利用环介导等温扩增技术快速检测金枪鱼制品中的鲣鱼成分

金枪鱼族是属于硬骨鱼纲鲈形目鲭科的鱼类，包含细鲣属(Allothunnus)、舵鲣属(Auxis)、巴鲣属(Euthynnus)、鲣属(Katsuwonus)、金枪鱼属(Thunnus)等5属15种金枪鱼[1]。鲣鱼(Katsuwonus pelamis)是鲣属中唯一品种，在金枪鱼渔业中有着举足轻重的地位。2018年，鲣鱼捕捞量为316万 t，占金枪鱼捕捞总量的56%以上[2]。

金枪鱼肉质鲜美，具有高蛋白、低脂肪等特点，并且富含丰富的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)与二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等不饱和脂肪酸，是最受消费者欢迎的鲭科鱼类品种之一。然而，金枪鱼较少以鲜活的形式进行出售，通常被加工成生鱼片、罐头、肉松等制品。由于加工破坏了其外形特征，传统的形态特征鉴别法已经不能满足金枪鱼的物种鉴别。在这种情况下，一些不法商贩为牟取暴利，在金枪鱼及其制品的贸易过程中掺假、造假，以次充好的现象时有发生。安丽艳等[3]采用PCR测序技术鉴定金枪鱼罐头中金枪鱼品种，在17个市售样品中，发现58.8%来源于价格低廉的鲣鱼。SOTELO等[4]对6个欧洲国家的545份金枪鱼(新鲜、冷冻和罐头产品)进行调查，发现总体标签错误率为6.79%，新鲜和冷冻产品为6.70%，罐头产品为7.84%。金枪鱼市场鱼目混杂，标示不清，水产品的掺假行为在媒体中频频曝光，引起了消费者的恐慌。因此，为了保护消费者经济利益、维护消费者的合法权益，急需一种灵敏、特异、快速的金枪鱼及其制品的鉴定方法。

基于DNA的检测技术具有灵敏度高、特异性好等优点，已经被广泛运用于水产品检测[5-7]。目前，已经报道的鉴定方法有DNA条形码法[8]、核苷酸测序法[3]、实时荧光定量PCR法[9]、PCR限制性片段长度多态性法[10-11]、多重PCR琼脂糖电泳法[12]。其中，多重PCR琼脂糖电泳法灵敏度较低，近物种鉴定易出现假阳性；DNA条形码法需要测序，鉴定周期长。此外，DNA条形码法还存在依赖参考的数据库建设不够完善、核内DNA条形码和混合物种样品单一条形码获取困难等不确定因素。但至今为止，采用环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测金枪鱼的研究报道比较少见。

LAMP技术是NOTOMI等[13]于2000年提出的一种核酸扩增技术，该技术依赖Bst DNA聚合酶在恒温条件下实现靶基因的自循环链置换合成反应，引物能识别基因的6个或8个独立区域，特异性较PCR大大提高。另外，反应的温度处于恒温条件(60～65 ℃)，普通水浴锅就可以满足扩增的需求，节省了检测费用。检测结果可以通过可视化判别，在扩增产物中加入荧光染料SYBR Green I，产物结合染料后发出绿色荧光。目前已有LAMP技术应用于食源性致病菌、转基因成分、过敏源成分[14-15]、动物源成分[19-20]等检测方面的研究。本研究以鲣鱼的线粒体Cyt b基因为靶基因，设计LAMP反应特异性引物，构建LAMP反应体系，建立一种鲣鱼的特异性快速检测技术，为金枪鱼制品的掺假鉴伪提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品的采集

22种水产品标准品来自本课题组前期研究，包括Katsuwonus pelamis(MK843764)、Thunnus obesus(MN893173)、T.albocaves(MN893174)、T.alalunga(MN893175)、Scomber niphonius(MN879568)、Scomber spp(MK843721)、Scomber scombrus(MN893176)、Oyprinus carpio(MK843655)、Colla ectenes(MK84666)、Larimichrhy scrocea(MK843674)、Lateolabrax japonicus(MK843686)、Odontobutis potamophila(MK843730)、Patagonotothen ramsayt(MK843753)、Alabtrosstd pecoralls(MK843767)、Pangashus hypophthalms(MK843766)、Micropterus salmoides(MK843768)、Clenopharyngodon idella(MK843773)、Lophius Hitulon(MN850429)、Oncorhymnchus mykiss(MN850431)、Carassius auratus(MK843660)、Mugil cephalus(MN893207)、S.salar(MN850430)。22种样品均进行形态学鉴定和DNA条形码鉴定，且标准品的DNA条形码序列已提交至GenBank，并获得登录号(已备注在对应物种的括号内)。

