)进行单因素考察，考察各因素对提取率的影响。

1.3.6 响应面优化实验设计

在单因素考察结果上固定DESs摩尔比，对提取温度(A)、提取时间(B)、溶剂含水量(C)、液料比(D)4个单因素进行响应面优化实验，以多糖提取率作响应值进行响应面Box-Behnken(BBD)分析，确定多糖提取最优条件组合。响应面实验因素与水平设计见表2。

1.3.7 DPoP制备

参照宗鑫妍等[1]的方法，采用Sevage试剂对1.3.2制备的DPoP溶液进行脱蛋白处理，并采用考马斯亮蓝法测定处理后溶液中可溶性蛋白含量。以BSA作对照，在吸光度595 nm处，以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制可溶性蛋白标准曲线，回归方程为y=5.162 9x+0.040 5，R2=0.999 2。重复脱蛋白操作直至上层多糖溶液中可溶性蛋白含量稳定。经脱蛋白处理的DPoP溶液浓缩至一定体积后加入4倍体积无水乙醇，4 ℃冷藏6 h后离心、冻干得DPoP粉末，将其低温贮藏备用。

1.3.8 DPoP红外光谱测定

取1 mg低温烘干的DPoP粉末，加入100 mg烘干至恒重的KBr，置研钵中研磨均匀，压片，在波数4 000～400 cm-1内进行红外扫描。

1.3.9 玉竹多糖抗氧化活性测定

DPPH自由基清除能力测定参照ZHAO等[11]的方法进行；ABTS阳离子自由基清除能力测定参照CHENG等[12]的方法进行；ORAC法参照ZAR等[13]的方法进行。

1.3.10 DPoP抗糖基化能力测定

参照张家成[14]的方法稍做改动，测定多糖的抗糖基化能力，配制20 mg/mL BSA溶液、0.5 mol/L葡萄糖溶液(glucose，Glu)，按照体积比1∶1混合过无菌滤膜，取3 mL BSA-Glu混合液，分别加入样品1 mL与6.0 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液，摇匀后避光37 ℃ 恒温孵育6 d，以氨基胍代替样品做对照组，磷酸缓冲溶液代替样品做空白对照，测定AGEs在激发波长370 nm，发射波长440 nm处的荧光值，玉竹多糖对AGEs的相对抑制率按公式(2)计算：

抑制率

(2)

式中：Fc,空白组荧光值；Fs,样品组荧光值；Fs1,反应体系由缓冲溶液代替Glu样品的荧光值；Fs2,反应体系由缓冲溶液代替BSA样品的荧光值。

1.4 数据分析

所有操作均重复3次，实验数据采用“平均值±标准偏差”表示，采用SPSS 19 LSD法进行方差分析，P<0.05为差异显著，采用Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同组合DESs对多糖提取率的影响

如图1所示，多糖提取率依次是UCC>EGCC>BCC>HW>AACC>CACC，尿素与氯化胆碱组合DESs对多糖的提取率显著高于其他组合，氯化胆碱与多元醇组合DESs提取率高于HW，氯化胆碱与羧酸组合DESs则低于HW，这与汪涛等[15]在提取DPsP时结果类似，引起提取效果差异的原因可能是不同DESs之间的扩散度、溶解度、黏度、极性等理化性质不同。实验确定以尿素与氯化胆碱组合做后续优化。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 尿素与氯化胆碱摩尔比对提取率的影响

如图2所示，当尿素与氯化胆碱摩尔比开始增大时，多糖提取率呈现增长趋势，在3∶1时达到最大，超过3∶1之后，多糖提取率降低，这与尿素中的NH2基团与Cl-形成的氢键强弱对DESs的熔点与黏度造成的影响有关[16]，在摩尔比为5∶1时的提取率出现上升现象，而夏伯候等[17]在采用1,2-丙二醇与氯化胆碱组合提取夏枯草总黄酮时于摩尔比5∶1处也出现类似现象，具体原因有待进一步研究。本研究选择尿素与氯化胆碱摩尔比3∶1做后续优化。

2.2.2 提取温度对提取率的影响

如图3所示，随着温度的升高，多糖提取率不断增大，当温度超过90 ℃以后多糖提取率呈现下降的趋势，可能是高温导致的多糖降解，温度对DESs的黏度、极性和物料的溶解度都会造成影响[18]，所以选择提取温度90 ℃做后续优化。