此外，2019年11月～12月，从市场共采集39份预包装金枪鱼产品(表1)，包括19份肉松产品(编号为XWJ1-XWJ19)和20份罐装制品(编号为XWJ20-XWJ39)。所有产品抵达实验室后需进行拍照和标记，并记录好产品标签上的信息。当产品包装内有多个独立小包装时，每个小包装需单独取样，共计取样59份(表1)，样品于-18 ℃保存备用。

DP304细胞/血液/组织基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；6×Loading Buffer、dNTP Mix，宝生物工程(大连)有限公司；等温扩增混合液、2×Taq PCR Master Mix、引物合成，上海生工生物工程股份有限公司；Bst DNA聚合酶大片段、MgSO4溶液、10×ThermoPol缓冲液，美国New England Biolabs公司；SYBR Green I染料(10 000×)，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BioPhotometer D30核酸蛋白测定仪，德国艾本德股份有限公司；1-14k台式小型离心机，德国Sigma公司；MS-100恒温混匀仪，杭州奥盛仪器有限公司；Gentier 96全自动医用PCR分析系统，西安天隆科技有限公司。

1.3 实验方法

按照DNA提取试剂盒说明书对市售样品的DNA进行提取，取50 mg样品于1.5 mL离心管中，先加入200 μL Buffer GA，涡旋振荡15 s；再加20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)溶液，涡旋混匀后将其置于恒温混匀器中1 500 r/min 56 ℃加热45 min。最后，加入200 μL Buffer GB，充分颠倒混匀后置于恒温混匀器中1 500 r/min 70 ℃加热10 min。将所得混合物转移至吸附柱CB3中，依次加入500 μL Buffer GD和600 μL漂洗液PW，混匀后均以12 000 r/min离心30 s，最后，向吸附膜的中间悬空滴加100 μL洗脱液TE。

DNA的质量检测：采用BioPhotometer D30核酸蛋白测定仪分别测定DNA在230、260和280 nm的吸光值，计算A260/A280和A260/A230值，同时测定DNA浓度。对符合纯度要求的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性，纯度和完整性均符合要求的DNA置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 引物的设计

从GeneBank数据库下载鲣鱼(JN086155、KJ617258、EF392591、EF439208、DQ080321)的基因序列信息。并使用BioEdit软件进行序列比对，筛选出种间差异比较大的Cyt b序列作为检测基因，此外，下载非目标物种，长鳍金枪鱼(AB101291)、黄鳍金枪鱼(JN086153)、马苏金枪鱼(KF925362)、大眼金枪鱼(GU256525)、蓝鳍金枪鱼(KF906720)等的Cyt b基因序列，确保鲣鱼和非目标物种之间的错配，以保证引物的特异性。根据LAMP引物设计原则，利用在线PrimerExplorerV4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计LAMP引物，包括外引物(F3、B3)、内引物(FIP、BIP)，引物则委托上海生工生物有限公司合成，序列见表2。

1.3.3 LAMP 反应体系建立及条件优化

LAMP反应体系25 μL，含1.4 mmol/L dNTP Mix、1 μL Bst DNA 聚合酶、6 mmol/L MgSO4、2.5 μL 10×ThermoPol缓冲液、1 μL 5×SYBR Green Ⅰ、上游外引物(F3)0.2 μmol/L、下游外引物(B3)0.2 μmol/L、上游内引物(FIP)1.6 μmol/L、下游内引物(BIP)1.6 μmol/L、模板DNA 1 μL，剩下用无菌水补足至25 μL。采用恒温实时荧光法检测，将混合物置于65 ℃恒温反应60 min，最后在80 ℃下10 min结束反应。也可通过向LAMP产物中加入1 μL稀释倍数为100的 SYBR Green I染料肉眼观察扩增情况，在紫外灯下，颜色变绿表明发生了扩增，橙色表明未发生扩增。

对该LAMP反应体系中的Mg2+浓度、外引物、内引物、dNTP Mix、10×ThermoPol缓冲液等因素进行优化，确定最终的最优反应体系。

采用DNA条形码通用引物(表2)扩增市售DNA样品，采用25 μL的PCR体系，其中2×Taq PCR Master Mix体系预混液12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，加无菌水补足至25 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min；95 ℃ 变性30 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，以2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3.5 市售样品检测