2.2.3 提取时间对提取率的影响

如图4所示，随着提取时间延长提取率快速上升，在40 min时达到最大，提取时间超过40 min后提取率降低，在一定时间内，提取时间与活性成分溶出率成正比，超过40 min后可能出现多糖结构破坏降解，导致提取率降低，而在60 min时较50 min时的提取率略有升高，但不具有显著性(P>0.05)，可能是多糖继续溶出与结构破坏共同作用的结果。本研究选择提取时间40 min做后续优化。

2.2.4 DESs含水量对提取率的影响

如图5所示，当DESs水分含量在0%～20%时，提取率随含水量增大而增大，在20%时达到最大，当含水量超过20%，提取率开始下降。含水量在30%～40%出现上升趋势，然而有趣的是宋歆睿[19]在采用低共熔溶剂提取蒲公英主要活性成分时，目标物的提取率在含水量为40%时较含水量30%时也有所上升，这可能是由于未结合的水降低了DESs的黏度与表面张力，提取率出现上升现象，而含水量继续增加导致分子间作用力降低，提取率迅速下降[20]。本研究选择DESs含水量20%做后续优化。

2.2.5 液料比对提取率的影响

如图6所示，液料比在10∶1至30∶1时，溶剂量的增加，使得物料细胞与外界溶剂之间造成浓度差，浓度差增加更易使得植物细胞破碎，多糖提取率呈上升趋势，而当液料比超过30∶1时，过多的DESs可能使得物料之间相互作用减弱，不利于多糖提取，所以选择提取液料比30∶1做后续优化。

2.3 响应面试验结果分析

根据2.2结果分析，固定尿素与氯化胆碱摩尔比为3∶1，选取提取时间、提取温度、DESs含水量与液料比作为单因素，选取多糖提取率为响应值，进行响应面优化实验，Box-Behnken实验设计与结果见表3。

2.3.1 回归方程模型与方差分析

采用Design-Expert 8.0对数据进行回归拟合分析，二次方程模型为Y=29.69+0.76A+0.46B-0.35C-0.36D-0.14AB-0.58AC+0.54AD+0.14BC-0.29BD+1.02CD-2.20A2-2.30B2-3.09C2-3.07D2。

根据表4结果分析，回归模型总回归系数R2=0.973 4，且模型P<0.01，实验模型达到极显著水平，模型方差失拟项P=0.492 6>0.05，说明该模型拟合度良好，可用于预测4种因素不同组合情况下多糖的提取率，模型变量A、B、CD、A2、B2、C2、D2均达极显著水平(P<0.000 1)，单因素变量C、D及相交变量AC均达显著水平(P<0.05)，各单因素在取值范围内，对玉竹多糖提取率影响大小顺序为：提取温度(A)>提取时间(B)>液料比(D)>溶剂含水量(C)。

2.3.2 响应面分析

通过Design-ExPert8.0对数据进行拟合得到响应面图，响应面的三维图与等高线图可以看出2个变量之间的相互作用，如图7-a所示，随着提取温度与含水量的增加，提取率呈现先增大后减小的趋势，等高线图密集且呈椭圆形，表明两变量相交对提取率影响极显著，如图7-b所示，随着含水量与液料比的增大，提取率呈现先增大后减小的趋势，等高线图呈椭圆形，证明两变量相交对提取率影响显著，如图7-c所示，随着提取温度与液料比的增大，提取率也呈现先增后减的趋势，三维图呈凸面，等高线图椭圆形，但相比图7-a，等高线较为稀疏，证明两变量相交对提取率有一定影响，这与方差分析结果一致。

2.3.3 回归模型验证实验

通过响应面优化分析，得到DESs提取玉竹多糖预测最优工艺条件为：提取温度91.73 ℃、提取时间40.97 min、溶剂含水量19.2%，液料比29.38∶1，预测多糖提取率为29.80%，为验证回归模型可信性，采取上述最佳操作条件进行提取实验，考虑到实际操作与仪器限制，将最终选取提取条件设为：摩尔比3∶1、提取温度92 ℃、提取时间41 min、溶剂含水量19%，液料比29∶1，在此优化条件下，多糖提取率为(29.03±0.54)%，与预测值接近，表明该实验回归模型可靠，能较为准确的预测玉竹多糖提取率。多糖提取率为热水浸提法(6.21±0.05)%的4.67倍。

2.4 玉竹多糖红外光谱测定结果分析

如图8所示，在3 000～3 500 cm-1处有明显宽峰，为O—H键伸缩振动产生，3 398.57 cm-1附近出现宽峰为O—H伸缩振动峰，2 937.59、2 881.65 cm-1附近出现强尖峰为C—H键伸缩振动峰，均为多糖特征吸收峰，2 362.80、2 333.87 cm-1附近的峰可能是羧酸之间的氢键缔合产生的O—H振动峰，1 741.72 cm-1附近的峰为乙酰基特征吸收信号，1 662.24、1 627.92 cm-1附近出现的峰为CO的伸缩振动峰，1 454.33、1 249.87 cm-1附近的峰为糖环上C—H的振动吸收峰[21]，1 130.29～1 022.27 cm-1出现的峰则为吡喃糖特征吸收峰，且1 100～1 010 cm-1之间仅有2个吸收峰，则为呋喃糖苷，948.98、813.96 cm-1附近的弱吸收峰证明玉竹多糖存在β-吡喃糖苷键与α-吡喃糖苷键[22]。

2.5 DPoP对DPPH自由基清除能力

自由基由在人体内积累会引发某些慢性疾病，如动脉粥样硬化、神经病变、慢性抑郁症、癌症等。天然抗氧化剂能清除自由基且具有安全、健康等优点，受到人们广泛关注[23]，如图9所示，在测定质量浓度为2～20 mg/mL时，清除率随样品质量浓度的增大而增大，当质量浓度达到20 mg/mL时，清除率达到了(17.97±0.47)%，表明DPoP对DPPH自由基有一定的清除能力。经拟合，DPoP曲线方程为y=0.02x2+1.33x-1.98，R2=0.994，IC50=31.03 mg/mL。

2.6 DPoP对ABTS阳离子自由基清除能力

ABTS阳离子自由基为稳定的有机自由基，在氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS阳离子，当抗氧化物存在时，ABTS的产生会被抑制。如图10所示，结果表明DPoP对ABTS阳离子自由基有一定的清除作用，且在测定浓度范围内DPoP对ABTS阳离子自由基的清除效果具有浓度依赖性，当质量浓度达到20 mg/mL时，清除率达到了(40.69±0.34)%，经拟合，DPoP曲线方程为y=0.01x3-0.34x2+5.22x+0.38，R2=0.998，IC50=23.25 mg/mL。综合图9和图10，DPoP虽然具有一定的清除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的能力，但其清除作用均显著低于阳性对照维生素C，这可能是由于多糖的抗氧化机制与维生素C不同所致。多糖在体内是通过调节抗氧化酶的活性，利用抗氧化酶的还原作用将氧化物还原为低毒或无害的物质，从而达到清除自由基作用[24]，玉竹多糖抗氧化机理有待进一步深入研究。

2.7 DPoP的ORAC值

ORAC值最接近真实的生理环境氧化过程，具有可操作性强、灵敏度高等优势而被广泛应用于食品功能性成分抗氧化测定方面[10]。以水溶性维生素E为对照组，经计算得玉竹多糖的ORAC值为(121.67±3.65) μmol/g，DPoP在ORAC法中表现出较强的抗氧化能力。唐兰芳[7]测定低共熔溶剂提取DPsP的ORAC值也达到(130.53±8.29) μmol/g，与DPoP的ORAC值相近；唐仕荣等[25]通过超声辅助提取枸杞多糖，测得枸杞多糖的ORAC值为78.34 μmol/g，显著低于DPoP的ORAC值。图11为对照组标准曲线。

2.8 DPoP抗糖基化能力

AGEs是糖基化反应的终末端产生的对人体有害物质，与糖尿病、心脏病、肾衰竭和老年痴呆等许多疾病的发展有关[16]。如图12所示，DPoP对BSA-Glu体系中糖基化终末产物AGEs的抑制作用仅稍低于氨基胍，表现出很强的抗糖基化能力。在测定范围内，DPoP对AGEs相对抑制率呈线性增长，当DPoP质量浓度达到2.0 mg/mL时，抑制率达到(87.63±0.66)%，展示出良好的抑制效果，作为从食物资源中提取的天然成分，DPoP必将具备很好的应用前景。