利用试验建立的LAMP方法进行市售样品的检测，并与DNA条形码检测所得数据进行对比，验证其方法的准确性。

2 结果与分析

2.1 LAMP试验条件优化结果

2.1.1 内外引物浓度比的优化

选取外引物与内引物浓度比梯度依次为1∶4、1∶6、1∶8、和1∶10分别进行LAMP反应，观察阳性反应出现的快慢，从而确认引物浓度比对扩增反应的影响，以此结果确定最佳引物浓度比。由图1可知，试验选用1∶8引物浓度比扩增效果较好。

2.1.2 Mg2+浓度的优化

在最佳的引物浓度比的反应体系下，选择优化Mg2+浓度，Mg2+是较为重要的试剂之一，能影响Bst DNA聚合酶的活性，反应过程中起到降低反应所需要的活化能的作用。选取Mg2+浓度梯度依次为0、2、4和6 mmol/L分别进行LAMP反应。由图2可知，在检测浓度范围内随Mg2+浓度的升高，促进了反应的进行，当达到6 mmol/L浓度时，最利于反应的进行。

2.1.3 dNTP Mix浓度的优化

dNTP是LAMP扩增反应的原料，dNTP Mix浓度分别为1.0、1.2、1.4和1.6 mmol/L进行扩增反应。由图3可知，当dNTP Mix浓度为1.6 mmol/L为最适浓度。

2.1.4 10×ThermoPol缓冲液浓度的优化

10×ThermoPol缓冲液体系添加量梯度为0.5、1.5、2.5和3.5 μL，其他条件下相同。由图4可以看出，在检测浓度范围内随浓度的升高，促进了反应的进行。当添加量为3.5 μL时，最利于反应的进行。

2.2 特异性试验结果

以鲣鱼和其他22个非目标物种的DNA为模板，进行LAMP扩增，验证引物的特异性。扩增产物采用实时荧光法进行检测。如图5所示，空白对照和对照样品均未发生扩增，以鲣鱼DNA为模板的试验组出现扩增，表明该体系具有良好的特异性。

2.3 灵敏度试验分析

将鲣鱼的基因组DNA进行倍比稀释，质量浓度设定为50、5、0.5、0.05 ng/μL。作为反应模板进行扩增，确定方法的灵敏度。如图6所示，该试验所建立的LAMP体系的灵敏度为0.05 ng/μL。

2.4 市售样品检测结果

为了评价所建立LAMP方法的适用性和可行性，本研究采集了59份市售样品进行了鉴定(图7、图8)。检测结果通过扩增曲线和可视化2种方式进行判别，观察反应产物在紫外灯下是否有荧光产生。结果显示，肉松制品鉴定结果不含目标成分，罐头制品中6个样本鉴定结果为鲣鱼，其余样本均为非目标物种。由此可得，LAMP鉴定结果与DNA条形码鉴定结果一致。

2.5 讨论

在物种属性鉴别领域，DNA条形码技术是一种较为成熟的分子检测技术。其理论依据是使用一段标准DNA片段，通过测序获得样品的线粒体序列，达到物种鉴定的目的。但是对于深加工制品，由于含有多种混合DNA，而检测用引物是通用引物，存在极大的漏检可能性。

LAMP技术目前在鱼类物种鉴定中已广泛使用，而建立高效快速的LAMP体系的基础是特异性引物的设计。常用于鱼类物种鉴定中的目的基因有COⅠ基因、16S rRNA基因、Cyt b基因和12S rRNA基因。通过大量序列进行比对，根据相互间的遗传距离，证实了Cyt b基因作为目的基因的可行性。

传统的LAMP法仍存在一些不足。浊度法检测需要积累大量的扩增子，当低拷贝的模板存在时焦磷酸镁沉淀产生较少，肉眼判断困难；钙黄绿素法引入的Mn2+增加了Bst聚合酶错配的机率，且钙黄绿素的荧光背景降低了检测的灵敏度；可视化LAMP荧光染料SYBR GreenⅠ在水溶液中本身不发光，DNA存在时荧光显著增强。该方法直接通过可视化比色判定检测结果，具有快速、直观、低成本等优点。

3 结论

本研究建立了基于Cyt b基因的鲣鱼LAMP检测方法，建立的方法具有特异性强、快速的优点。在基因组DNA水平为0.05 ng/μL时，即可检出。同时将LAMP扩增技术与荧光染料相结合，即添加指示剂实现可视化检测结果。与DNA条形码鉴定方法相比，该方法不需要复杂的热循环控温仪器，同时也提高了检测效率降低了检测成本，适用于大规模样品的初筛，为监管机构快速检测金枪鱼制品的物种提供技术支持。

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