3 结论

DESs提取玉竹中的活性多糖较热水有更强的溶出能力，工艺确定以尿素-氯化胆碱体系作溶剂，采取响应面优化设计，得到最优提取条件：在尿素-氯化胆碱摩尔比为3∶1，提取温度92 ℃、提取时间41 min、DESs含水量19%，液料比29∶1的条件下，玉竹多糖最终提取率可达(29.03±0.54)%，为热水浸提法的4.67倍。

通过红外光谱分析确定DPoP性质与糖苷键类型，DPoP为酸性多糖，存在β-吡喃糖苷键与α-吡喃糖苷键。DPoP抗氧化测定结果均表明,DPoP具有抗氧化能力，DPoP对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力随多糖质量浓度增大而增大，在质量浓度为20 mg/mL时，清除率分别达到(17.97±0.47)%、(40.69±0.34)%，ORAC值达到(121.67±3.65)μmol/g；糖基化终末端产物AGEs在体内积累是引发糖尿病的直接因素，抗糖基化结果表明，DPoP对AGEs的生成具有良好的抑制效果，当DPoP质量浓度达到2.0 mg/mL时，抑制率可达到(87.63±0.66)%，DPoP在新型降糖保健食品的开发方面有较大的应用潜力，有望进一步研究体内抗糖作用与机制以及进行相关功能性食品开发。

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Optimization of extraction process of Polygonatum odoratum polysaccharide by deep eutectic solvent and its antioxidant and anti glycosylation activities

HE Ruiyang1,2,WANG Feng1,2*,SU Xiaojun1,LI Qingming1,2, YANG Hua3,ZHU Xiaohui1,2,FAN Kuanxiu1,JIANG Xuemei1,2

1(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)2(Hunan Provincial Research Center of Engineering and Technology for Fermented Food, Changsha 410128, China)3(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

ABSTRACT In order to improve the extraction rate of Polygonatum odoratum polysaccharide, the extraction process of Polygonatum odoratum polysaccharide with deep eutectic solvents was optimized by response surface methodology. The antioxidant activity of Polygonatum odoratum polysaccharide extracted by deep eutectic solvents (DPoP) was evaluated by DPPH radical scavenging rate, ABTS cationic radical scavenging rate and ORAC methods, and the inhibitory ability of DPoP on the formation of advanced glycation end products (AGES) in non-enzymatic glycation system in vitro was determined by fluorescence spectrophotometry. The results showed that DESs extraction method was an efficient method for extracting Polygonatum odoratum polysaccharide. Urea-choline chloride was the best combination of DESs in the test scheme, and the optimum process parameters for Polygonatum odoratum polysaccharide extracted by DESs were as follows: The urea-choline chloride molar ratio was 3∶1 with extraction temperature at 92 ℃ for 41 min; water content was 19% and liquid-material ratio was 29∶1. Under this condition, the extraction rate of Polygonatum odoratum polysaccharide reached (29.03±0.54)%, which was 4.67 times higher than that extracted by the traditional hot water. The scavenging rates of DPPH radical and ABTS cationic radical by DPoP increased with the increase of mass concentration. When the mass concentration was 20 mg/mL, the scavenging rates reached (17.97±0.47)%, (40.69±0.34)% respectively, and ORAC value reached (121.67±3.65) μmol/g. This study not only provides theoretical guidance for the development and utilization of Polygonatum odoratum polysaccharide, but also has certain significance in the extraction of plant active components.

Key words Polygonatum odoratum polysaccharide; process optimization; deep eutectic solvents; antioxidant; anti glycosylation

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029541

引用格式:何瑞阳，王锋，苏小军，等.玉竹多糖低共熔溶剂提取工艺优化及其抗氧化和抗糖基化活性研究[J].食品与发酵工业,2022,48(8):190-198.HE Ruiyang,WANG Feng,SU Xiaojun, et al.Optimization of extraction process of Polygonatum odoratum polysaccharide by deep eutectic solvent and its antioxidant and anti glycosylation activities[J].Food and Fermentation Industries,2022,48(8):190-198.

第一作者：硕士研究生(王锋副教授为通信作者，E-mail：wangfeng@hunau.edu.cn)

基金项目：湖南省科技计划项目(2016NK2113)；湖南教育厅重点项目(20A240)

收稿日期：2021-09-27，改回日期：2021-12-14